Pendahuluan
Biawak air (Varanus salvator) tergolong spesies tersamar (Koch et al. 2007, Welton et al. 2014a). Divergensi morfologi pada spesies tersamar tidak sejalan dengan divergensi genetik (Lorenz et al. 2005). Hal tersebut mengindikasikan bahwa kelompok taksa yang terdapat dalam spesies tersamar sangat mirip secara morfologi, secara molekuler berbeda.
Salah satu spesies biawak air Filipina, V. marmoratus, teridentifikasi sebagai spesies tersamar (Welton et al. 2013b). Telaah ulang V. marmoratus yang berasal dari Mindoro dan Semenanjung Bicol, Filipina menghasilkan tambahan dua spesies baru, yaitu V. bangonorum dan V. dalubasha secara berturut-turut di samping spesies lamanya, yaitu V. marmoratus yang berasal dari Pulau Luzon. Dua spesies baru tersebut secara morfologi hampir tidak dapat dibedakan, tetapi dapat teridentifikasi berdasarkan posisi mereka pada estimasi filogeni multilokus yang menggunakan lokus mitokondria (ND1, ND2) dan lokus inti (DGL-α, PRLR) (Welton et al. 2014a). V. bangonorum dan V dalubhasa merupakan hasil spesiasi alopatrik akibat adanya isolasi geografi. Penggunaan penanda genetik yang lain, yaitu gen COI telah berhasil digunakan untuk mengidentifikasi spesies- spesies biawak yang termasuk di dalam kelompok V. salvator ssp. (Arida 2014).
V. s. macromaculatus yang berasal dari wilayah Sumatera menarik untuk ditelaah ulang karena subspesies ini memiliki penyebaran terluas (Gambar 1.1) dan tergolong subspesies tersamar (Welton et al. 2013b). Pada studi sebelumnya, biawak air yang berasal dari Pulau Simeulue dan Pulau Bangka secara morfologi teridentifikasi sebagai morfo-spesies yang berbeda dari biawak air yang berasal dari Pulau Sumatera dan Riau Kepulauan (Bab 2). Oleh karena itu, karakterisasi molekuler berdasarkan gen COI perlu dilakukan untuk mengonfirmasi status taksa
V. s. macromaculatus yang berasal dari wilayah Sumatera yang telah berdifferensiasi secara morfologi apakah secara molekuler masih dalam kelompok yang sama atau telah berbeda pula secara molekuler.
Bahan dan Metode
Waktu dan Tempat Penelitian
Kerja lapangan untuk pengambilan sampel darah dilakukan sejak bulan Februari 2013 hingga April 2014. Pengambilan sampel darah dilakukan pada V. salvator yang berasal dari 12 lokasi yang sama dengan kajian morfologi (Gambar 2.1). Ekstraksi DNA dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor (PPSHB, IPB). Amplifikasi daerah gen COI V. salvator dilakukan di Laboratorium Terpadu, Departemen Biologi, IPB.
Bahan
Setiap individu V. salvator yang tertangkap per lokasi pengambilan sampel (Lampiran 2) diambil 0.5-1.0 ml contoh darah di sekitar sepertiga pangkal ekor dengan menggunakan spuit. Spuit ditusukkan pada bagian ventral ekor pada posisi dua atau tiga baris ke kanan atau kiri dengan arah menuju median. Contoh darah tersebut dipreservasi dengan etanol pure grade dengan perbandingan 1 : 5 dan segera dikocok untuk menjamin semua darah dipreservasi dengan baik. Setelah itu, individu biawak air dilepaskan ke habitatnya.
Cara kerja
Sampel darah V. salvator yang telah dikoleksi diambil sebanyak ± 25 mg, dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf (Eppendorf tube) 1.5 ml, dicuci dengan menggunakan Tris-asam etilena diamina tetra asetat (EDTA) konsentrasi rendah a t a u d ik e na l low TE. Tabung tersebut divorteks selama10 menit dan disentrifugasi 4500 rpm (revolutions per minute) selama tiga menit. Langkah ini diulang sebanyak tiga kali dengan tujuan untuk menghilangkan kandungan alkohol yang terdapat di dalam sampel jaringan V. salvator. DNA total diekstrak dari sampel jaringan dengan menggunakan Dneasy ® Blood & Tissue Kit cat no 69504 berdasarkan Spin-Column Protocol.
Kualitas DNA dilihat dengan dimigrasikan pada gel agarosa 1.2% dengan menggunakan buffer 1 x TBE (89 mM Tris, 89 mM asam borat dan 2 mM EDTA pH 8.0). Gel agarosa diwarnai dengan etidium bromida (0.5 g/ml). Pengamatan kualitas DNA dilakukan dengan bantuan alat foto dengan sinar Ultra Violet (UV) dengan ukuran 300 nm. DNA total yang dihasilkan digunakan sebagai cetakan DNA untuk proses amplifikasi.
Fragmen DNA pada daerah COI diamplifikasi dengan menggunakan sepasang primer dari Nagy et al. (2012) dengan sedikit modifikasi, yaitu VS- COI_F (5‟-TCTTCTCCACAAACCACAAAGA-3‟), dan VS-COI_R (5‟ACCTC TGGGTGTCCGAAGAATCA-3‟) pada kondisi Polymerase Chain Reaction
(PCR) yang digunakan sebagai berikut: predenaturasi dengan suhu 94 ºC selama 3 menit, 35 siklus dari (94 ºC selama 45 detik untuk denaturasi, 56 ºC selama 30 detik untuk penempelan primer dengan cetakan DNA (annealing), 72 ºC selama 1 menit untuk elongasi, 72 ºC selama 7 menit untuk elongasi akhir), dan inkubasi dengan suhu 15 ºC selama 40 menit. Larutan reaksi PCR dibuat dalam 25 µl dengan komponen dan konsentrasi akhir terdiri atas: 5 µl buffer, 5 µl enhance, 1 µl dNTP, 1 µl primer VS-COI_F dan VS-COI_R 10 pmol, 3-5 µl DNA, dan 0.2 µl TaqH5.
Produk PCR dielektroforesis melalui gel agarosa 1.2% dan divisualisasikan dengan pewarnaan etidium bromida. Pita tunggal pada gel agarose sebagai produk PCR dijadikan sebagai cetakan dalam reaksi pengurutan basa nukleotida dengan menggunakan primer VS-COI_F dan VS-COI_R. Purifikasi dan perunutan hasil amplifikasi dilakukan oleh perusahaan jasa 1st BASE) di Malaysia melalui PT Genetica Science.
Setiap hasil urutan basa nukleotida forward dan reverse dari setiap individu dipasangkan, dijajarkan, dan disunting menggunakan sofware Molecular Evolutionary Genetic Analysis (MEGA) 6. Urutan basa nukleotida yang
dihasilkan berukuran 664 pb (mengacu pada urutan basa nukleotida COI utuh V. salvator yang berasal dari Thailand dengan nomor akses AB980995 dan AB980996 dengan panjang nukleotida total 1596 pb). Semua urutan basa nukleotida tersebut dijajarkan berganda, beberapa situs ambigu ditemukan dan disunting secara manual. Runutan DNA yang diperoleh dari hasil penjajaran berganda tersebut adalah 516 nukleotida (Gambar 3.1), yaitu pada posisi ke 184 sampai dengan posisi ke 699 (mengacu pada COI utuh V. salvator dari GenBank). Bagian urutan basa nukleotida fragmen yang tidak terbaca, yaitu 148 nukleotida dari ujung 5‟ primer VS-COI_F. Hasil suntingan ditranslasi untuk memverifikasi bahwa sekuen hasil suntingan bebas dari stop codon atau kodon penerminalan. Setiap urutan basa nukleotida diverifikasi dengan melakukan Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) pada GenBank (wwww.ncbi.nlm.nih.gov) untuk menentukan ada tidaknya gap dan mengidentifikasi kemiripan genetik dengan urutan nukleotida utuh gen COI V. salvator yang ada di GenBank.
Gambar 3.1 Skema posisi penempelan primer VS-COI_F dan VS-COI_R pada produk amplifikasi
Data urutan basa nukleotida yang teridentifikasi memiliki kemiripan dengan gen COI utuh V. s. macromaculatus yang berasal dari Thailand (nomor akses AB980995 dan AB980996) lebih dari 97% digunakan dalam analisis selanjutnya. Urutan basa nukleotida gen COI parsial Varanus bengalensis yang berasal dari India (kode akses KF766939.1) digunakan sebagai outgroup. Beberapa karakter urutan basa nukleotida gen COI parsial pada V. salvator yang dianalisis, yaitu komposisi basa, keragaman nukleotida tiap kelompok, dan jumlah haplotipe. Karakter tersebut dihitung menggunakan MEGA 6 dan DNA SP versi 5 (Librado dan Rozas 2009). Jaring haplotipe dibuat menggunakan program Network 5.0.0.0.
Jarak genetik pada umumnya dievaluasi di antara pasangan urutan basa nukleotida yang disebut p distance (tanpa koreksi). Model p distance dihitung dari perubahan jumlah nukleotida per situs antara dua urutan basa nukleotida, dimana jumlah nukleotida yang berbeda dibagi dengan jumlah total nukleotida yang diuji. Jarak genetik model tanpa koreksi (p distance) dihitung menggunakan MEGA6. Jarak genetik yang dihitung meliputi estimasi within group mean distance (rerata jarak dalam kelompok), estimasi between group mean distance (rerata jarak antarkelompok), dan estimasi net between group mean distance (rerata jarak genetik bersih antarkelompok). Rerata jarak genetik antarkelompok dihitung berdasarkan rumus jumlah jarak genetik antara pasangan basa nukleotida dari dua kelompok dibagi jumlah basa nukleotida yang dipasangkan. Rerata jarak genetik antarkelompok selalu lebih tinggi dibandingkan dengan rerata jarak genetik dalam kelompok. Pendugaan status taksa sebagai spesies atau subspesies dalam
penelitian ini didasarkan pada rerata jarak genetik bersih antarkelompok. Rerata jarak genetik bersih antarkelompok XY adalah rerata jarak genetik antarkelompok XY dikurangi (rerata jarak genetik dalam kelompok X + rerata jarak genetik dalam kelompok Y)/2). Jarak genetik antar spesies secara umum ditentukan lebih dari 2% yang setara dengan perubahan 14-bp pada panjang sekuen DNA 650-bp (Hebert et al. 2003, Ward 2009).
Metode Neighbor-Joining (NJ) berdasarkan p distance dipilih dalam simulasi konstruksi pohon karena metode ini biasa digunakan pada metode pengelompokan pada beberapa studi DNA (Ratnasingham dan Hebert 2007) dan direkomendasikan sebagai metode standar yang minimum (St. John et al. 2003). Konstruksi pohon NJ dengan model p distance dan butstrap 1000 kali dilakukan dengan menggunakan MEGA 6 (Tamura et al. 2013). Urutan basa nukleotida yang diperoleh akan didepositkan di National Center for Biotechnology Information atau NCBI.
Hasil
Identitas urutan basa nukleotida COI V. salvatorasal wilayah Sumatera
Urutan basa nukleotida sebesar 80% dari total sampel berhasil diamplifikasi (Lampiran 1). Insersi dan delesi tidak terjadi dalam penjajaran urutan basa nukleotida gen COI. Hasil verifikasi setiap urutan basa nukleotida menunjukkan rentang kesamaan urutan basa nukleotida 97-100% dengan urutan basa nukleotida
V. salvatordari GenBank.
Hasil analisis fragmen gen COI sepanjang 516 pb pada semua individu V. salvator yang diteliti terdapat 413 situs conserved (80.04%), 103 situs variable
(19.96%), 28 situs parsimoni informatif (5.43%), 75 situs singleton (14.53%). Proporsi basa nukleotida dari penjajaran urutan basa nukleotida COI pada semua individu yang diteliti menunjukkan persentase basa timin (T) = 26.78%, sitosin (C) = 32.40%, adenin (A) = 25.06% dan guanin (G) = 15.76% (Lampiran 8). Dengan demikian timin + adenin (TA) sebesar 51.84% dan sitosin + guanin (GC) = 48.16% sehingga kandungan GC < AT dan relatif seimbang.
Substitusi basa nukleotida pada studi ini yang paling sering terjadi adalah pada kodon ketiga (78.64%), tetapi hal sebaliknya terjadi pada kodon kedua (8.74%). Hasil ini konsisten dengan pernyataan bahwa gen penyandi protein memiliki kodon ketiga paling variabel, sedangkan kodon kedua paling lestari (Xia et al. 1996, Xia 1998). Substitusi basa nukleotida yang bersifat transisi (78.64%) terjadi lebih banyak dibandingkan yang bersifat transversi (21.36%).
Polimorfisme V. salvator asal wilayah Sumatera berdasarkan gen COI
Analisis variasi urutan basa nukleotida V. salvator yang diuji menghasilkan delapan belas tipe haplotipe (Tabel 3.1) yang tergolong ke dalam 3 kelompok. Kelompok A terdiri atas 11 haplotipe dari 39 individu. Jaring haplotipe menunjukkan bahwa haplotipe utama adalah Hap_1 (Gambar 3.2). Hap_1 merupakan tipe haplotipe yang paling umum dalam set data yang diteliti, yang dimiliki oleh 24 individu. Hap_4 dan 6 menurunkan karakter dari haplotipe
Tabel 3.1 Haplotipe 52 individu V. salvator yang diuji Kode
Haplotipe Identitas spesimen Kelompok individu Jumlah Hap_1 MB1, MB5, PKU1, PKU3, PKU4, PKU5, BTM3,
BKL2, BKL3, BKL5, CB2, CB5, KD5, KD6, MD2, MD3, MD4, MD5, SB5, S2, S4, S5, Thailand AB980995 dan Thailand AB980996)
A 24 Hap_2 SB6 A 1 Hap_3 BTM1 A 1 Hap_4 BKL1 A 1 Hap_5 MB3, MB4 A 2 Hap_6 KD3, SB2, SB3, SB4 A 4 Hap_7 KD4 A 1 Hap_8 CB3 A 1 Hap_9 PKU2, S1 A 2 Hap_10 BTM4 A 1 Hap_11 MB2 A 1 Hap_12 JW2 B2 1 Hap_13 JW4 B2 1 Hap_14 JW1 B2 1 Hap_15 BG3 B1 1 Hap_16 BG1, BG2, BG4 B1 3 Hap_17 BG5 B1 1 Hap_18 SL1, SL2, SL3, SL4, SL5 C 5 Total 52
Keterangan: Singkatan identitas spesimen merupakan lokasi pengambilan sampel (Lampiran1). Angka pada kode sampel menunjukkan nomor individu yang diuji.
Tabel 3.2 Situs substitusi nukleotida khas sebagai penciri kelompok-kelompok pada V. salvator yang diuji (huruf yang ditebalkan dan diarsir)
ID Klpk Nomor nukleotida 0 5 4 1 1 4 1 7 7 1 8 0 2 1 9 4 4 1 4 5 9 2 9 1 3 0 9 3 9 0 2 4 0 4 0 2 0 0 1 0 3 9 2 1 6 2 3 1 2 4 6 3 1 6 3 2 4 MB A G T T A G G T T C C C C G G T G A A A SB A G T T A G G T T C C C C G G T G A A A PKU A G T T A G G T T C C C C G G T G A A A S A G T T A G G T T C C C C G G T G A A A BKL A G T T A G G T T C C C C G G T G A A A MD A G T T A G G T T C C C C G G T G A A A KD A G T T A G G T T C C C C G G T G A A A CB A G T T A G G T T C C C C G G T G A A A BTM A G T T A G G T T C C C C G G T G A A A BG B1 A C A G A A C C T A C C G G T G A A A JW B2 A C A G A A C T C C A T G G T G A A A SL C A C A G A A C T C C C C A A C A G G G
Keterangan: Nomor nukleotida menunjukkan posisi basa nukleotida diagnostik. ID: kode identitas asal individu. Singkatan pada ID merujuk keterangan lokasi pengambilan sampel. Klpk: kelompok
utama, yaitu ke Hap_3 dan Hap_7 secara berturut-turut. Keragaman haplotipe tertinggi dimiliki oleh subkelompok B2 (Hd = 1). Sebaliknya, kelompok C hanya memiliki 1 haplotipe (Hap_18) sehingga paling tidak beragam haplotipenya.
Dari 18 haplotipe (Lampiran 9), ditemukan 19 situs substitusi nukleotida khas yang dapat digunakan sebagai penciri kelompok-kelompok V. salvator yang berasal dari wilayah Sumatera. Sembilan belas situs tersebut merupakan purely character diagnostic atau karakter pendiagnosis murni (Tabel 3.2). Rincian jumlah karakter pendiagnosis murni pada setiap kelompok sebagai berikut: kelompok A, tujuh situs: G054A, T144C, T177A, A180G, G219A, G441A, T459C; subkelompok B1, tiga situs: C291T, T309C, A390C; subkelompok B2, dua situs: A240, T402C; kelompok C, 7 situs: A001G, A039G, C216T, A231G, G246A, G316A, G324A.
Fenogram dan jarak genetik
Fenogram NJ dengan model p distance pada biawak air yang diuji menunjukkan ada tiga kelompok (Gambar 3.2). Kelompok pertama terdiri atas V. salvator yang berasal dari Pulau Sumatera dan Riau Kepulauan (A). V. salvator
yang berasal dari Pulau Bangka (B1) lebih memiliki kesamaan genetik dengan V. salvator yang berasal dari Pulau Jawa (B2). Kelompok ketiga adalah V. salvator
yang berasal dari Pulau Simeulue (C).
Rerata jarak genetik dalam kelompok V. salvator yang berasal dari Pulau Simeulue (0.00%) adalah paling kecil dibandingkan dengan rerata jarak genetik dalam kelompok V. salvator lainnya. Hasil tersebut mengindikasikan bahwa individu-individu asal Pulau Simeulue tidak memiliki variasi urutan basa nukleotida (Tabel 3.3). Sebaliknya, rerata jarak genetik dalam kelompok V. salvator yang berasal dari Pulau Jawa adalah terbesar (1.42%) sehingga kelompok ini memiliki variasi nukleotida yang paling tinggi.
Rerata jarak genetik antarkelompok pada V. salvator yang diuji lebih tinggi dibandingkan dengan rerata jarak genetik dalam kelompok V. salvator yang diuji (Tabel 3.3). Hasil yang sama juga ditunjukkan pada rerata jarak genetik bersih antarkelompok (Tabel 3.4). Mengingat rerata jarak genetik bersih memperhitungkan faktor koreksi maka rerata jarak genetik bersih antarkelompok digunakan dalam pendugaan status taksa V. salvator yang diuji. Rentang faktor koreksi 0.0012-0083 mengindikasikan bahwa batas tingkat variasi urutan nukleotida adalah sebesar 1-8 nukleotida dari 1000 pb basa nukleotida.
V. salvator (Siak 4) V. salvator (Siak 5) V. salvator (Siak 2)
V. salvator (Serdang Bedagai 5) V. salvator (Pulau Mendol 5) V. salvator (Pulau Mendol 4) V. salvator (Pulau Mendol 3) V. salvator (Pulau Mendol 2) V. salvator (Pulau Kundur 6) V. salvator (Pulau Kundur 5) V. salvator (Pulau Combol 5) V. salvator (Pulau Combol 2) V. salvator (Pulau Bengkalis 5) V. salvator (Pulau Bengkalis 3) V. salvator (Pulau Bengkalis 2) V. salvator (Pulau Batam 3) V. salvator (Pekanbaru 5) V. salvator (Pekanbaru 4) V. salvator (Pekanbaru 3) V. salvator (Pekanbaru 1) V. salvator (Meulaboh 5) V. salvator (Meulaboh 1) V. salvator (Thailand AB980995) V. s. komaini (Thailand AB980996)
V. salvator (Serdang Bedagai 6) V. salvator (Pulau Batam 1) V. salvator (Pulau Bengkalis 1) V. salvator (Meulaboh 3) V. salvator (Meulaboh 4) V. salvator (Pulau Kundur 3)
V. salvator (Pulau Kundur 4) V. salvator (Serdang Bedagai 4) V. salvator (Serdang Bedagai 2) V. salvator (Serdang Bedagai 3) V. salvator (Pulau Combol 3) V. salvator (Pekanbaru 2) V. salvator (Siak 1)
V. salvator (Pulau Batam 4) V. salvator (Meulaboh 2)
A
V. salvator (Pulau Bangka 5) V. salvator (Pulau Bangka 4) V. salvator (Pulau Bangka 2) V. salvator (Pulau Bangka 1) V. salvator (Pulau Bangka 3)
B1
V. salvator (Pulau Jawa 1) V. salvator (Pulau Jawa 4) V. salvator (Pulau Jawa 2)
B2
V. salvator (Pulau Simeulue 1) V. salvator (Pulau Simeulue 2) V. salvator (Pulau Simeulue 3) V. salvator (Pulau Simeulue 4) V. salvator (Pulau Simeulue 5)
C Outgroup V. bengalensis (India KF766939.1) 100 64 94 95 74 52 64 66 65 64 95 0.02
Gambar 3.2 Fenogram dan jaring haplotipe 52 individu V. salvator yang diuji. Fenogram menggunakan metode NJ model p distance berdasarkan runutan 516 bp nukleotida gen COI. Simbol □: V. salvator
(GenBank) dan : V. bengalensis (GenBank). Nilai butstrap >50 ditunjukkan dengan angka di bawah nodus
Tabel 3.3 Rentang (angka tanpa tanda kurung), rerata (angka dalam tanda kurung) jarak genetik dalam kelompok (pada posisi diagonal) dan jarak genetik antarkelompok (di bagian bawah diagonal) pada V. salvator yang diuji menggunakan metode p distance
Kelompok/ subkelompok n A B1 B2 C A 38 0.0000- 0.0174 (0.0023) B1 5 0.0194-0.0349 (0.0217) 0.0000-0.0058 (0.0023) B2 3 0.0194-0.00426 (0.0278) 0.0116 -0.0310 (0.0203) 0.0058-0.0194 (0.0142) C 5 0.0271-0.0407 (0.0302) 0.0213-0.02.52 (0.0225) 0.0213-0.0388 (0.0291) (0.0000) Outgroup 1 0.1415-0.1550 (0.1443) 0.1473-0.1512 (0.1484) 0.1473-16.09 (0.1537) (0.1434) Keterangan: Kelompok A: V. salvator asal Pulau Sumatera dan Riau Kepulauan, subkelompok
B1: V. salvator asal Pulau Bangka, subkelompok B2: V. salvator asal Pulau Jawa, kelompok C: V. salvator asal Pulau Simeulue, dan outgroup: V. bengalensis. Tabel 3.4 Rerata (angka tanpa tanda kurung) jarak genetik bersih antarkelompok
(di bagian bawah diagonal) pada V. salvator yang diuji menggunakan metode p distance dan faktor koreksi (angka dengan tanda kurung) Kelompok/ subkelompok n A B1 B2 C A 38 B1 5 0.0194 (0.0023) B2 3 0.0195 (0.0083) (0.0083) 0.0120 C 5 0.0290 (0.0012) (0.0012) 0.0213 (0.0071) 0.0220 Outgroup 1 0.1431 (0.0012) (0.0012) 0.1473 (0.0071) 0.1466 (0.0000) 0.1434 Keterangan: Kelompok A: V. salvator asal Pulau Sumatera dan Riau Kepulauan, subkelompok
B1: V. salvator asal Pulau Bangka, subkelompok B2: V. salvator asal Pulau Jawa, kelompok C: V. salvator asal Pulau Simeulue, dan Outgroup: V. bengalensis.
Pembahasan
Keefektifan COI sebagai pengidentifikasi spesies
Rerata keragaman nukleotida dalam kelompok V. salvator yang diteliti tergolong rendah (Tabel 3.3). Rendahnya keragaman genetik pada V. salvator
yang diteliti mungkin disebabkan oleh spesimen yang diuji tergolong dalam kompleks spesies dan gen COI yang dijadikan penanda genetik bersifat konservatif (Lynch dan Jarrell 1993). Hasil studi ini konsisten dengan rerata
keragaman nukleotida dalam spesies-spesies yang tergolong dalam spesies
Rhacophorusdugreiti kompleks sebesar 0.4% (Dang et al. 2015).
Keefektifan gen COI sebagai pengidentifikasi spesies pada V. salvator yang diteliti ditunjukkan oleh fenogram dengan metode NJ dan model p distance
membentuk unit kohesif tunggal (Gambar 3.2). Hasil ini konsisten dengan penelitian sebelumnya yang menyatakan bahwa V. salvator ssp. membentuk klad monofiletik (Ast 2001). Keefektifan penggunaan COI sebagai pengidentifikasi spesies telah diaplikasikan pada vertebrata lain, yaitu pada ikan (Ward et al.
2005), burung (Hebert et al. 2004), dan mamalia, khususnya ordo Cetartiodactyla (Zein dan Fitriana 2012).
Pendugaan taksonomi V. salvator yang berasal dari wilayah Sumatera
Jarak genetik bersih antarkelompok V. salvator yang berasal dari Pulau Sumatera-Riau Kepulauan dengan Pulau Bangka dan Pulau Jawa kurang dari 2% sehingga dianggap sebagai subspesies yang sama, V. s. macromaculatus. Hasil tersebut konsisten dengan studi filogeni fosil yang dikalibrasi pada V. salvator
kompleks, menunjukkan bahwa V. salvator asal Pulau Sumatera, Singapura, Malaysia, dan Myanmar membentuk satu kelompok, yang mengindikasikan bahwa tergolong subspesies yang sama, yaitu V. s. macromaculatus (Welton et al. 2014b). Berdasarkan sejarah geologi, pulau-pulau satelit Sumatera di sebelah timur bagian atas (Riau Kepulauan) hampir selalu bersatu secara geologi dengan Pulau Sumatera dan hingga saat ini masih terhubung dengan estuari yang dangkal (Voris 2000). Oleh karena itu, Riau Kepulauan diduga menjadi stepping stone
bagi penyebaran V. s. macromaculatus dari Semenanjung Malaysia ke Pulau Sumatera (sensu Arida dan Setyawatiningsih 2015). Penyebaran V. s. macromaculatus secara luas terjadi karena subspesies ini memiliki kemampuan berenang menyeberangi laut (Rawlinson et al. 1990, Borden 2007) dan kisaran spesies pakannya yang lebar (De Lisle 2007, Bundhitwongrut et al. 2008, Uyeda 2009, Cota 2011b).
Kelompok V. salvator yang berasal dari Pulau Simeulue memiliki rerata jarak genetik bersih antarkelompok lebih dari 2%, teridentifikasi sebagai kelompok yang terpisah dan paling jauh jarak genetiknya sehingga kelompok tersebut diduga sebagai kandidat spesies baru. Pulau Simeulue tidak pernah terhubung dengan Pulau Sumatera sejak terbentuknya hingga saat ini (Voris 2000). Jarak Pulau Simeulue dengan Pulau Sumatera sekitar 200 km dan terpisah oleh laut dalam mencapai + 5000 m (Kopp et al. 2008). Keterpisahan pulau tersebut dapat menyebabkan isolasi geografis yang memungkinkan terjadinya spesiasi alopatrik. Pola spesiasi alopatrik yang sama terjadi pada kadal terbang,
Draco sp. Simeulue yang teridentifikasi dari studi menggunakan gen pada lokus DNA mitokondria (ND2) dan gen-gen pada lokus DNA inti (CMOS, PNN) pada
Draco sumatranus (Lawalata 2011).
Rerata jarak genetik bersih antarkelompok V. salvator yang berasal dari Pulau Bangka kurang dari 2% dan subkelompok ini terpisah dengan subkelompok
V. salvator yang berasal dari Pulau Jawa sehingga diklasifikasikan sebagai kandidat subspesies baru. Berdasarkan sejarah geologi, kedua pulau ini pernah bersatu dengan Pulau Sumatera, tetapi kemudian terpisah. Kemiripan genetik subkelompok yang berasal dari Pulau Bangka dan Pulau Jawa diduga terkait
dengan sistem drainasi purba pada masa Pleistosen ketika Pulau Bangka berada satu aliran dengan Pulau Jawa di sungai purba Sunda bagian timur (Voris 2000). Hasil yang mirip dijumpai pada studi multilokus filogeni V. salvator kompleks dengan menggunakan gen-gen yang terdapat pada lokus DNA inti (DGL-α, PRLR) dan DNA mitokondria (ND1, ND2) (Welton et al. 2013b).
Simpulan
Gen COI dapat digunakan untuk mengonfirmasi kelompok V. salvator yang berasal dari Pulau Simeulue dan Pulau Bangka sebagai kandidat spesies dan subspesies baru secara berturut-turut. Telaah lebih mendalam diperlukan untuk memvalidasi tingkatan taksanya.