BAB III METODOLOGI PENELITIAN
3.4 Cara Kerja Penelitian
Alat dan bahan yang digunakan untuk persiapan kandang adalah sarung tangan, masker, jas lab, kandang plastik 26 buah, sekam secukupnya, kotak makan 26 buah, pakan secukupnya, penutup kandang (kawat), batu pengganjal, botol
minum 52 buah, air keran secukupnya, dan label 26 buah.
Pertama kandang plastik dipersiapkan, kemudian kandang diisi dengan sekam sebagai alasnya. Di dalam kandang harus disediakan kotak makan yang sudah diisi pakan untuk makanan tikus. Tiap kandang harus ditutup dengan penutup kandang yang terbuat dari kawat, lalu ditindih lagi dengan batu agar penutup kandang tidak mudah terbuka. Botol minum yang sudah diisi penuh dengan air keran juga diletakkan di atas kandang untuk minuman tikus. Dan terakhir,
diberikan label di bagian luar kandang mulai dari 1 – 26 untuk mempermudah
penelitian.
3.4.2 Adaptasi Tikus
Tiap kandangnya dapat diisi 3 – 4 tikus. Adaptasi dilakukan di animal house
selama 2 minggu. Selama di periode adaptasi ini, tikus harus dicek makanan dan minumannya. Satu wadah makanan berisi pakan yang dapat mencukupi kebutuhan 3 ekor tikus dalam 1 hari. Untuk minumannya, disediakan 2 botol
penuh yang harus diisi untuk mencukupi kebutuhannya. Sekam diganti 2 – 3
hari sekali agar kotoran maupun urin tikusnya tidak terlalu menumpuk. Lingkungan kandang harus bebas dari polusi baik itu polusi udara maupun polusi suara. Suara yang terlalu bising dapat membuat tikus stres yang nantinya dapat sangat mempengaruhi hasil dari penelitian.
3.4.3 Penyuntikan Streptozotosin (STZ)
Alat dan bahan yang digunakan untuk melakukan penyuntikkan streptozotosin
adalah STZ dosis 55 mg/kgBB, buffer citrate pH 4.5, spuit 1 cc, toples, kapas,
22
tikus yang akan dibuat diabetes dicek glukosa darah nya dengan glukometer dan dipuasakan selama kurang lebih 4 jam.
Pertama adalah dibuatnya toples bius. Kapas secukupnya dimasukkan kedalam toples. Lalu kapas dibasahi dengan eter secukupnya. Jangan biarkan kapas alkohol terlalu lama terbuka dan terpapar udara, segera tutup toples, karena alkohol mudah menguap.
Kemudian tikus dibius dengan memasukkannya ke dalam toples bius. Biarkan tikus beberapa saat di dalam toples. Jika tikus sudah terlihat lemas, segera keluarkan tikus agar tikus tidak mati. Lalu STZ disuntikkan secara intraperitoneal dengan dosis 55 mg/kgBB. Sukrosa 10% diberikan secara sonde setelah penyuntikkan STZ untuk menghindari hipoglikemia berlebihan.
3.4.4 Proses Ekstraksi Daun Yacon
Alat dan bahan yang digunakan dalam proses ekstraksi daun yacon adalah
daun yacon, blender, alat pengayak, ethanol 70%, hot plate stirer, dan
saringan mikro.
Pertama, daun yacon disiapkan secukupnya. Kemudian daun yacon tersebut
dihaluskan dengan menggunakan blender, dan agar lebih halus lagi dilanjutkan
dengan pengayakan, hingga didapatkan serbuk yacon. Serbuk yacon ini
kemudian di larutkan dalam ethanol 70% dengan perbandingan 10 mg serbuk
yacon dalam 100 ml ethanol 70%. Larutan yacon-ethanol diaduk menggunakan
hot plate stirer selama 5 jam. Setelah itu larutan disaring menggunakan saringan mikro. Kini bentuk dari daun yacon telah berubah menjadi ekstrak yacon cair. Ekstrak yacon cair ini perlu di evaporasi agar didapatkan ekstrak yacon kering dalam bentuk serbuk. Proses evaporasi dilakukan di PAU Institut Pertanian Bogor (IPB).
3.4.5 Pembuatan Ekstrak
Alat dan bahan yang digunakan untuk pembuatan ekstrak adalah yacon
(sediaan serbuk), neraca analitik, kertas perkamen, sendok pengaduk, tabung valcon 2 buah, akuades 300 cc untuk tiap tabungnya, dan vortex.
Kertas perkamen ditaruh di atas timbangan (neraca analitik) terlebih dahulu.
serbuk diambil dengan menggunakan sendok dan ditaruh diatas kertas perkamen, sampai angka di neraca menunjukkan angka yang dibutuhkan.
Serbuk yacon yang sudah ditimbang dimasukkan ke dalam tabung valcon yang
telah berisi akuades steril sesuai dengan perhitungan. Lalu isi tabung valcon tersebut diaduk sampai rata menggunakan vortex.
Perhitungan pembuatan ekstrak yacon dosis 100 mg :
� � � = � / ��� = ��� � = � � = � �
Jumlah tikus x BB rata-rata x ketentuan dosis = Jumlah ekstrak
20 tikus x 300 mg x �� ��
=
600 mg � , = 6 � � � = 6 � � , � � = 6Jadi untuk membuat ekstrak yacon 100 mg/0,1ml/kgBB untuk 20 tikus dengan
rata-rata BB 300 mg, dibutuhkan 600 mg yang dilarutkan dalam 6 ml akuades steril.
Perhitungan pembuatan ekstrak yacon dosis 300 mg :
� � � = 3 � / ��� = 3 ���� = 3 � � = 3 � �
Jumlah tikus x BB rata-rata x ketentuan dosis = Jumlah ekstrak
20 tikus x 300 mg x 3 �� ��
=
1800 mg 3 � , = 8 � � � = 8 � � , 3 � � = 623
Jadi untuk membuat ekstrak yacon 300 mg/0,1ml/kgBB untuk 20 tikus dengan
rata-rata BB 300mg, dibutuhkan 1800 mg yang dilarutkan dalam 6 ml akuades steril.
3.4.6 Pemberian Ekstrak
Alat dan bahan yang digunakan dalam pemberian ekstrak adalah ekstrak yacon
100 mg, ekstrak yacon 300 mg, sarung tangan, sarung tangan tebal, spuit 1 cc
dua buah, dan sonde bengkok.
Ekstrak yacon diberikan satu kali setiap harinya selama 28 hari. Setiap akan
dilakukan pemberian ekstrak, sarung tangan dan sarung tangan tebal harus digunakan kedua-duanya untuk mencegah tercakarnya tangan peneliti akibat tikus yang memberontak. Dengan menggunakan spuit 1 cc dan sonde
bengkok, ekstrak yacon diambil dari tabung valcon. Ekstrak yang diambil
harus disesuaikan dengan berat tikus. Berikut perhitungannya :
Yacoon 100 = 100 mg/kgBB = 100 mg/1000 gramBB = 10 mg/100 gramBB Jadi untuk tikus dengan berat 100 gram dibutuhkan 10 mg yacoon. Karena 100
mg yacon sebanding dengan 0,1 ml, maka untuk tikus dengan BB 100 gram
dibutuhkan 0,01 cc ekstrak yacon.
Contoh : berat tikus 300 gram ekstrak yang diberikan 0,03 cc
Ekstrak di sonde melalui mulut tikus secara perlahan namun tanpa melukai tikus dan tidak mencekik tikus.
3.4.7 Pengukuran Berat Badan
Alat dan bahan yang digunakan dalam pengukuran berat badan adalah neraca digital, gelas plastik besar, sarung tangan, sarung tangan tebal, kertas koran, dan alat tulis.
Setiap hari hingga hari 28, BB tikus ditimbang dengan menggunakan timbangan (neraca digital) dan bantuan gelas plastik besar (tikus dimasukkan ke dalam gelas plastik agar lebih mudah dilakukan pengukuran). Selama melakukan pengukuran, sarung tangan dan sarung tangan tebal harus digunakan untuk menghindari luka akibat cakaran tikus. Timbangan dialasi
dengan kertas koran untuk menjaga kebersihan. Angka yang ditunjukkan di neraca merupakan hasil pengukuran beratnya.
3.4.8 Pengukuran Glukosa Darah
Alat dan bahan yang digunakan dalam pengukuran glukosa darah adalah sarung tangan, sarung tangan tebal, silet, swab alkohol, korek api, glukometer merk easy touch, glukostrip, toples bius eter, kertas koran (alas), dan alat tulis.
Pengukuran GDS dilakukan satu kali tiap minggunya selama 28 hari. Selain memakai sarung tangan, sarung tangan tebal juga harus dipakai. Pertama tikus dimasukkan ke dalam toples eter untuk dibius, tunggu beberapa saat sampai tikus terlihat lemas. Kemudian tikus dikeluarkan dan diletakkan di atas alas koran. Karena yang akan digunakan untuk dicek GDSnya adalah darah ekor, maka daerah ekor dibersihkan dengan menggunakan swab alkohol. Lalu ekor tikus digores sedikit darah keluar. Tetesan darah ditempelkan pada glukostrip dan hasil GDSnya dicek dengan glukometer. Bekas goresan dibersihkan dengan swab alkohol lalu ekor sedikit dibakar menggunakan korek api untuk menghentikan perdarahannya.
3.4.9 Pengambilan Sampel Plasma
Alat dan bahan yang digunakan dalam pengambilan sampel plasma adalah spuit 3 cc, tabung EDTA, sentrifuge makro, mikropipet 100, tip biru, tube eppendorf, dan kulkas -80°C.
Sejumlah darah tikus diambil dari vena cava inferior menggunakan spuit 3 cc. Kemudian darahnya dimasukkan ke tabung EDTA. Tabung EDTA selanjutnya dimasukkan ke dalam sentrifuge dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Setelah itu, supernatannya diambil dengan menggunakan mikropipet dan dipindahkan ke tube eppendorf. Plasma dapat disimpan didalam kulkas dengan suhu -80°C.
25
3.4.10 Pengukuran Kolesterol
Alat dan bahan yang digunakan dalam pengukuran kolesterol adalah plasma
10 μL dari tiap sampel, kit kolesterol Sclavo, autoklaf, tabung reaksi 25 buah,
akuades 10 μL, mikropipet 100 dan 10, tip kuning 1 box, tip biru 1 box, kuvet
2 buah, beker glass 1 buah, alat spektrofotometer, dan label.
Pertama plasma 10 μL disiapkan di tube eppendorf dan pastikan alat-alat yang
akan digunakan sudah di autoklaf sebelumnya. Tabung reaksi sebanyak 25 buah disusun berderet dan sudah diberi label (nama sampel) agar tidak tertukar dan memudahkan peneliti. Kolesterol reagent (ada dari kit kolesterol)
dimasukkan ke semua tabung reaksi sebanyak 1000 μL. Kemudian sampel
(plasma) 10 μL dimasukkan ke dalam tabung reaksi, begitu juga dengan kontrol positif (ada dari kit kolesterol) dan blanko (akuades) dengan jumlah
sama, 10 μL. Kemudian tabung reaksi diinkubasi dalam suhu ruangan (37°C)
selama 10 menit.
Setelah inkubasi selesai, campuran sampel + reagent di dalam tabung reaksi dimasukkan ke dalam kuvet menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke spektrofotometer. Hal ini juga dilakukan pada campuran kontrol+reagent dan blanko + reagent. Hasil absorbansinya akan terlihat pada spektrofotometer.