BAB III METODE PENELITIAN
H. Alat dan Bahan Penelitian
I. Cara Kerja
1. Dosis jus buah semangka.
Dosis yang dicobakan diberikan dengan 2 interval yaitu 100%, 200%, maka dosis yang digunakan dengan perincian sebagai berikut :
a. Untuk dosis I (100%), diperoleh sebagai berikut :
Dosis likopen yang disarankan untuk dikonsumsi manusia adalah 6 mg per hari (Giovannucci et al., 1995). Menurut Arab dan Steck (2000), setiap 100 gr buah semangka mengandung 4 mg likopen, maka
commit to user
dosis buah semangka yang dikonsumsi adalah 150 gr per hari. Dosis tersebut dikonversikan pada tikus putih dengan faktor konversi 0,018, maka dosis buah semangka yang diberikan :
= Berat semangka merah x faktor konversi = 150 gr/70 kg BB manusia x 0,018 = 2,7 gr/200 gr BB tikus putih = 13,5 gr/kg BB tikus putih
Mengingat kapasitas lambung tikus putih maksimal 5 ml, maka peneliti memberikan dosis 2,7 gr/hari tersebut dalam 2 ml/hari (Ngatidjan, 1991). Untuk memperoleh buah semangka dosis 2,7 gr/200 gr BB tikus putih dalam 2 ml larutan, maka dilakukan pengenceran dengan menggunakan aquades hingga didapatkan larutan sebanyak 100 ml, sehingga semangka yang dibutuhkan sebanyak:
x gr 2,7 gr x = 135 gr
100 ml 2 ml
b. Dosis II adalah 200% dari dosis I, yaitu 5,4 gr/200 gr BB tikus putih (4 ml)
Jadi jus buah semangka yang diberikan secara oral pada 1 ekor tikus putih (200 gram) = 2 ml, dan 4 ml yang diberikan selama 14 hari berturut-turut.
Di luar jadwal perlakuan, tikus putih diberi makan pelet dan minum air PAM ad libitum.
commit to user 2. Dosis dan pengenceran Parasetamol.
Dosis Parasetamol yang diketahui dapat menyebabkan kematian pada 50% tikus dari satu kelompok tikus percobaan (LD50) adalah 1944 mg/kg BB (Alberta, 2006).
Pada penelitian ini dipakai ¾ dosis di atas, yaitu 1944 mg/kg BB x 0,75 = 1458 mg/kg BB = 291,6 mg/200 gr BB tikus putih, kemudian dihitung pelarut air seperti berikut:
Parasetamol 500 mg dilarutkan dalam aquades hingga 1,71 ml, sehingga dalam 1 ml larutan parasetamol mengandung 291,6 mg parasetamol.
Parasetamol diberikan selama 3 hari berturut-turut yaitu pada hari ke-12, 13, dan 14. Pemberian parasetamol dengan cara ini dimaksudkan untuk menimbulkan kerusakan berupa nekrosis pada sel epitel tubulus proksimal di daerah pars konvulata korteks ginjal tanpa menimbulkan kematian pada tikus putih.
500 = 291,6 x = 1,71 ml
commit to user 3. Persiapan Tikus Putih.
Tikus putih diadaptasikan selama tujuh hari di Laboratorium Histologi, Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret, Surakarta. Sesudah adaptasi, keesokan harinya dilakukan penimbangan untuk menentukan dosis dan dilakukan perlakuan.
4. Pengelompokan Subjek.
Pada minggu kedua mulai dilakukan percobaan. Subjek
dikelompokkan menjadi empat kelompok secara random, dan masing-masing kelompok terdiri dari 7 tikus putih. Adapun pengelompokan subjek adalah sebagai berikut:
a. K : Kelompok kontrol diberi aquadest peroral sebanyak 2 ml/200 gr BB tikus putih setiap hari selama 14 hari berturut-turut dan 1 ml/200 gr BB tikus putih pada hari ke-12, 13, dan 14.
b. P1 : Kelompok perlakuan 1 diberi aquades peroral sebanyak 2 ml/200 gr BB tikus putih setiap hari selama 14 hari berturut-turut dan pada hari ke 12, 13 dan 14 juga diberi parasetamol dosis 291,6 mg/200 gr BB tikus putih peroral perhari.
c. P2 : Kelompok perlakuan 2 diberi jus buah semangka merah peroral dosis I yaitu 2,7 gr semangka/200 gr BB tikus putih selama 14 hari berturut-turut, dimana hari ke-12, 13 dan 14 diberikan juga parasetamol dosis 291,6 mg/200 gr BB tikus putih setelah 1 jam pemberian jus buah semangka merah.
commit to user
d. P3 : Kelompok perlakuan 3 diberi jus buah semangka merah dosis II peroral yaitu 5,4 gr semangka/200 gr BB tikus putih selama 14 hari berturut-turut, dimana hari ke-12, 13 dan 14 diberikan juga parasetamol dosis 291,6 mg/200 gr BB tikus putih setelah 1 jam pemberian jus buah semangka merah.
Setiap sebelum pemberian parasetamol dan jus buah semangka merah, tikus putih dipuasakan dahulu ± 5 jam untuk mengosongkan lambung. Pemberian parasetamol dilakukan ± 1 jam setelah pemberian jus buah semangka merah agar terabsorbsi terlebih dahulu.
commit to user 28 ekor tikus putih
1 ml parasetamol dosis 291,6 mg/200 gr BB pada hari ke-12, 13, dan 14
Perlakuan sampai hari ke-14. Pembuatan preparat ginjal hari ke-15. 5. Pemberian Perlakuan.
Gambar 3. Skema Langkah-Langkah Penelitian. Kelompok kontrol Kelompok perlakuan 1 Kelompok perlakuan 2 Kelompok perlakuan 3
Dipuasakan selama + 5 jam
Aquades 2 ml 2 ml jus buah semangka merah dosis 2,7 gr semangka/200 gr BB tikus putih 4 ml jus buah semangka merah Dosis 5,4 gr semangka/200 gr BB tikus putih Setelah + 1 jam Aquades 1 ml
commit to user 6. Pengukuran Hasil.
Pada hari ke-15 setelah perlakuan diberikan, semua hewan percobaan dikorbankan dengan cara neck dislocation. Hal ini dilakukan pada hari ke-15 agar efek dari perlakuan masih tampak nyata. Setiap tikus putih diambil ginjal kanan dan kiri (untuk keseragaman), kemudian dibuat masing- masing 2 irisan secara frontal pada daerah pertengahan ginjal (untuk keseragaman) dengan ketebalan tiap irisan ginjal + 5–7 µm. Jarak antara irisan yang satu dengan yang lain kira-kira 25 irisan. Preparat ginjal dibuat dengan metode blok parafin dengan pengecatan Hematoksilin Eosin (HE). Masing-masing ginjal diambil salah satu preparat dari 2 irisan tersebut secara acak untuk dilakukan pengamatan.
Pengamatan preparat jaringan ginjal mula-mula dilakukan dengan perbesaran 100 kali untuk mengamati seluruh bagian irisan, kemudian ditentukan tubulus proksimal yang terletak pada pars konvulata korteks ginjal. Pengamatan dilanjutkan dengan perbesaran 400 kali untuk mengamati inti sel epitel tubulus proksimal ginjal. Pengamatan dilakukan dengan perbesaran 1000 kali untuk melihat inti sel yang pyknosis,
karyorrhexis dan karyolysis dari tiap 100 dengan lebih jelas.
Pengamatan dilakukan pada tubulus proksimal ginjal karena pada tubulus proksimal terjadi absorpsi dan sekresi aktif serta kadar sitokrom P450 lebih tinggi untuk mendetoksifikasi atau mengaktifkan toksikan sehingga lebih mudah untuk mengalami kerusakan.
commit to user
Untuk mengetahui sel-sel epitel tubulus proksimal yang mengalami kerusakan maka dari tiap irisan ditentukan 1 daerah di pars konvulata korteks ginjal kemudian pada tiap daerah tersebut dihitung jumlah sel epitel tubulus proksimal yang mengalami kerusakan dari tiap 50 sel epitel tubulus proksimal yang ada di daerah tersebut (50 sel pada irisan ginjal kanan dan 50 sel pada irisan ginjal kiri). Sel dengan inti pyknosis,
karyorrhexis, dan karyolysis masing- masing diberi skor 1. Jika pada suatu daerah di pars konvulata korteks ginjal terdapat 20 sel epitel tubulus proksimal dengan inti pyknosis, 10 sel dengan inti karyorrhexis, dan 5 sel dengan inti karyolysis, maka skor kerusakan histologis pada daerah tersebut adalah 20 + 10 + 5 = 35. Setiap kelompok tikus putih mempunyai jumlah total 7 poin kerusakan histologis (jumlah tikus putih tiap kelompok 7 ekor dan merupakan penjumlahan hasil hitung poin kerusakan ginjal kiri serta ginjal kanan). Nilai skor kerusakan histologis ini kemudian dianalisis secara statistik.