DAFTAR LAMPIRAN
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat
Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA). Institut Pertanian Bogor (IPB) dari bulan Agustus 2008 – April 2009.
Bahan dan Alat Kultur
Isolat bakteri yang diisolasi dari saluran pencernaan (duodenum, ileumdan
intestinum crasum) ayam broiler strain hybro tanpa diberi antibiotik. Bakteri patogen yang digunakan untuk uji antagonis adalah Escheria coli asal ayam, Salmonelasubsp.2 asal ayam yang diperoleh dari Laboratorium Bakteriologi FKH, dan EPHEC K1-1 koleksi Dr. dr. Sri Budiarti , Salmonela enteric koleksi dari Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, IPB Bogor.
Bahan Kimia
Bahan kimia yang digunakan adalah bahan untuk menumbuhkan mikroorganisme meliputi nutrient broth(NB) dengan komposisi 8 g/l,trypticase soy broth (TSB) dengan komposisi 30 g/l, De Man Ragosa sharpe (MRS) dan
tripton glucosa yeast ekstract (TGY). Media padat yaitunutrient agar(NA) dan
trypticase soy agar (TSA) dengan menambahkan 15g/l bacto agar, dan untuk media NA dan TSA semi solid ditambahkan 10 g/l bacto agar. Media MRS dan TGY modifikasi yang mengandung molase, dan tepung kedelai (Lampiran 3). Reagen untuk pewarnaan Gram yang meliputi kristal violet, garam yodium, alkohol asseton, dan safranin gram, reagen pewarnaan spora terdiri dari malakit hijau, safranin spora, aquades steril dan NaCl 0.85% (Lampiran 4).
Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat-alat gelas, laminar air flow (LAF), inkubator, shaker, spektrofotometer, mikroskop, hemasitometer, autoklaf, inkubator, penangas air bergoyang, timbangan analitis, refrigerator, homogeniser, vortex, kuvet, pipet mikro, tip bunsen, ose, sentrifus, pH meter, hot plate, pengaduk magnetik dan timbangan.
Metode
Penelitian ini meliputi isolasi kultur bakteri asal saluran pencernaan ayam, pengujian aktivitas antagonis, identifikasi terhadap bakteri yang terpilih serta optimasi aktivitas senyawa bioaktif dari bakteri terpilih terhadap pertumbuhan bakteri patogen pada kondisi media, aerasi, pH dan suhu tertentu, serta uji kualitatif amilolitik, proteolitik, lipolitik dan selulolitik.
Isolasi Bakteri Saluran Pencernaan Ayam
Isolasi bakteri asal saluran pencernaan ayam broiler strainhybrotanpa diberi antibiotik dilakukan menurut metode F.Tomota (Lumyong et al. 2001 dalam (Simarmata 2007). Saluran pencernaan ayam dicuci bersih, kemudian dilakukan sterilisasi permukaan dengan cara merendam dalam etanol 70% selama 1 menit, natrium hipoklorit 5,3% selama 5 menit, kembali dengan etanol 70% selama 30 detik, kemudian saluran pencernaan dibilas dengan air steril beberap kali. Isolasi dilakukan dengan mengambil saluran pencernaan pada bagian duodenum, ileum, danintestinum crassumseberat 1 gr dan dilarutkan dalam larutan pepton 1 % yang mengandung 0.1% agar agar sebanyak 9ml. Larutan di vortex supaya homogen. Kemudian dilakukan pengenceran berseri dari 10-1- 10-6 dengan aquades 9 ml yang mengandung NaCl 0.85%.. Pada pengenceran 10-3hingga10-6diambil 100µ1 larutan dan disebar kecawan petri yang berisi media NA dengan pH 7.0 dan media NA dengan pH 4.5, dengan menambahkan asam klorida 10%, dilakukan secara duplo. Diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. Pertumbuhan koloni diamati secara periodik.
Pemurnian Bakteri Hasil Isolasi
Koloni koloni yang tumbuh terpisah diambil dengan ose secara aseptis dan dilakukan pemurnian dengan menggunakan metode kwadran. Metode ini akan memisahkan sel dari koloni hingga jarak tertentu kemudian koloni yang benar banar murni dapat diambil dan diletakkan pada agar miring. Kemudian mikrob yang didapat dipindahkan atau ditransfer secara aseptis ke media nutrient broth (NB) disebut subculturingatau peremajaan. Teknik ini sangat penting dan secara rutin digunakan untuk membuat atau menyiapkan kultur stok yang diperlukan dalam uji mikrobiologi.
24
Peremajaan Bakteri Target
EPEC K1-1 diremajakan pada media NA + 100μg/ml ampisilin diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C. Satu koloni tunggal EPEC K1-1 dari media NA+ampisilin diinokulasikan ke dalam media NB+100 μg/ml ampisilin. Biakan ditumbuhkan pada suhu 370C dengan agitasi 100 rpm selama kurang lebih 2 jam.
E. coli diremajakan pada media NA dan ditumbuhkan selama 24 jam pada suhu 370C. Satu koloni tunggal E. coli diinokulasikan ke dalam media NB, diinkubasi pada suhu 370C dengan agitasi 100 rpm selama 24 jam. Salmonella enteric dan
Salmonella subsp.2 asal ayam diremajakan pada media TSA selama 24 jam pada suhu 370C. Satu koloni tunggal Salmonella enteric dan Salmonella subsp.2 asal ayam pada media TSA diinokulasikan ke dalam media TSB. Sel ditumbuhkan pada suhu 370C dengan agitasi 100 rpm selama 24 jam. Bakteri bakteri target ini untuk uji antagonis.
Uji antagonis langsung bakteri asal saluran pencernaan ayam terhadap
EPEC K1-1, Salmonella enteric dan E. coli asal ayam serta Salmonella
subsp.2 asal ayam.
Isolat diuji aktivitas penghambatannya terhadap EPEC K1-1, E. coli, Salmonelasubsp.2, Salmonella entericdengan menggunakan metode agar double layer (Lisboa et al. 2006). Bakteri target yang sudah diremajakan diinokulasikan sebanyak 100μl ke dalam 10ml media NA/TSA 50% dengan konsentrasi minimal 106 sel/ ml. Media tersebut dituangkan pada NA/TSA 100% padat (cawan
overlay). Setelah media memadat, isolat terpilih diinokulasikan dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C. Pengamatan dilakukan terhadap koloni bakteri yang mampu membentuk zona bening. Isolat isolat yang mampu membentuk zona bening akan diidentifikasi.
Identifikasi / Karakterisasi Isolat Bakteri
Penentuan karakteristik morfologi bakteri asal saluran pencernaan ayam secara mikroskopis dilakukan dengan pengamatan sel dan pewarnaan Gram (Hadioetomo 1993). Bakteri yang merupakan Gram positif kemudian dilakukan kemampuan pembentukan spora dengan pewarnaanmalachite green dan safranin (Hadioetomo1993). Secara morfologis, biakan maupun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa. Karena itu diperlukan uji uji fisiologis seperti uji katalase.
Dan untuk identifikasinya mengacu pada Bergeys Manual of Determinative Bacteriology (Krig dan Holt.1984).
Esei Antagonis Isolat Terpilih Terhadap Pertumbuhan E. coli, Salmonella
subsp.2, EPEC K1-1,Salmonella enteric dengan Metode Kirby-Bauer
Uji antagonis isolat terpilih dilakukan terhadap bakteri EPEC K1-1, E. coli, Salmonela subsp.2, Salmonella enteric dengan menggunakan filtrat kultur. Pengujian dilakukan untuk mengetahui aktivitas filtrat kultur isolat terpilih terhadap bakteri target. Media NA semi padat berisi 100μl biakan bakteri patogen (E. coli, Salmonela sp., Salmonella enteric, EPEC K1-1.) dengan konsentrasi minimal 106sel/ml dituangkan ke dalam media NA padat (cawanoverlay). Setelah seluruh media memadat, kertas cakram berdiameter delapan mili meter diletakkan diatas media dengan sedikit ditekan dan pada masing masing kertas cakram ditetesi sebanyak 15μl filtrat kultur dari isolat bakteri terpilih. Inkubasi dilakukan selama 24 jam pada suhu 370C. Parameter yang diamati adalah kemampuannya membentuk zona bening. Besarnya diameter zona bening yang dihasilkan berdasarkan diameter seluruh zona yang terbentuk dikurangi dengan diameter cakram kertas.
Optimasi Produksi Senyawa Bioaktif
Optimasi pertama dilakukan terhadap media, aerasi dan waktu produksi Isolat terpilih diremajakan pada media pertumbuhan. Kultur isolat terpilih diinokulasikan dalam media produksi. Optimasi dilakukan terhadap dua media yaitu De Man Ragosa(MRS) dan Tripton Glucosa Yeast ekstratc (TGY) dengan agitasi (100 rpm) dan tanpa agitasi. Media yang didapat dioptimasi waktu produksi yang terbaik dengan waktu produksi 24 jam, 48 jam, 72 jam, dan 96 jam. Media terbaik yang didapat dimodifikasi dengan mengganti sumber karbon dan nitrogen dengan molase dan soybean meal (MRS modifikasi dan TGY modifikasi).
Optimasi kedua yaitu optimasi terhadap suhu, yang bertujuan untuk mengetahui suhu optimum terhadap aktivitas antibakteri dalam menghasilkan penghambatan pertumbuhan bakteri target. Filtrat kultur dari isolat yang diisolasikan pada media produksi modifikasi diinkubasi pada lima tingkatan suhu (270,300, 370, 400, 500C), diujikan aktivitasnya terhadap E. coli, Salmonella
26
A=Ø zona bening dan B= Ø isolat.
Optimasi ketiga terhadap pH. Pengujian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh media, suhu dan pH optimum terhadap aktifitas antimbakteri dalam menghasilkan penghambatan pertumbuhan empat bakteri patogen. Pada tahap ini isolat terpilih ditumbuhkan pada media terbaik pada tujuh tingkatan pH yang berbeda yaitu 3.0 ,4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, diinkubasi pada suhu terbaik (optimum). Filtrat kultur (supernatan) dari isolat yang ditumbuhkan pada pH yang berbeda, diantagoniskan dengan empat bakteri target, diukur zona bening yang dihasilkan.
Uji Kualitatif Aktivitas Amilase, Protease, Lipase, Selulase
Kemampuan amilolitik, proteolitik, lipolitik dan selulolitik isolat terpilih diuji secara kualitatif. Untuk uji amilase media nutrient agar ditambah 1% soluble starch, setelah itu isolat terpilih (7n, 25n, 27n, 34n) diinokulasikan, diinkubasi selama dua hari. Zona bening akan terlihat setelah ditetesikalium iodida(KI) 3%. Adanya zona menunjukkan adanya aktivitas amilase. Zona yang terdapat disekitar koloni diukur diameternya begitu juga diameter koloni untuk menghitung indeks amilase yang dihasilkan.
Uji protease menggunakan media NA ditambah susu skim 1% dan disterilkan pada suhu 1100 selama 15 menit. Isolat terpilih diinokulasikan, diinkubasi selama dua hari, adanya zona menandakan isolat menghasilkan protease. Zona bening yang dihasilkan diukur untuk untuk menentukan indeks proteasenya.
Uji lipase dengan menggunakan media NA ditambah tween 80 1% dan disterilkan, kemudian diinokulasikan isolat 7n, 25n, 27n, 34n. Diinkubasi selama dua hari, aktivitas lipase ditandai oleh adanya zona bening disekitar koloni bakteri.
Untuk uji selulase media NA ditambah carboximetil celulase (CMC) 1% dan disterilkan. Isolat terpilih diinokulasikan dan diinkubasi selama dua hari. Zona bening akan terlihat dengan ditambahkannyaCongo red dan NaOH 10% ke media. Nilai indeks amilase, protease, lipase cellulase dihitung dengan persamaan:
A B B
energi untuk aktivitasnya. Molase telah banyak digunakan sebagai bahan pembuatan media produksi mikroba dalam skala besar. Komposisi kimia molase menurut Paturau (1982) terdiri dari sukrosa 35%, glukosa 7%, gula pereduksi 3%, karbohidrat lain 4% serta abu 12 %.
Tepung Kedelai
Tepung kedelai dapat digunakan sebagai sumber nitrogen bagi pertumbuhan bakteri. Menurut Sukmadi (1996) diacu dalam Suryanti (1998), tepung kedelai (Soybean meal) mengandung 34.8% karbohidrat, 42% protein dan 19-20% lemak (lampiran 2). Kandungan nutrisi lain adalah vitamin A, vitamin B6, vitamin B12, vitamin C, vitamin K, Kalsium, zat besi, magnesium, fosfor, kalium, dan seng. Protein pada kedelai tersusun oleh sejumlah asam amino: arginin, lisin, glisin, niasin, leusin, treonin, triptofan, fenilalanin (Anonim 2008).
Unsur C, N, P merupakan tiga nutrisi utama (makro nutrien) yang dibutuhkan oleh bakteri dalam melakukan metabolisme sel untuk menghasilkan senyawa senyawa yang penting dalam pertumbuhan bakteri nitrogen dan fosfor merupakan bahan penyusun senyawa-senyawa penting dalam sel yang menentukan aktivitas pertumbuhan mikrooganisme.
Rasio C:N yang tinggi (kandungan unsur N yang relatif rendah) akan menyebabkan proses pertumbuhan berlangsung lebih lambat karena nitrogen akan menjadi faktor penghambat (growth-rate limiting factor) (Alexander 1994). Unsur N memiliki peranan yang sangat penting dalam penyusunan asam nukleat, asam amino dan enzim-enzim. Sedangkan unsur P berperan dalam pembentukan asam nukleat dan fosfolipid. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa rasio C:N:P optimum untuk pertumbuhan mikroba adalah 100:10:1 (Shewfeltet al. 2005).