BAB III. METODE PENELITIAN
C. Cara Kerja / Prosedur Penelitian
1. Preparasi Sampel Pennisetum purpureum dan Hibiscus tiliaceus L.
Sampel rumput kolonjono (Pennisetum purpureum) dipotong dari Kebun Koleksi Hijauan, BPPTK LIPI Yogyakarta pada umur + 60 hari setelah penanaman, kemudian dicacah dengan ukuran 3–5 cm. Sampel daun Hibiscus tiliaceus L. dikoleksi dari beberapa pohon Hibiscus tiliaceus L. yang tumbuh di Kec. Playen, Kab. Gunungkidul, D.I. Yogyakarta yang sebelumnya telah diidentifikasi sebagai Hibiscus tiliaceus L. Sampel daun Hibiscus tiliaceus L. dipisahkan dari batangnya, kemudian dicacah dengan ukuran 3–5 cm juga, kemudian bersama-sama dengan sampel rumput kolonjono dikeringkan dalam oven 55 – 60º C selama 72 jam. Setelah sampel kering dan beratnya konstan, selanjutnya digiling menggunakan blender kemudian disaring dengan saringan 1 mm. Kemudian, dilakukan analisa proksimat komponen bahan dan kadar saponin. Sampel selanjutnya dipergunakan untuk percobaan in vitro.
2. Analisis Proksimat Bahan
Analisa proksimat komposisi kimia bahan mencakup kadar air, kadar abu, kadar protein, lemak, serat kasar, dan karbohidrat dianalisakan di Lab. Chem-mix Pratama, Yogyakarta.
3. Analisis Kandungan Saponin pada Daun Hibiscus tiliaceus L.
a. Tahap Ekstraksi Daun
Simplisia daun waru digerus dengan mortar hingga menjadi serbuk, kemudian 0,1 gram serbuk yang telah halus diekstraksi dengan 10 mL etanol 70% diatas penangas air suhu 800 C selama 15 menit, setelah itu disaring dengan kertas
commit to user
28
saring , filtrat didinginkan selanjutnya diukur absorbansinya pada panjang gelombang 425 nm dengan larutan pembanding saponin (Sigma) (Stahl, 1985)
b.Tahap pembuatan Kurva Standar
Dibuat larutan standar saponin (Sigma) dengan 4 variasi konsentrasi yaitu 20 mg, 40 mg, 80 mg, 100 mg saponin yang masing –masing dilarutkan dalam 10 mL etanol 70%. Kemudian diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-vis uv fis Dynamica RB-10 pada panjang gelombang 425 nm (Stahl, 1985), sehingga diperoleh kurva larutan standar saponin.
c. Tahap Penghitungan kadar Saponin
Hasil ekstraksi daun dihitung kadarnya dengan menggunakan spektrofotometer UV-vis berdasarkan kurva larutan standar (Sigma). Kemudian kadar yang diperoleh dikonversi ke dalam bentuk mg/gr berat kering daun dengan rumus :
S = kadar saponin sampel x volume pengenceran
Berat sampel daun (Hary, 1998)
4. Preparasi Cairan Rumen dari Ternak Donor
Cairan rumen diproses dari donor 2 ekor sapi betina Peranakan Ongole milik UPT. BPPTK LIPI Yogyakarta yang difistula bagian rumennya dengan rata-rata bobot badan 337 ± 52 kg. Ternak diberi pakan pada jam 08.00 dan 15.00 WIB setiap hari dengan pakan basal yang terdiri atas rumput kolonjono (P. purpureum) dan konsentrat (70 : 30) sesuai dengan kebutuhan hidup pokok. Cairan rumennya diambil menggunakan aspirator dan dimasukkan dalam termos agar suhunya konstan. Cairan rumen disaring dengan kain blacu 2 lapis untuk menghilangkan partikel pengotor, kemudian digunakan sebagai donor cairan rumen.
commit to user
29
5. Desain Perlakuan
Percobaan ini disusun dengan desain eksperimen model rancangan acak lengkap yang terdiri atas 1 kontrol, 5 perlakuan dan tiap perlakuan dilakukan perulangan 3 kali, sebagai berikut :
Kontrol :P.purpureum(200 mg)
Perlakuan I :P.purpureum (200 mg) + daun Hibiscus tiliaceus (5% BK) Perlakuan II :P. purpureum (200 mg) + daun Hibiscus tiliaceus (10% BK) Perlakuan III :P.purpureum (200 mg) + daun Hibiscus tiliaceus (15% BK) Perlakuan IV :P.purpureum (200 mg) + daun Hibiscus tiliaceus (20%BK) Perlakuan V :P.purpureum (200 mg) + monensin (0,2% BK)
Keterangan : BK adalah berdasarkan berat kering P.purpureum 200 mg.
Dalam percoban ini digunakan rumput kolonjono (P. purpureum). sebagai substrat pokok. Kontrol negatif P. purpureum tanpa penambahan bahan, kontrol positif (Perlakuan V) dengan penambahan monensin 0,2%. Monensin digunakan karena penggunaan zat ini telah dapat mengurangi produksi gas dan memanipulasi fermentasi rumen.
6. Fermentasi secara In Vitro
Untuk fermentasi secara invitro menggunakan metode Menke & Steingass (1988). Metode ini dimulai dengan penimbangan substrat sebanyak yang telah ditentukan sesuai dengan perlakuan. Substrat dimasukkan dalam syringe berukuran 100 ml (Model Fortuna, Häberle Labortechnik, Germany). Disiapkan larutan bufer yang terdiri dari main element solution, trace element solution, buffer, resazurin solution, dan reduction solution. Bahan-bahan penyusunnya
commit to user
30
sebagai berikut: Main Element Solution terdiri dari Disodium Hidrogen Phosphat, Potassium dihidrogen Phosphat, Magnesium sulphat 7H2O dan Aquades. Trace Element Solution terdiri dari Calcium chloride, Manganese chloride, Cobalt chloride dan Aquades. Buffer terdiri dari Amonium Hidrogen Carbonat, Sodium Hidrogen Carbonat dan Aquades. Resazurin Solution terdiri dari Resazurin dan Aquades.Reduction Solution terdiri dari NaOH 1N, Na2S.7H2O dan Aquades.
Tiga puluh mililiter campuran larutan buffer dan cairan rumen (2 : 1) diinjeksikan ke dalam setiap syringeyang telah berisi substrat sampel didalamnya melalui selang silikon dengan dispenser yang telah diatur volumenya. Sebelum dimasukkan ke dalam syringe, piston terlebih dahulu dilumuri dengan vaselin. Hal ini dilakukan agar gas tidak bocor keluar. Gelembung gas yang terdapat di dalam syringedikeluarkan, lalu selang silikon ditutup dengan klem, posisi piston dibaca dan dicatat pada jam ke nol (V0). Proses inkubasi kemudian dilakukan pada suhu 39oC dalam water bath incubator.
Produksi gas yang dihasilkan diamati pada selang waktu inkubasi 3, 6, 9, 12, 24 dan 48 jam. Jika posisi piston di atas 60 ml, nilai ini dicatat lalu klem dibuka dan piston dikembalikan pada posisi 30 ml, kemudian jumlah gas sebelumnya dicatat. Pembacaan dilakukan dengan cepat agar tidak terjadi perubahan suhu.
commit to user
31
7. Pengukuran Produksi Gas, VFA, Konsentrasi N-NH3, dan pH serta Penghitungan Jumlah Protozoa
Produksi gas dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
(V48– V0 – Gb0) B
Keterangan :
PG = produksi gas
V48 =volume gas (ml) 48 jam V0 = volume gas (ml) awal inkubasi
Gb0 = produksi gas rata-rata blanko pada inkubasi 48 jam B = berat sampel uji dalam mg bahan kering pada suhu 39 0C. BK = bahan kering dalam standar 200 mg
Setelah inkubasi 48 jam, 10 ml sub sampel cairan rumen diambil dari masing-masing tabung dan diukur pH-nya menggunakan pH meter digital (Hanna Hi 8520), untuk diketahui pH setelah proses fermentasi.
Sebanyak 0,4 ml sub sampel cairan rumen ditambahkan 2 ml larutan asam metafosforat 25%, kemudian disentrifugasi pada 9000 g selama 10 menit kemudian diambil supernatannya dan dimasukkan ke dalam freezer –20°C sampai dengan analisis volatile fatty acids (VFA) yang meliputi asam asetat, asam propionat dan asam butirat menggunakan kromatografi gas. Nilai konsentrasi asam asetat (A), asam propionat (P) dan asam butirat (B) digunakan untuk menghitung Nisbah A/P dan NGR dengan Rumus : Nisbah A/P = A/P
NGR = (A+2B+V) / (P+V)
(Orskov, 1975)
commit to user
32
Penghitungan Nisbah A/P dan NGR disini digunakan untuk menggambarkan produksi gas metana. Nisbah A/P rendah menyebabkan NGR juga rendah. NGR adalah perbandingan antara asam lemak terbang yang bersifat non-glukogenik dan glukogenik. Nilai NGR berhubungan erat dengan produksi gas metana. NGR dan metana mempunyai korelasi positif, yang berarti semakin rendah nilai NGR semakin rendah pula produksi metana.
Sebanyak 2 ml sub sampel dipreparasi (disentrifugasi pada 15000 g selama 15 menit) dan dianalisis konsentrasi NH3 menggunakan metode Chaney dan Marbach (1962).
Untuk keperluan penghitungan protozoa, 1 ml sub sampel cairan rumen lainnya ditambahkan 0,8 ml larutan formaldehid salina yang terdiri atas 37% (v/v) formalin dan 0,9% (w/v) NaCl dengan perbandingan 1 : 9 (Ogimoto dan Imai, 1981), kemudian ditambahkan metylen green sebagai pewarna protozoa. Selanjutnya populasi protozoa dihitung menggunakan hemositometer di bawah mikroskop.