HASIL DAN PEMBAHASAN
X. campestris pv. campestris secara In Vitro
Berdasarkan pengujian keefektifan ekstrak tumbuhan dan kitosan terhadap
Xcc telah didapatkan jenis bahan yang menunjukkan penghambatan terhadap
bakteri Xcc yaitu ekstrak sirih, ekstrak cengkih, dan kitosan dengan konsentrasi masing-masing 2.5%, 5%, dan 0.5%. Oleh karena itu, diujikan lagi 5 taraf konsentrasi dari konsentrasi terendah untuk menguji pengaruh konsentrasi ekstrak terhadap pertumbuhan bakteri.
Tingkat penghambatan yang ditunjukkan ekstrak sirih, cengkih, maupun kitosan terhadap bakteri Xcc menunjukkan perbedaan sangat nyata terhadap kontrol, sedangkan beberapa konsentrasi yang diuji tidak menunjukkan pengaruh yang berbeda. Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi yang rendah, ekstrak
23 tumbuhan dan kitosan sudah mampu untuk menghambat pertumbuhan bakteri
Xcc.
Pada pengujian ini konsentrasi ekstrak sirih 2% mampu menghambat pertumbuhan bakteri Xcc pada media NB sebesar 100% (Tabel 5). Konsentrasi ekstrak sirih 0.5%, 1%, dan 1.5% memberikan tingkat penghambatan lebih dari 99% dengan kepadatan sel Xcc berturut-turut sebesar 2.73x107, 1.63 x102, dan 70 cfu/ml.
Tabel 5 Pengaruh ekstrak sirih terhadap bakteri X. campestris pv. campestris secara in vitro
Konsentrasi (%) Jumlah sel (cfu/ml)a
0 (Kontrol) 2.20 x 1011 a 0.5 2.73 x 107 b 1 1.63 x102 b 1.5 70.00 b 2 0.00 b 2.5 0.00 b P value= 0.000 a
Angka-angka yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata menurut uji BNT 5%
Keefektifan sirih dalam menghambat bakteri ini diduga disebabkan oleh kandungan senyawa yang terkandung oleh sirih yaitu flavonoid, tanin, dan minyak atsiri. Senyawa flavonoid mempunyai sifat sebagai koagulator protein. Senyawa ini akan mengganggu integritas sel bakteri dengan membentuk senyawa kompleks pada permukaan sel bakteri. Tanin merupakan senyawa yang mempunyai mekanisme kerja inaktivasi enzim bakteri (Juliantina et al. 2010). Sifat antibakteri sirih juga pernah diteliti oleh Suppakul et al. (2006) yang mengemukakan bahwa ekstrak sirih memiliki daya hambat pada bakteri S. aureus dan Escherechia coli pada konsentrasi 0.5%.
Senyawa-senyawa yang terkandung dalam minyak atsiri sirih menurut Suppakul et al. (2006) adalah kavikol, allipirokatekol, kavibetol, metil kavikol, metil eugenol, 1.8-sineol, eugenol, kariofilena, dan kadinena. Senyawa-senyawa tersebut bersifat hidrofobik dan menyebabkan peningkatan permeabilitas membran sel bakteri sehingga sel bakteri akan mengalami kerusakan.
Ekstrak cengkih menunjukkan kemampuan penghambatan 100% terhadap pertumbuhan bakteri Xcc pada konsentrasi 3%. Konsentrasi 1% dan 2%
24
memberikan tingkat penghambatan hingga lebih dari 99%, dengan kepadatan koloni berturut-turut 6.43 x 107 cfu/ml dan 1.26 x 102 cfu/ml (Tabel 6).
Tabel 6 Pengaruh ekstrak cengkih terhadap bakteri X. campestris pv. campestris secara in vitro
Konsentrasi (%) Kepadatan sel (cfu/ml)a
0 (Kontrol) 2.20 x 1011 a 1 6.43 x 107 b 2 1.26 x 102 b 3 0.00 b 4 0.00 b 5 0.00 b P value = 0.000 a
Angka-angka yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata menurut uji BNT 5%
Taufik et al. (2011) menyatakan bahwa kemampuan ekstrak cengkih dalam menghambat pertumbuhan bakteri disebabkan karena kandungan minyak atsiri (eugenol) yang tinggi. Karakteristik eugenol yang terpenting sebagai antibakteri yaitu sifat hidrofobisitasnya. Sifat ini mampu masuk ke dalam lapisan lipopolisakarida yang terdapat dalam membran sel bakteri gram negatif dan merusak struktur selnya.
Sifat antibakteri dari minyak atsiri disebabkan karena kandungan gugus hidroksil (-OH) dan karbonil. Senyawa turunan fenol berinteraksi dengan sel bakteri melalui proses adsorpsi yang melibatkan ikatan hidrogen. Pada kadar yang rendah, fenol akan membentuk kompleks protein fenol dengan ikatan yang lemah dan segera mengalami penguraian, diikuti penetrasi fenol ke dalam sel dan menyebabkan presipitasi serta denaturasi protein. Pada kadar tinggi fenol menyebabkan koagulasi protein dan lisisnya sel membran (Parwata & Dewi, 2008).
Taufik et al. (2011) menyatakan bahwa ekstrak cengkih mempunyai aktivitas antibakteri terhadap bakteri Gram positif maupun Gram negatif. Efek antibakteri cengkih ini pernah diteliti oleh Radiastuti et al. (2011) yang menunjukkan bahwa pada konsentrasi 2% ekstrak cengkih mampu menghambat pertumbuhan bakteri B. subtilis dan B. cereus. Pada konsentrasi 4% ekstrak cengkih efektif menghambat pertumbuhan bakteri P. aeruginosa dan E. coli.
25 Kitosan menunjukkan 100% penghambatan terhadap bakteri Xcc secara in
vitro pada konsentrasi 0.5% (Tabel 7). Pada konsentrasi 0.3% dan 0.4%, kitosan
mampu menekan kepadatan sel bakteri dengan sangat baik yang ditunjukkan kepadatan sel yang rendah yaitu masing-masing 60 dan 6.67 cfu/ml.
Tabel 7 Pengaruh kitosan terhadap bakteri X. campestris pv. campestris secara in
vitro
Konsentrasi (%) Kepadatan sel (cfu/ml)a
0 (Kontrol ) 2.20 x1011 a 0.1 2.80 x105 b 0.2 2.53 x104 b 0.3 60.00 b 0.4 6.67 b 0.5 0.00 b P value = 0.002 a
Angka-angka yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata menurut uji BNT 5%
Mekanisme kitosan dalam menekan pertumbuhan bakteri diduga karena kitosan mempunyai polikation bermuatan positif yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri. Mekanisme penghambatan kitosan disebabkan karena adanya interaksi senyawa kitosan dengan senyawa pada permukaan sel bakteri. Senyawa ini akan teradsorbsi membentuk lapisan yang mampu menghambat transportasi nutrisi sel bakteri. Hal ini akan menyebabkan sel bakteri kekurangan nutrisi untuk berkembang sehingga mengakibatkan matinya sel (Wardaniati & Setyaningsih 2011).
Chung et al. (2004) juga menyatakan bahwa sifat antibakteri kitosan erat hubungannya dengan kemampuan adsorbsi kitosan pada permukaan sel, sehingga menyebabkan kebocoran sel bakteri. Hal tersebut diperkuat dengan Penelitian Li
et al. (2010) bahwa mekanisme kerja kitosan berkaitan dengan muatan negatif
pada permukaan sel bakteri yang berinteraksi dengan muatan positif kitosan. Kitosan akan meningkatkan permeabilitas membran luar dan menyebabkan rusaknya membran sel. Kerusakan ini disebabkan oleh adanya interaksi elektrostatik antara –NH3+ dengan kelompok karboril atau fosforil pada komponen fosfolipid pada membran sel.
26
Keefektifan Perlakuan Benih Kubis Menggunakan Sirih dan Cengkih Serta Kitosan terhadap X. campestris pv. campestris
Pengaruh Waktu Perendaman Ekstrak Sirih dan Cengkih Serta Kitosan terhadap Kepadatan Inokulum X. campestris pv. campestris pada Benih
Perlakuan waktu perendaman benih kubis terinfeksi dalam suspensi ekstrak tumbuhan dan kitosan menunjukkan pengaruh berbeda dalam menurunkan jumlah inokulum Xcc pada benih kubis (Tabel 8). Perendaman benih menggunakan ekstrak sirih 2%, cengkih 3%, dan kitosan 0.5% selama 50 menit memberikan hasil terbaik dalam menekan kepadatan inokulum bakteri.
Tabel 8 Kepadatan inokulum X. campestris pv. campestris pada benih kubis setelah perlakuan ekstrak sirih 2%, ekstrak cengkih 3%, dan kitosan 0.5% pada beberapa waktu perendaman
Waktu perendaman (menit)
Kepadatan inokulum (cfu/g benih)a
Sirih Cengkih Kitosan
0 (Kontrol) 7.63x108 a 7.63x108 a 7.63x108 a 10 2.20x104 b 8.67x104 b 2.31x106 b 20 3.00x104 b 4.40x104 c 2.18x106 b 30 7.53x103 c 8.17x104 b 1.51x106 c 40 7.83x103 c 1.77x103 d 8.27x105 d 50 7.87x103 c 2.00x103 d 8.03x105 d
P value sirih= 0.000; P value cengkih= 0.000; P value kitosan= 0.000 a
Angka dalam kolom yang sama yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata menurut uji BNT 5%
Ekstrak sirih dan ekstrak cengkih pada 50 menit perendaman benih mampu menekan jumlah inokulum hingga 99.99% dengan kepadatan inokulum masing-masing 7.87x103 cfu/g dan 2.00x103 cfu/g (Tabel 8). Kitosan juga menunjukkan penekanan terbaik terhadap Xcc pada perendaman 50 menit dengan tingkat penekanan sebesar 99.89%. Kepadatan inokulum Xcc pada perlakuan kitosan adalah 8.03x105 cfu/g, jauh lebih tinggi daripada kepadatan koloni pada perendaman ekstrak sirih dan cengkih. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak cengkih dengan konsentrasi 3% memberikan penghambatan paling baik terhadap pertumbuhan bakteri dibandingkan dengan ekstrak sirih 2% dan kitosan 0.5%.
27 Pengaruh Waktu Perendaman Ekstrak Sirih dan Cengkih Serta Kitosan terhadap Tingkat Infeksi X. campestris pv. campestris pada Benih
Besarnya tingkat infeksi pada benih ini berkaitan dengan tingkat kepadatan inokulum setelah perlakuan. Kepadatan inokulum yang tinggi pada benih cenderung meningkatkan persentase benih terserang. Benih yang terinfeksi Xcc akan menunjukkan gejala layu, kotiledon menghitam, dan tumbuhnya bakteri berwarna kuning pada media NA (Gambar 3).
Waktu perendaman benih juga berpengaruh nyata terhadap tingkat infeksi pada benih. Pengaruh waktu perendaman terhadap tingkat serangan Xcc pada benih ini ditunjukkan oleh ekstrak sirih dan ekstrak cengkih.
Gambar 3 Gejala infeksi X. campestris pv. campestris pada benih. (a) benih sehat; (b) benih terinfeksi.
Pada waktu perendaman benih selama 50 menit, ekstrak sirih dan ekstrak cengkih memberikan penekanan terbaik terhadap tingkat infeksi Xcc. Ekstrak sirih mampu menekan 84% tingkat infeksi, atau hanya 16% benih saja yang masih menunjukkan gejala infeksi. Ekstrak cengkih mampu menekan inokulum Xcc lebih baik daripada ekstrak sirih dan kitosan (Tabel 8). Oleh karena itu cengkih menunjukkan penekanan tingkat infeksi yang lebih tinggi pada benih yaitu sebesar 97.33%, atau hanya 2.67% saja benih yang masih terinfeksi (Tabel 9).
Berbeda dengan ekstrak sirih dan ekstrak cengkih, perendaman benih kubis menggunakan kitosan masih menunjukkan tingkat infeksi yang tinggi pada benih kubis. Waktu perendaman memberikan pengaruh yang tidak konsisten terhadap persentase tingkat infeksi Xcc pada benih.
28
Tabel 9 Tingkat infeksi X. campestris pv. campestris pada benih kubis setelah perlakuan ekstrak sirih 2%, ekstrak cengkih 3%, dan kitosan 0.5% dengan beberapa waktu perendaman
Waktu perendaman (menit)
Tingkat infeksi (%)a
Sirih Cengkih Kitosan
0 (Kontrol) 100.00 a 100.00 a 100.00 a 10 21.33 b 5.33 bc 70.67 b 20 18.67 b 10.67 b 100.00 a 30 25.33 b 12.00 b 60.00 b 40 13.33 b 1.33 c 62.67 b 50 16.00 b 2.67 c 100.00 a
P value sirih= 0.001; P value cengkih= 0.000; P value kitosan= 0.003 a
Angka dalam kolom yang sama yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata menurut uji BNT 5%
Waktu perendaman benih kubis selama 50 menit menggunakan kitosan, berhasil menekan 99.89% inokulum Xcc pada benih akan tetapi inokulum yang masih tertinggal masih tinggi yaitu 105 cfu/g (Tabel 8). Hal ini yang menyebabkan tingkat infeksi pada benih masih tinggi yaitu sebesar 100%. Sesuai dengan estimasi yang dilakukan oleh Robert (2005) bahwa pada benih kubis yang terinfeksi Xcc dengan kepadatan inokulum 105 cfu/g (Tabel 8), mampu menimbulkan penyakit lebih dari 71%. Berbeda dengan kitosan, pada benih yang direndam selama 50 menit menggunakan ekstrak sirih dan ekstrak cengkih mampu menekan 99.99% inokulum, atau hanya 103 cfu/g inokulum yang tersisa (Tabel 8). Hal ini menyebabkan tingkat infeksi pada benih kubis yang direndam ekstrak sirih dan ekstrak cengkih lebih rendah daripada kitosan.
Randhawa dan Schaad (1984) pernah melakukan deteksi Xcc pada benih kubis. Mereka menyatakan bahwa rata-rata tingkat infeksi Xcc pada benih adalah 103cfu/g, kepadatan ini dianggap sebagai infeksi yang tinggi. Benih yang digunakan pada pengujian ini adalah benih yang diinokulasi buatan dengan kepadatan bakteri yang sangat tinggi yaitu sebesar 108cfu/g. Pada benih yang terinfeksi secara alami dengan kandungan Xcc yang lebih rendah, perlakuan ekstrak sirih, ekstrak cengkih, dan kitosan diduga akan mampu mengeliminasi Xcc pada benih.
29 Pengaruh Waktu Perendaman Ekstrak Sirih dan Cengkih Serta Kitosan terhadap Viabilitas Benih
Pengujian perkecambahan benih ini penting untuk dilakukan karena prinsip dalam penerapan perlakuan karantina adalah harus memberikan penekanan yang baik terhadap patogen tanpa merusak kualitas dari komoditas benih. Analisis ragam terhadap data perkecambahan benih menunjukkan adanya perbedaan pengaruh waktu perendaman terhadap tingkat perkecambahan benih kecuali pada ekstrak cengkih (Tabel 10).
Pada ekstrak sirih dan kitosan terjadi kecenderungan peningkatan perkecambahan benih seiring ditambahnya waktu perendaman. Waktu perendaman selama 50 menit memberikan angka persentase perkecambahan tertinggi. Demikian pula pada perlakuan ekstrak cengkih, meskipun waktu perendaman tidak menunjukkan pengaruh terhadap perkecambahan benih kubis, tetapi pada perendaman selama 50 menit juga memberikan persentase perkecambahan tertinggi yaitu 97%.
Tabel 10 Tingkat perkecambahan kubis setelah perlakuan ekstrak sirih 2%, ekstrak cengkih 3%, dan kitosan 0.5% dengan beberapa waktu perendaman
Waktu perendaman (menit)
Tingkat perkecambahan (%)a
Sirih Cengkih Kitosan
0 (Kontrol) 94.33 c 94.33 a 94.33 c 10 97.33 ab 96.33 a 94.67 bc 20 98.33 a 95.67 a 98.33 a 30 99.33 a 95.67 a 97.33 ab 40 95.67 bc 94.33 a 98.67 a 50 99.39 a 97.00 a 98.33 a
P value sirih= 0.002; P value cengkih= 0.292; P value kitosan= 0.012 a
Angka dalam kolom yang sama yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata menurut uji BNT 5%
Pada pengujian viabilitas benih ini, tingkat perkecambahan benih kubis pada kontrol paling rendah yaitu 94.33%. Hal ini disebabkan tingginya inokulum Xcc pada kontrol, karena tidak adanya aktivitas penghambatan terhadap infeksi Xcc seperti halnya pada perlakuan ekstrak tumbuhan dan kitosan. Kamil (1979) menyatakan bahwa benih akan mampu berkecambah apabila kebutuhan akan air,
30
suhu, udara, dan cahaya bisa terpenuhi dengan baik. Akan tetapi, keberadaan suatu patogen pada benih akan menyebabkan gangguan dalam perkecambahan.
Penurunan jumlah inokulum setelah perlakuan ekstrak tumbuhan dan kitosan berpengaruh pada peningkatan persentase perkecambahan benih. Selain pengaruh kepadatan inokulum, peningkatan persentase perkecambahan pada perlakuan kitosan diduga karena kitosan mampu memberikan induksi ketahanan terhadap tanaman. Hal ini sesuai dengan penelitian Awadalla dan Mahmoud (2005) bahwa perlakuan seed coating dengan kitosan pada benih kapas mampu menurunkan serangan Fusarium oxysporum sekaligus meningkatkan kadar fitoaleksin. Peningkatan fitoaleksin ini berpengaruh terhadap peningkatan ketahanan tanaman.
Perlakuan perendaman benih menggunakan ekstrak sirih, ekstrak cengkih, dan kitosan selama 50 menit tetap memberikan perkecambahan benih yang tinggi yaitu 99.39%, 97%, dan 98.33%. Kamil (1979) menyatakan bahwa benih dikatakan mempunyai mutu yang baik apabila tingkat perkecambahan benihnya lebih dari 80%. Hal ini membuktikan bahwa perlakuan ekstrak tanaman dan kitosan tidak menimbulkan kemunduran kualitas benih kubis yang ditunjukkkan oleh tingkat perkecambahan yang tinggi yaitu lebih dari 80%.
Aplikasi Ekstrak Tumbuhan dan Kitosan untuk Perlakuan Karantina Beberapa jenis perlakuan yang direkomendasikan sebagai tindakan karantina antara lain fumigasi, pestisida kimia, irradiasi, perlakuan pendinginan, pemanasan, udara panas, frekuensi radio, dan pengelolaan atmosfer (Sharp & Hallman 1994). Namun, tidak menutup kemungkinan suatu perlakuan baru dikembangkan sebagai teknik perlakuan karantina. Pada ISPM No. 28 disebutkan bahwa perlakuan dapat digunakan sebagai perlakuan karantina apabila tingkat efikasinya memenuhi standar dan dapat didukung dengan data ilmiah.
Prinsip dasar dalam perlakuan karantina adalah kemampuan dalam membebaskan atau menurunkan tingkat infeksi suatu OPT pada tingkat tertentu dan tidak menimbulkan kerusakan pada komoditas yang dikirim. Pada ISPM No. 1 disebutkan bahwa prinsip dasar dalam pelaksanaan fitosanitari diantaranya adalah pengelolaan resiko, dampak minimum, dan ekivalensi.
31 Perlakuan karantina merupakan salah satu bagian dari manajemen resiko, yaitu pemanfaatan ilmu pengetahuan untuk mengurangi terjadinya risiko akibat masuk dan menyebarnya OPT. Perlakuan karantina juga diharapkan mempunyai dampak minimum terhadap perdagangan maupun lingkungan. Prinsip ekivalensi dapat diartikan bahwa metode berbeda yang dapat memberikan hasil yang sama dan dapat dipertanggungjawabkan secara ilmiah, maka metode tersebut dapat diterima sebagai alternatif perlakuan karantina.
Perlakuan benih menggunakan bahan alami seperti ekstrak sirih, ekstrak cengkih, dan kitosan mampu memberikan penghambatan yang baik terhadap tingkat infeksi Xcc pada benih kubis tanpa menimbulkan penurunan kualitas benih. Hal ini menjadi informasi yang penting bagi karantina dalam mengembangkan metode perlakuan karantina berbasis bahan alami dalam manajemen resiko suatu OPT yang mudah, aman, dan relevan terhadap perdagangan internasional.
32