BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.5 Cara Umum Isolasi Senyawa Kimia dari Tumbuhan
Isolasi senyawa kimia dari bahan alam adalah suatu usaha untuk memisahkan senyawa yang bercampur sehingga diperoleh senyawa tunggal. Isolasi senyawa kimia ini banyak dilakukan dengan kromatografi (Robinson, 1995).
Kromatografi adalah suatu metode pemisahan berdasarkan proses migrasi dari komponen-komponen senyawa di antara dua fase yaitu fase diam (dapat berupa zat cair atau zat padat) dan fase gerak (dapat berupa gas atau zat cair). Fase gerak membawa zat terlarut melalui media sehingga terpisah dari zat terlarut lainnya yang terelusi lebih awal atau lebih akhir. Umumnya zat terlarut dibawa melewati media pemisah oleh aliran suatu pelarut berbentuk cairan atau gas yang disebut eluen. Fase diam dapat bertindak melarutkan zat terlarut sehingga terjadi partisi antara fase diam dan fase gerak. Proses ini suatu lapisan cairan pada penyangga yang inert berfungsi sebagai fase diam (Depkes RI, 1995).
19
diam yang dapat berupa zat padat atau zat cair. Fase diam berupa zat padat maka cara tersebut dikenal sebagai kromatografi serapan, sedangkan yang berupa zat cair maka dikenal sebagai kromatografi partisi (Depkes RI, 1995; Sastrohamidjojo, 1985).
Pemisahan dan pemurnian kandungan kimia tumbuhan terutama dilakukan dengan menggunakan salah satu dari lima teknik kromatografi atau gabungan teknik tersebut. Kelima teknik kromatografi itu adalah: kromatografi kolom (KK), kromatografi kertas (KKt), kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi gas cair (KGC), dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Pemilihan teknik kromatografi bergantung pada sifat kelarutan senyawa yang akan dipisah (Harborne, 1987).
2.5.1 Kromatografi lapis tipis
Kromatografi lapis tipis merupakan metode pemisahan campuran analit dengan mengembangkan analit melalui suatu lempeng kromatografi lalu melihat komponen atau analit yang terpisah dengan penyemprotan atau pewarnaan (Gandjar dan Rohman, 2012).
Fase diam yang terdiri atas bahan berbutir-butir dilapiskan pada penyangga berupa plat, gelas, logam atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah, berupa larutan ditotolkan berupa bercak ataupun pita, setelah itu plat atau lapisan dimasukkan ke dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak), pemisahan terjadi selama pengembangan, selanjutnya senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan (Stahl, 1985).
Pendeteksian bercak hasil pemisahan dapat dilakukan dengan beberapa cara. Untuk senyawa tak berwarna cara yang paling sederhana adalah dilakukan pengamatan dengan sinar ultraviolet. Beberapa senyawa organik berfluorosensi jika disinari dengan sinar ultraviolet gelombang pendek (254 nm) atau gelombang
20
panjang (366 nm). Senyawa tidak dapat dideteksi maka harus disemprot dengan pereaksi yang membuat bercak tersebut tampak yaitu pertama tanpa pemanasan, kemudian bila perlu dengan pemanasan (Gritter, et al., 1991; Stahl, 1985). Kromatografi lapis tipis dapat dipakai untuk dua tujuan yaitu:
1. Metode untuk mencapai hasil kualitatif (analitik) dan kuantitatif (preparatif). 2. Mencari sistem pelarut yang akan dipakai dalam kromatografi kolom (Gritter, et
al., 1991; Stahl, 1985).
a. Fase diam (lapisan penyerap)
Pada kromatografi lapis tipis pada fase diam berupa lapisan tipis yang terdiri bahan padat yang dilapiskan pada permukaan penyangga datar yang biasanya terbuat dari kaca atau logam. Lapisan fase diam melekat pada permukaan dengan bantuan bahan pengikat. Beberapa contoh fase diam yang digunakan untuk pemisahan dalam kromatografi lapis tipis yaitu silika gel, alumina, kieselguhr dan selulosa. Kromatografi lapis tipis lapisan fase diam harus sesedikit mungkin mengandung air, karena air akan menempati semua titik penyerapan sehingga tidak akan ada senyawa yang melekat, maka sebelum digunakan plat kromatografi lapis tipis perlu diaktifkan dengan pemanasan pada 110oC selama 30 menit (Gritter, et al., 1991).
b. Fase gerak (pelarut pengembang)
Fase gerak ialah medium angkut yang terdiri dari satu atau campuran pelarut, jika diperlukan sistem pelarut multi komponen, harus berupa suatu campuran sesederhana mungkin yang terdiri atas tiga komponen (Stahl, 1985).
Pemisahan pada KLT dikendalikan oleh rasio distribusi komponen dalam sistem fase diam atau penyerap dan fase gerak tertentu. Pemisahan pada KLT dapat dimodifikasi dengan mengubah rasio distribusi komposisinya pada fase gerak dengan
21
memperhatikan polaritasnya (Gandjar dan Rohman, 2012).
Hal ini sepasang pelarut atau lebih yang dapat saling melarutkan akan memisah menjadi menjadi dua lapisan. Hal ini lazim terjadi pada dua pelarut yang sangat berbeda kepolarannya dicampur sehingga dapat dilihat berupa bercak berbentuk bulan setengah, bukan bentuk yang bundar atau lonjong ((Gritter, et al., 1991).
c. Harga Rf
Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan dengan harga Rf (Retardation Factor = faktor penghambatan) (Stahl, 1985).
Rf= Jarak titik pusat bercak dari titik awal Jarak garis depan pelarut dari titik awal
Jarak yang ditempuh oleh tiap bercak dari titik penotolan diukur dari pusat bercak. Harga Rf berada antara 0,00 – 1,00. Harga Rf ini sangat berguna untuk mengidentifikasi suatu senyawa (Eaton, 1989).
Faktor-faktor yang mempengaruhi harga Rf adalah sebagai berikut (Sastrohamidjojo, 1985):
a. struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan b. bersifat penyerap
c. tebal dan kerataan lapisan penyerap d. jenis pelarut dan derajat kemurniannya
e. derajat kejenuhan uap pengembang dalam bejana f. teknik percobaan
22 g. jumlah cuplikan yang digunakan
h. suhu
i. kesetimbangan
2.5.2 Kromatografi lapis tipis preparatif
Metode pemisahan senyawa bahan alam yang memakai peralatan yang paling dasar merupakan kromatografi lapis tipis (KLT) preparatif. Ketebalan penyerap yang sering dipakai adalah 0,5 - 2 mm, ukuran plat kromatografi biasanya 20 x 20 cm atau 20 x 40 cm. Ketebalan lapisan yang terbatas dan ukuran plat sudah tentu mengurangi jumlah bahan yang dapat dipisahkan dengan KLT preparatif. KLT preparatif dapat memisahkan bahan alam dalam jumlah gram, sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah milligram. Penjerap yang paling umum digunakan adalah silika gel dan dipakai untuk pemisahan senyawa lipofil maupun campuran senyawa hidrofil. Pemilihan pelarut ditentukan berdasarkan pemeriksaan pendahuluan memakai KLT analitik (Hostettmann, et al., 1995).
Penotolan cuplikan dilakukan dengan melarutkan cuplikan dalam sedikit pelarut. Cuplikan ditotolkan berupa pita dengan lebar pita sesempit mungkin karena pemisahan tergantung pada lebar pita. Penotolan dapat dilakukan dengan pipet tetapi lebih baik dengan penotol otomatis. Pengembangan plat KLT preparatif dilakukan dalam bejana kaca yang dapat menampung beberapa plat. Bejana dijaga tetap jenuh dengan uap pelarut pengembang dengan bantuan kertas saring yang tercelup ke dalam pengembang. Kebanyakan penyerap KLT preparatif mengandung indikator fluorosensi yang membantu mendeteksi letak pita hasil pemisahan yang menyerap sinar ultraviolet. Mendeteksi senyawa yang tidak menyerap dari sinar ada beberapa pilihan (Hostettmann, et al., 1995):
23 a. menyemprot dengan air (misalnya saponin).
b. menutup plat dengan sepotong kaca,lalu menyemprot salah satu sisi menggunakan pereaksi semprot.
c. menambahkan senyawa pembanding
2.5.3 Kromatografi lapis tipis dua arah (two-dimensional TLC)
KLT dua arah atau KLT dua dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen solut mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama, karena nilai Rf juga hampir sama. Dua sistem fase gerak yang berbeda dapat digunakan secara berurutan pada suatu campuran tertentu sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang hampir sama maka KLT dua dimensi dapat dipakai untuk memeriksa kemurnian isolat. KLT dua dimensi dilakukan dengan melakukan penotolan sampel di salah satu sudut lapisan lempeng tipis dan mengembangkannya sebagaimana biasa dengan fase gerak pertama. Lempeng kromatografi selanjutnya dikeluarkan dari chamber pengembang dan fase gerak dibiarkan menguap dari lempeng. Lempeng dimasukkan ke dalam chamber yang menggunakan fase gerak kedua sehingga pengembangan dapat terjadi pada arah kedua yang tegak lurus dengan arah pengembangan yang pertama. Pemisahan tergantung pada kemampuan untuk memodifikasi selektifitas eluen pertama (Rohman, 2009).