BAB III METODE PENELITIAN
3.7 Cara kerja penelitian
3.7.1 Ekstraksi DaunAglaia ellipticaBlume dengan Maserasi
Metode ekstraksi dilakukan secara maserasi. Simplisia yang sudah berbentuk serbuk kering ditimbang sebanyak 2000 g dan dimasukkan kedalam bejana maserasi (terlindung dari cahaya). Kemudian dimaserasi selama 2 hari dengan menggunakan pelarut metanol yang sebelumnya sudah didestilasi. Selama proses maserasi dilakukan pengocokan sekali sehari agar pelarut masuk ke seluruh permukaan serbuk simplisia dan meratakan konsentrasi larutan. Perendaman dilakukan sampai filtrat mendekati bening.24
Selanjutnya, hasil rendaman disaring dengan menggunakan kertas saring untuk memisahkan filtrat dan ampasnya. Ampasnya diambil dan direndam kembali menggunakan metanol untuk mengulangi proses maserasi selama 2 hari. Selanjutnya filtrat dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu 450C hingga didapatkan ekstrak kental metanol daun Aglaia elliptica Blume. Ekstrak yang sudah kental kemudian dimasukkan ke dalam cawan penguap. Kemudian ekstrak kental dalam cawan penguap dioven dengan suhu 450C selama tiga hari untuk memastikan ekstrak bebas dari pelarut metanol. Selanjutnya, ekstrak yang sudah bebas dari pelarut metanol ditutup denganaluminium foil dan diletakkan di dalam refrigerator. Hasil akhir didapatkan ekstrak kental metanol daunAglaia ellipticaBlume sebanyak 50 gram. Setelah didapatkan ekstrak kental metanol daun Aglaia elliptica Blume, kemudian dilakukan penghitungan persentase rendaman.
3.7.2 Penetasan Larva Udang
Wadah plastik berbentuk kotak disiapkan untuk penetasan telur udang. Wadah yang diperlukan sebanyak dua buah. Satu wadah dibagi menjadi dua bagian, yaitu ruang terang dan ruang gelap. Kedua bagian tersebut dibatasi dengan
sterofoam. Pada bawah sterofoam dilubangi sebagai tempat keluarnya telur yang telah menetas.25
Sejumlah 1 liter air laut dimasukkan ke dalam wadah hingga kedua lubang pada sterofoam terendam. Air laut yang digunakan terlebih dahulu diukur pH dengan kertas lakmus, pH yang digunakan berkisar 8-9.3,25
Kemudian salah satu ruang dalam wadah tersebut diberi penerangan dengan cahaya lampu pijar untuk menghangatkan suhu dalam wadah penetasan dan merangasang proses penetasan. Untuk penerangan, lampu dinyalakan selama 24 jam untuk menetaskan telur. Ruangan yang satunya diisi 1 gram telur udang kemudian ditutup dengan aluminium foil dan lakban agar tidak terkena cahaya lampu.25
Setelah 24 jam, telur akan menetas menjadi larva dan akan bergerak secara alamiah menuju ruang terang. Kemudian larva yang sehat dan aktif bergerak dipindahkan ke wadah satunya dengan keadaan yang sama (air laut dengan pH berkisar 8-9 dan seluruh bagian wadah terkena cahaya lampu pijar). Setelah 24 jam kemudian, larva sudah berumur 48 jam. Larva yang digunakan untuk hewan uji pada metode BSLT adalah larva yang sudah berumur 48 jam, aktif bergerak dan bersifat fototropik.3,25
3.7.3 Pembuatan Konsentrasi Ekstrak yang Diuji
Dalam pembuatan konsentrasi ekstrak yang efektif untuk membunuh larva
Artemia salina Leach, dilakukan trial atau orientasi dengan konsentrasi ekstrak sebesar 500 ppm, 250 ppm, 125 ppm, 50 ppm, 25 ppm, dan 12,5 ppm.
Ekstrak kental metanol daun Aglaia elliptica Blume ditimbang dengan menggunakan neraca analitik hingga mencapai berat 2000 mg. Ekstrak kental tersebut dimasukkan ke dalam tabung Erlenmeyer kemudian dilarutkan dengan DMSO 2% sebanyak 2 ml.
22
Selanjutnya, diaduk dan ditambah akuades sebanyak 98 ml secara perlahan sehingga di dalam tabungErlenmeyerterdapat 100 ml larutan dengan konsentrasi 20.000 ppm, konsentrasi ini yang digunakan sebagai larutan induk.
Kemudian membuat larutan uji dengan konsentrasi 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm, 50 ppm dan 25 ppm, dengan menggunakan rumus pengenceran :
V1M1=V2M2 Keterangan : V1 = Volume awal M1 = Konsentrasi awal M2 = Konsentrasi akhir V2 = Volume akhir
Konsentrasi tersebut masing-masing akan menjadi sebesar ½ dari konsentrasi awal karena di dalam microplate sudah terdapat air laut sebanyak 1 ml, sehingga di dalam microplate terdapat 2 ml larutan yang berasal dari air laut sebanyak 1 ml dan larutan konsentrasi awal sebanyak 1 ml.
Dari tindakan tersebut didapatkan konsentrasi akhir masing-masing sebesar 500 ppm, 250 ppm, 125 ppm, 25 ppm, dan 12,5 ppm yang ada di dalam
microplate.
3.7.4 Prosedur Uji Toksisitas dengan Metode BSLT
Pada uji BSLT digunakan microplate yang berisi 24 sumur. Langkah pertama yang dilakukan adalah membagi 6 kelompok sumur untuk masing – masing konsentrasi dan satu kelompok sumur untuk kontrol negatif (air laut). Percobaan ini dilakukan pengulangan 3 kali (triplo) sehingga masing – masing perlakuan mendapatkan 3 sumur.
Sebagian larva Artemia salina Leach berumur 48 jam dan masih bergerak aktif dipindahkan ke dalam cawan petri. Untuk memudahkan pengamatan dan perhitungan larva dapat menggunakan lup. Pada masing-masing sumur, dimasukkan 10 larva udang menggunakan pipet tetes dan dicampur 1 ml air laut yang terlebih dahulu diukur pHnya.
Setelah itu, pada setiap sumur diteteskan sebanyak 1 ml masing-masing konsentrasi kecuali pada kontrol negatif yang dimasukkan adalah 1 ml air laut. Sehingga volume dalam 1 sumur menjadi 2 ml yaitu 1 ml ekstrak dan 1 ml air laut.
Microplate dibiarkan di udara terbuka selama 24 jam. Setelah 24 jam, kemudian dihitung jumlah larva yang masih hidup pada masing-masing tabung reaksi. Kriteria standar untuk mengukur kematian larva udang yaitu apabila larva udang tidak menunjukkan pergerakan selama beberapa detik pengamatan.
Perhitungan secara manual yaitu dengan mengamati larva di dalam tabung reaksi dengan bantuan lup, kemudian diamati dalam kaca arloji dengan bantuan cahaya. Jumlah larva yang mati dihitung dengan mengurangkan jumlah total larva pada tiap konsentrasi dengan jumlah larva yang masih hidup.
Tabel 3.1 Ilustrasi Konsentrasi Ekstrak padamicroplate
1 ml ekstrak 250 ppm + 1 ml air laut 1 ml ekstrak 250 ppm + 1 ml air laut 1 ml ekstrak 250 ppm + 1 ml air laut 1 ml ekstrak 100 ppm + 1 ml air laut 1 ml ekstrak 100 ppm + 1 ml air laut 1 ml ekstrak 100 ppm + 1 ml air laut 1 ml ekstrak 50 ppm + 1 ml air laut 1 ml ekstrak 50 ppm + 1 ml air laut 1 ml ekstrak 50 ppm + 1 ml air laut 1 ml ekstrak 25 ppm + 1 ml air laut 1 ml ekstrak 25 ppm + 1 ml air laut 1 ml ekstrak 25 ppm + 1 ml air laut 2 ml air laut 2 ml air laut 2 ml air laut 1 ml ekstrak 1000 ppm + 1 ml air laut 1 ml ekstrak 1000 ppm + 1 ml air laut 1 ml ekstrak 1000 ppm + 1 ml air laut 1 ml ekstrak 500 ppm + 1 ml air laut 1 ml ekstrak 500 ppm + 1 ml air laut 1 ml ekstrak 500 ppm + 1 ml air laut
24
