BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.7 Uraian Bakteri
2.7.3 Bakteri Bacillus cereus
Sistematika bakteri Bacillus cereus menurut Bergey edisi ke-7 (Dwidjoseputro, 1987) adalah sebagai berikut :
Divisio : Protophyta Class : Schizomycetes Ordo : Eubacteriales Family : Bacillaceae Genus : Bacillus
Species : Bacillus cereus
Organisme ini adalah batang besar gram positif yang membentuk spora dan merupakan salah satu anggota suku Bacillaceae saprofit yang paling sering terdapat dimana-mana (Volk dan Wheeler, 1989). Genus Bacillus merupakan bakteri aerob, selnya berukuran 1 x 3-4 µm, mempunyai ujung yang berbentuk empat persegi dan tersusun dalam rantai panjang. Kebanyakan anggota genus ini adalah organisme yang lazim terdapat dalam tanah, air, udara, dan tumbuh-tumbuhan, seperti Bacillus cereus. Bacillus cereus menyebabkan keracunan makanan dan kadang-kadang infeksi mata atau infeksi di tempat lain (Jawetz et al, 1996).
2.7.4 Uji aktifitas antimikroba
Uji kepekaan terhadap obat antimikroba pada dasarnya dapat dilakukan melalui tiga cara, yaitu :
a. Metode dilusi
Cara ini digunakan untuk menentukan KHM (Kadar Hambat Minimal) dan KBM (Kadar Bunuh Minimal) dari obat antimikroba. Prinsip dari metode dilusi adalah sebagai berikut :
Menggunakan satu seri tabung reaksi yang diisi media cair dan sejumlah tertentu sel mikroba yang diuji. Kemudian masing-masing tabung diuji dengan obat yang telah diencerkan secara serial. Seri tabung diinkubasi pada suhu 37 0C selama 18-24 jam dan diamati terjadinya kekeruhan pada tabung. Konsentrasi terendah obat pada biakan padat yang ditunjukkan dengan tidak adanya pertumbuhan koloni mikroba adalah KBM dari obat terhadap bakteri uji.
b. Metode difusi
Prinsip dari metode difusi adalah sebagai berikut :
Obat dijenuhkan ke dalam kertas saring (cakram kertas), cakram kertas yang mengandung obat tertentu ditanam pada media pembenihan agar padat yang telah dicampur dengan miroba yang diuji, kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C selama 18-24 jam. Selanjutnya diamati adanya area (zona) jernih disekitar cakram kertas yang menunjukkan tidak adanya pertumbuhan mikroba (Brooks, 2001).
c. Metode turbidimetri
Ke dalam tabung reaksi ditambahkan 1 ml larutan antibiotic dan 9 ml inokulum. Diinkubasikan pada suhu 30 0C selama tiga sampai empat jam. Setelah diinkubasi, ditambahkan 0,5 ml formaldehid. Serapan diukur dengan spektrofotometer pada 530 nm. Kadar antibiotik ditentukan berdasarkan perbandingan serapannya terhadap serapan standar.
Penetapan aktivitas antibiotik secara invitro selain berguna untuk penetapan kadar dapat pula digunakan untuk menguji kepekaan suatu antibiotik terhadap mikroba. Kepekaan mikroba terhadap antibiotik dapat dilihat dari konsentrasi minimum untuk inhibisi oleh suatu antibiotik terhadap mikroba tertentu. Penetapan konsentrasi minimum untuk inhibisi dapat dilakukan dengan menguji sederetan konsentrasi antibiotik yang dibuat dengan cara pengenceran;
metode yang digunakan dapat dengan cara turbidimetri atau difusi agar.
Konsentrasi terendah dimana pertumbuhan mikroba dihambat dinyatakan sebagai konsentrasi minimum untuk inhibisi (KMI) (Wattimena, 1991).
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas laboratorium, autoklaf (Fison), bejana kromatografi (Dessaga), Colony counter elektromantel (EM 2000), inkubator (Fisher scientific), lemari pendingin (Sharp), neraca analitik (Mettler Toledo), neraca kasar (Ohaus), oven (Gallenkamp), penangas air (Yenaco), pencadang logam, Spektrofotometer visible (Dynamica) dan seperangkat alat Stahl (Schott duran).
3.2 Bahan-bahan
Tumbuhan yang digunakan pada penelitian ini adalah kulit buah jeruk sundai (Citrus jambhiri Lush.). Bahan kimia yang digunakan berkualiltas pro analisa, kecuali dinyatakan lain : asam asetat anhidrat, asam klorida, asam nitrat, asam sulfat, benzen, besi (III) klorida, bismuth (III) nitrat, etanol, eter minyak tanah, etil asetat, iodium, isopropanol, kalium iodida, kloroform, metanol, merkuri (II) klorida, natrium hidroksida, n-heksan, natrium klorida, natrium sulfat anhidrat, serbuk magnesium, serbuk seng, timbal (II) asetat, toluen, vanillin, α-naftol, air suling, etanol 96 % hasil destilasi, dan nutrien agar (NA). Bakteri yang digunakan Bacillus cereus dan Escherichia coli.
3.3 Penyiapan Sampel
Penyiapan sampel meliputi pengambilan sampel, determinasi tumbuhan, dan pengolahan sampel.
3.3.1 Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan secara purposif tanpa membandingkan dengan daerah lain. Sampel yang digunakan pada penelitian adalah buah jeruk sundai (Citrus jambhiri Lush.), bagian yang digunakan adalah kulit buah jeruk yang segar. Diperoleh dari Pasar Sentral di Jalan Sutomo, Medan, Sumatera Utara pada bulan Juli 2008.
3.3.2 Determinasi Tumbuhan
Determinasi tumbuhan dilakukan oleh Laboratorium Taksonomi Tumbuhan Biologi Universitas Sumatera Utara. Hasil selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 1 halaman 49.
3.3.3 Pengolahan Sampel
Buah tumbuhan jeruk sundai dibersihkan dari pengotoran, kemudian diambil bagian kulit buah, lalu ditimbang. Kulit jeruk dipotong tipis-tipis, kemudian dikeringkan dengan cara diangin-anginkan di udara terbuka, terlindung dari sinar matahari langsung, berat bahan yang kering ditimbang. Selanjutnya disimpan dalam kantung kertas perkamen ditempat yang terlindung dari sinar matahari.
3.4 Pembuatan Larutan Pereaksi
Pembuatan pereaksi menurut (Depkes, 1989), yaitu pereaksi Mayer, pereaksi Dragendorff, pereaksi Bouchardat, pereaksi Molish, larutan besi (III) klorida 1% b/v, larutan timbal (II) asetat 0,4 M, vanilin-asam sulfat; untuk
pereaksi Liebermann-Burchard (Harbone, 1987); untuk larutan asam klorida 2 N, larutan asam sulfat 2 N, dan larutan natrium hidroksida 2 N (Depkes, 1979).
3.4.1 Pereaksi Mayer
Sebanyak 2,266 g raksa (II) klorida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml (Larutan I). Pada wadah lain dilarutkan 50 g kalium iodida dalam 100 ml air suling (Larutan II). Kemudian 60 ml larutan I dicampur dengan 10 ml larutan II kemudian ditambahkan air suling hingga 100 ml.
3.4.2 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 8,0 g bismuth (III) nitrat dilarutkan dalam 20 ml asam nitrat (Larutan I). Pada wadah lain dilarutkan 27,2 g kalium iodida dalam 50 ml air suling (Larutan II). Dicampur kedua larutan dalam air hingga 100 ml.
3.4.3 Pereaksi Bouchardat
Ditimbang kalium iodida sebanyak 4 g, kemudian dilarutkan dalam sedikit air suling lalu ditambahkan 2 g iodium, setelah semuanya larut ditambahkan air suling hingga 100 ml.
3.4.4 Pereaksi Molish
Ditimbang α-naftol sebanyak 3 g dilarutkan dalam 15 ml etanol 95 %, kemudian ditambahkan asam nitrat 0,5 N hingga diperoleh larutan 100 ml.
3.4.5 Larutan besi (III) klorida 1% b/v
Ditimbang besi (III) klorida sebanyak 1 g, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml lalu disaring.
3.4.6 Larutan timbal (II) asetat 0.4 M
Ditimbang timbal (II) asetat sebanyak 15,17 g, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbondioksida hingga100 ml.
3.4.7 Larutan natrium hidroksida 2 N
Ditimbang natrium hidroksida sebanyak 8,002 g, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbondioksida hingga 100 ml.
3.4.8 Vanilin-asam sulfat
Dilarutan 5 g vanillin P dalam asam sulfat P hingga 100 ml.
3.4.9 Pereaksi Liebermann-Burchard
Untuk pereaksi kualitatif, sebanyak 20 bagian asam asetat anhidrat dicampur dengan 1 bagian asam sulfat pekat.
Untuk penyemprot, sebanyak 20 bagian asam asetat anhidrat dicampurkan dengan 1 bagian asam sulfat pekat dan 50 bagian kloroform. Larutan penyemprot ini harus dibuat baru.
3.4.10 Larutan asam klorida 2 N
Larutan asam klorida pekat sebanyak 17 ml ditambahkan air suling sampai 100 ml.
3.4.11 Larutan asam sulfat 2 N
Larutan asam sulfat pekat sebanyak 9,8 ml ditambahkan air suling sampai 100 ml.
3.5 Skrining Fitokimia serbuk kulit buah jeruk sundai (Citrus jambhiri Lush.)
Skrining fitokimia dilakukan terhadap serbuk kulit buah jeruk sundai (Citrus jambhiri Lush), untuk alkaloid (Ditjen POM, 1995); flavonoid, glikosida, glikosida antrakinon, saponin, dan tanin (Depkes, 1989) dan steroid/triterpenoid (Farnsworth, 1966).
3.5.1 Pemeriksaan Alkaloid
Serbuk kulit buah jeruk sundai ditimbang sebanyak 0,5 g, kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring, filtrat dipakai untuk uji alkaloid. Diambil 3 tabung reaksi, lalu ke dalam masing-masing tabung reaksi dimasukkan 0,5 ml filtrat.
a. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer b. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff c. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat
Alkaloid disebut positif jika terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit 2 tabung reaksi dari percobaan di atas.
3.5.2 Pemeriksaan Flavonoid
Larutan percobaan : serbuk kulit buah jeruk sundai ditimbang sebanyak 0,5 g, lalu disari dengan 10 ml metanol, direfluks selama 10 menit, disaring panas-panas melalui kertas saring, filtrat diencerkan dengan 10 ml air suling.
Setelah dingin ditambahkan 5 ml eter minyak tanah, dikocok hati-hati, didiamkan.
Lapisan metanol diambil, diuapkan pada temperatur 40OC. Sisa dilarutkan dalam 5 ml etil asetat, kemudian disaring. Filtrat digunakan untuk uji flavonoid dengan cara :
a. Sebanyak 1 ml larutan percobaan diuapkan sampai kering, sisanya dilarutkan dalam 1-2 ml etanol 95% lalu ditambah 0,5 g serbuk seng dan 2 ml asam klorida 2 N. Didiamkan selama 1 menit, kemudian ditambahkan 10 tetes asam klorida pekat, jika dalam waktu 2-5 menit terjadi warna merah intensif menunjukkan adanya flavonoid.
b. Sebanyak 1 ml larutan percobaan diuapkan sampai kering, sisanya dilarutkan dalam 1 ml etanol 95% lalu ditambah 0,1 g serbuk magnesium dan 10 tetes asam klorida pekat. Jika terjadi warna merah jingga sampai merah ungu menunjukkan adanya flavonoid.
3.5.3 Pemeriksaan Glikosida
Sebanyak 3 g serbuk kulit buah jeruk sundai ditimbang lalu disari dengan 30 ml campuran dari 7 bagian etanol 95% dan 3 bagian air suling. Kemudian direfluks selama 10 menit, didinginkan, lalu disaring. Diambil 20 ml filtrat, ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal (II) asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran 2 bagian isopropanol dan 3 bagian kloroform, perlakuan ini diulang sebanyak 3 kali. Sari air dikumpulkan dan ditambahkan Na2SO4 anhidrat, disaring, kemudian diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50OC, sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol.
Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut :
a. Sepersepuluh milliliter larutan percobaan dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian diuapkan di atas penangas air, sisanya dilarutkan dalam 5 ml asam asetat anhidrat kemudian ditambahkan 10 tetes asam sulfat pekat. Glikosida positif jika terjadi warna biru atau hijau.
b. Sepersepuluh milililter larutan percobaan dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian diuapkan di atas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes larutan pereaksi Molish, lalu ditambahkan dengan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat, terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan, menunjukkan adanya ikatan gula (glikon).
3.5.4 Pemeriksaan Glikosida Antrakinon
Sebanyak 0,2 g serbuk kulit buah jeruk sundai dicampur dengan 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzen, dikocok lalu didiamkan. Lapisan benzen dipisahkan dan disaring kemudian kocok dengan 2 ml NaOH 2 N, diamkan. Lapisan air berwarna merah, dan lapisan benzen tidak berwarna menunjukkan adanya glikosida antrakinon.
3.5.5 Pemeriksaan Saponin
Sebanyak 0,5 g serbuk kulit buah jeruk sundai dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air suling panas, didinginkan, kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Saponin positif jika terbentuk busa yang stabil tidak kurang dari 10 menit setinggi 1 sampai 10 cm dan dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N busa tidak hilang.
3.5.6 Pemeriksaan Tanin
Sebanyak 0,5 g serbuk kulit buah jeruk sundai disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna.
Larutan diambil sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi (III) klorida 1%. Jika terjadi warna biru atau kehitaman menunjukkan adanya tanin.
3.5.7 Pemeriksaan Triterpenoid/Steroid
Sebanyak 1 g serbuk kulit buah jeruk sundai dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam, disaring lalu filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa ditambahkan 20 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat (pereaksi Liebermann-Burchard). Apabila terbentuk warna biru atau biru-hijau menunjukkan adanya steroid, sedangkan warna merah, merah muda atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid.
3.6 Penetapan Kadar Air a. Penjenuhan toluen
Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan ke dalam labu alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,01 ml.
b. Penetapan kadar air
Kedalam labu yang berisi toluen jenuh di atas dimasukkan 5 g serbuk kulit buah jeruk sundai yang telah ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,01 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen (Depkes, 1979). Hasil selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 12 halaman 63.
3.7 Isolasi Minyak Atsiri kulit buah jeruk sundai
Isolasi minyak atsiri dilakukan dengan menggunakan alat Stahl (Stahl, 1969). Sebanyak 50 gram kulit buah jeruk sundai dimasukkan ke dalam labu destilasi yang telah dirangkai dalam seperangkat alat destilasi. Kemudian dimasukkan air suling sebanyak 400 ml, selanjutnya didestilasi selama 6 jam sampai diperoleh minyak atsiri. Minyak atsiri yang diperoleh ditambahkan
natrium sulfat anhidrat dan didiamkan selama 24 jam. Minyak atsiri dipipet dan disimpan dalam wadah yang tertutup rapat dan terlindung dari sinar matahari.
3.8 Pembuatan Ekstrak Air dan Ekstrak Etanol
Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara memisahkan antara larutan dan ampas serbuk kulit buah jeruk sundai yang telah diisolasi minyak atsirinya. Filtrat diuapkan di atas waterbath sampai kental, kemudian dikeringkan dengan alat freeze dryer pada temperatur -40OC selama ± 24 jam, diperoleh ekstrak air.
Ampas dikeringkan dengan cara diangin-anginkan, setelah kering dimasukkan ke dalam wadah gelas yang berwarna gelap, kemudian dimaserasi dengan pelarut etanol, dibiarkan pada suhu kamar dan terlindung dari cahaya selama 2 hari sambil sering diaduk. Saring, terhadap ampas dimaserasi kembali menggunakan prosedur yang sama sampai jernih, semua filtrat digabungkan dan diuapkan sampai kental dengan bantuan alat rotary evaporator. Selanjutnya dikeringkan dengan alat freeze dryer pada temperatur -40OC selama ± 24 jam, diperoleh ekstrak etanol.
3.9 Analisis Minyak Atsiri, Ekstrak Air, dan Ekstrak Etanol dengan kromatografi lapis tipis.
Minyak atsiri, ekstrak air, dan ekstrak etanol dianalisis secara KLT menggunakan plat pra lapis silika gel GF 254, sebagai fase gerak campuran toluen: etil asetat (7:3), kloroform : etil asetat (7:3), dan kloroform : metanol (7:3) untuk ekstrak air dan ekstrak etanol, sedangkan untuk minyak atsiri digunakan fase gerak benzen : kloroform (8:2), benzen : kloroform (7:3) dan n-heksan : etil asetat (9:1), n-heksan : etil asetat (8:2). Sebagai penampak noda untuk minyak atsiri adalah vanilin-H2SO4; untuk ekstrak air dan ekstrak etanol adalah Liebermann-Burchard, Dragendorff, dan FeCl 1%.
Cara kerja :
Minyak atsiri, ekstrak air, dan ekstrak etanol ditotolkan pada plat pra lapis silika gel GF 254 kemudian dimasukkan ke dalam bejana yang telah jenuh dengan masing-masing uap fase gerak dan ditutup rapat. Setelah elusi selesai, plat dikeluarkan dari bejana kemudian diamati secara visual dan di bawah sinar lampu ultra violet (uv) 254 nm, lalu untuk minyak atsiri disemprot dengan pereaksi vanilin-H2SO4; untuk ekstrak air dan ekstrak etanol digunakan Liebermann-Burchard, Dragendorff dan FeCl3 1%, lalu plat dipanaskan di oven pada suhu 85-95OC selama 15 menit, diamati kembali warna bercak dan dihitung harga Rf.
3.10 Pengenceran Larutan Minyak Atsiri
Larutan minyak atsiri dibuat konsentrasi 100% v/v sampai 1,563% v/v dalam pelarut etanol.
Cara kerja :
Minyak atsiri dipipet dengan mat pipet 1,5 ml, dicukupkan dengan etanol sampai 2 ml sehingga konsentrasi menjadi 75%, kemudian dari larutan ini dibuat pengenceran 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, dan 1,563% v/v.
3.11 Pengenceran Ekstrak Air dan Ekstrak Etanol
Ekstrak air dan ekstrak etanol ditimbang sebanyak 5 gram lalu masing-masing dilarutkan dalam labu tentukur 10 ml, untuk ekstrak air dilarutkan dengan air dan ekstrak etanol dilarutkan dengan etanol, diperoleh masing-masing konsentrasi ekstrak yaitu 500 mg/ml kemudian dibuat pengenceran dengan konsentrasi 400 mg/ml, 300 mg/ml, 200 mg/ml, 100 mg/ml, 90 mg/ml dan 80 mg/ml.
3.12 Pembuatan Media 3.12.1 Larutan NaCl 0,9%
Komposisi: Natrium Klorida 9 gram Air suling hingga 1000 ml Cara pembuatan:
Ditimbang natrium klorida 9 gram lalu dilarutkan dalam air suling sedikit demi sedikit dalam labu ukur 1000 ml sampai larut sempurna. Lalu ditambahkan air suling sampai garis tanda. Disterilkan di autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit (Sonnenwirth, 1980).
3.12.2 Nutrient Agar
Komposisi: Bacto beef extract 3 g Bacto pepton 5 g Bacto agar 15 g Cara pembuatan:
Sebanyak 23 g campuran bahan di atas disuspensikan kedalam 1 L air suling steril, kemudian dipanaskan di atas penangas air sampai bahan larut sempurna. Dalam keadaan panas, larutan tersebut dituangkan kedalam tabung reaksi steril, ditutup, disterilkan dalam autoklaf pada temperatur 1210C selama 15 menit (Difco, 1977).
3.12.3 Plate Count Agar Komposisi : Tripton 5 g
Ekstrak khamir 1,5 g Dekstrosa 1 g
Agar 15 g
Cara pembuatan :
Sebanyak 23,5 g campuran bahan diatas disuspensikan kedalam 1 L air suling steril, kemudian dipanaskan di atas penangas air sampai bahan larut sempurna. Dalam keadaan panas, larutan tersebut dituangkan ke dalam tabung reaksi steril, ditutup, disterilkan dalam autoklaf pada temperatur 1210C selama 15 menit (Difco, 1977).
3.12.4 Pembuatan Agar Miring
Kedalam tabung reaksi steril dimasukkan 3 ml media nutrient agar steril, didiamkan pada temperatur kamar sampai sediaan membeku pada posisi miring kira-kira 450C. Disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 50C.
3.13 Penyiapan Inokulum
3.13.1 Pembuatan Stok Kultur Bakteri Bacillus cereus dan Escherichia coli Cara kerja :
Masing-masing biakan bakteri dari strain utama diambil dengan jarum ose steril lalu diinokulasikan pada permukaan media nutrient agar miring, kemudian diinkubasikan pada suhu 350C ± 20C selama 18-24 jam.
3.13.2 Pembuatan Inokulum Cara kerja :
Bakteri Bacillus cereus dan Escherichia coli hasil inokulasi diambil menggunakan jarum ose steril, kemudian masing-masing disuspensikan kedalam 10 ml larutan NaCl 0,9% steril, diaduk homogen, lalu diinkubasi dalam inkubator pada suhu 350C ± 20C sampai diperoleh transmitan 25 % pada panjang gelombang 580 nm (Ditjen POM, 1995).
3.14 Pengujian Aktivitas Antibakteri
Pengujian aktivitas antibakteri minyak atsiri, ekstrak air, dan ekstrak etanol dilakukan terhadap berbagai konsentrasi dengan metode difusi agar, menggunakan pencadang logam. Bakteri yang digunakan adalah Bacillus cereus dan Escherichia coli.
Cara kerja :
Sebanyak 0,1 ml inokulum bakteri dicampur homogen dengan 15 ml nutrien agar dicawan petri steril, kemudian dibiarkan sampai memadat. Pada media yang telah padat ditanam cincin pencadang logam, kemudian pada masing-masing pencadang dimasukkan minyak atsiri sebanyak 0,1 ml dengan berbagai konsentrasi. Selanjutnya dilakukan hal yang sama terhadap ekstrak air dan ekstrak etanol, dimana sebagai kontrol untuk minyak atsiri dan ekstrak etanol digunakan etanol dan untuk ekstrak air digunakan akuades steril. Masing-masing media diinkubasi pada suhu 350C ± 20C selama 24 jam, kemudian diukur diameter daerah bening disekitar cincin pencadang menggunakan jangka sorong percobaan dilakukan 3 kali (Brooks, 2001).
3.15 Pengujian Aktivitas Antibakteri Minyak Atsiri dengan Uji Angka Lempeng Total.
Cara kerja :
Bakteri hasil inokulasi diambil menggunakan jarum ose steril lalu disuspensikan kedalam tabung yang berisi 10 ml NaCl, diaduk homogen, lalu diinkubasi dalam inkubator pada suhu 350C ± 20C sampai diperoleh transmitan 25
% pada panjang gelombang 580 nm. Disiapkan 4 buah tabung reaksi yang masing-masing telah diisi dengan 9 ml NaCl. Dari suspensi biakan dipipet 1 ml,
lalu dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi NaCl yang pertama sehingga diperoleh pengenceran 10-1, dilakukan hal yang sama sampai diperoleh pengenceran 10-4. Kemudian dipipet 0,1 ml dari pengenceran 10-4 dan dimasukkan kedalam cawan petri. Lalu dimasukkan 0,1 ml minyak atsiri dengan berbagai konsentrasi, dituangkan media PCA kedalam petri dicampur homogen dan dibiarkan sampai memadat. Diinkubasi di Inkubator pada suhu 350C ± 20C selama 24 jam dengan posisi terbalik, kemudian dihitung pertumbuhan koloninya dengan colony counter, percobaan dilakukan 3 kali (Depkes RI, 2000).
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil identifikasi tumbuhan yang dilakukan oleh Laboratorium Taksonomi Biologi Universitas Sumatera Utara Medan, menyebutkan bahwa sampel yang diteliti adalah jenis Citrus jambhiri Lush., suku Rutaceae.
Skrining fitokimia terhadap kulit buah jeruk sundai (Citrus jambhiri Lush.) menunjukkan adanya golongan senyawa metabolit sekunder terlihat pada Tabel 1 berikut.
Tabel 1. Hasil Skrining Fitokimia kulit buah jeruk sundai
Keterangan : + : memberikan hasil : - : tidak memberikan hasil
Senyawa alkaloid memberikan endapan putih dengan pereaksi Mayer dan dengan pereaksi Dragendorff memberikan endapan warna jingga kecoklatan.
Senyawa flavonoid memberikan warna merah jingga setelah ditambah serbuk magnesium dan asam klorida pekat dan terbentuk warna merah intensif dengan
NO Golongan Senyawa Kulit buah jeruk sundai
1 Alkaloid +
2 Flavonoid +
3 Glikosida +
4 Glikosida antrakinon +
5 Triterpenoida/steroid +
6 Tanin +
7 Saponin -
penambahan serbuk seng dan asam klorida pekat. Senyawa glikosida memberikan warna biru setelah ditambah H2SO4 sedangkan dengan pereaksi Molish terbentuk cincin ungu. Senyawa glikosida antrakinon terbentuk warna merah intensif setelah penambahan NaOH, dan untuk senyawa triterpenoid/steroid terbentuk warna ungu setelah diberikan pereaksi Liebermann-Burchard. Senyawa tanin memberikan warna biru kehitaman setelah ditambah FeCl3, untuk saponin tidak memberikan reaksi positif karena tidak terbentuk busa yang stabil pada saat pengocokan dengan air suling.
Hasil penetapan kadar air kulit buah jeruk sundai kering diperoleh 7,9%.
Hasil dari 1 kg kulit buah jeruk sundai segar setelah dikeringkan diperoleh sebanyak 280 gram. Minyak atsiri yang diperoleh dari hasil isolasi menggunakan alat Stahl diperoleh sebanyak 9,50 ml berwarna kuning pucat dengan aroma yang khas. Ekstrak air dan ekstrak etanol yang diperoleh dari sisa hasil isolasi minyak atsiri, setelah diuapkan dan dikeringkan dengan alat freeze dryer, diperoleh ekstrak air 56,35 g dan ekstrak etanol 31,44 g.
Hasil KLT dari minyak atsiri kulit buah jeruk sundai dengan menggunakan fase diam plat pra lapis silika gel GF 254 (Tabel 2) menunjukkan bahwa dengan fase gerak benzen : kloroform (7:3) dan n-heksan : etil asetat (9:1) setelah disemprot dengan vanillin-H2SO4 masing-masing memberikan 3 senyawa terpen.
Pada fase gerak benzen : kloroform (7:3) diperoleh Rf : 0,51 (ungu); 0,40 (ungu) dan 0,37 (biru muda), sedangkan dengan n-heksan : etil asetat (9:1) diperoleh Rf : 0,46 (biru muda); 0,35 (ungu) dan 0,21 (biru tua). Pada fase gerak benzen : kloroform (8:2) juga diperoleh 3 senyawa terpen yaitu Rf : 0,40 (biru muda); 0,35 (ungu) dan 0,27 (biru muda), sedangkan n-heksan : etil asetat (8:2) diperoleh 2
senyawa terpen dengan Rf : 0,60 (ungu) dan 0,44 (biru muda), sehingga dapat disimpulkan pada minyak atsiri kulit buah jeruk sundai ditemukan adanya 3 senyawa terpen seperti terlihat pada Tabel 2 berikut.
Tabel 2. Harga Rf Hasil KLT Minyak Atsiri kulit buah jeruk sundai (Citrus jambhiri Lush.) sundai (Citrus jambhiri Lush) dengan fase gerak toluen : etil asetat (7:3) toluen :
Tabel 4. Harga Rf Hasil KLT Ekstrak Air dan Ekstrak Etanol kulit buah jeruk sundai (Citrus jambhiri Lush) dengan fase gerak kloroform : etil asetat (7:3)
Tabel 5. Harga Rf Hasil KLT Ekstrak Air dan Ekstrak Etanol kulit buah jeruk sundai (Citrus jambhiri Lush) dengan fase gerak kloroform : metanol (7:3)
Hasil KLT ekstrak air dan ekstrak etanol kulit buah jeruk sundai menggunakan fase diam plat pra lapis silika gel GF 254 dengan berbagai macam
Hasil KLT ekstrak air dan ekstrak etanol kulit buah jeruk sundai menggunakan fase diam plat pra lapis silika gel GF 254 dengan berbagai macam