Toleransi Khamir terhadap Sukrosa dan Etanol Tinggi
Tingginya konsentrasi sukrosa yang terkandung di dalam media pertumbuhan khamir membuat sel mengalami stres hiperosmosis yang menyebabkan tingginya pengeluaran air dari dalam sel. Hal tersebut berpengaruh terhadap volume sel, sehingga terjadi pengerutan sel dan hilangnya turgor. Pengerutan sel dapat meningkatkan konsentrasi zat terlarut di dalam sel yang menyebabkan terjadinya karbonilasi protein, depolarisasi mitokondria, kerusakan DNA, dan tertahannya siklus sel pada G1 atau G2, sehingga menghambat pertumbuhan khamir (Brockeret al.2012).
Semakin tinggi konsentrasi gula yang digunakan/dikonsumsi oleh khamir pada pembuatan bioetanol maka akan semakin tinggi pula konsentrasi etanol yang dihasilkan. Namun tingginya konsentrasi etanol yang terakumulasi pada media akan menyebabkan khamir mengalami stres hiperosmosis dimana etanol berdifusi secara bebas melintas membran sel khamir untuk mencapai kesetimbangan konsentrasi etanol antara intra dan ekstraselular sel. Peningkatan konsentrasi etanol menghambat pertumbuhan sel, mereduksi viabilitas sel dan menyebabkan kematian sel yang kemudian dapat mereduksi laju fermentasi etanol dan menurunkan rendemennya (Ma & Liu dalam Liu 2012).
Untuk melihat tingkat toleransi/ketahanan suatu strain khamir terhadap stres hiperosmosis akibat sukrosa dan etanol tinggi, maka dilakukan pengujian penghambatan pertumbuhan dari setiap strain khamir dan penentuan jumlah selnya ketika pada fase eksponensial dengan metode spot test. Semakin toleran suatu strain khamir terhadap stres hiperosmosis, maka semakin baik pertumbuhannya yang berarti tidak mengalami penghambatan pertumbuhan. Pada penelitian inispot test dilakukan pada media YPD yang mengandung konsentrasi sukrosa 50% - 70% dan etanol 11% - 14%. Hasil spot test dapat dilihat pada Gambar 4 dan 5 dan juga pada Tabel 1.
Gambar 4. Hasil Spot test 5 strain khamir yang berbeda [WT = khamir belum direkayasa, PRO1 = Pro1(I150T), MPR1 = Mpr1(K63R), PRO1-MPR1 = Pro1(I150T)/ Mpr1(K63R), MSN2-OP] pada media YPD kontrol, YPD yang mengandung 50%, 60%, dan 70% sukrosa.
15
Hasilspot test pada media YPD yang mengandung berbagai konsenstrasi sukrosa menunjukkan bahwa hampir seluruh strain khamir baik terekayasa maupun belum direkayasa dapat bertahan tumbuh hingga konsentrasi sukrosa 70%. Hanya koloni strain ER MSN2-OP yang mengalami penghambatan pertumbuhan. Hal tersebut dapat dilihat pada hasil penghitungan koloninya pada konsentrasi sukrosa 70% pada Tabel 1 yang lebih sedikit dibandingkan strain lainnya. Artinya bahwa strain khamir terekayasa Pro1(I150T), Mpr1(K63R), Pro1(I150T)/Mpr1(K63R) lebih toleran terhadap stres hiperosmosis yang diinduksi oleh konsentrasi gula tinggi dibanding MSN2-OP, hanya saja tidak lebih toleran dibanding strain khamir yang belum direkayasa. Hal ini disebabkan strain tersebut merupakan strain khamir industri/komersial (Ethanol Red) yang merupakan strain khamir yang secara khusus dipilih dan dikembangkan untuk industri etanol dengan toleransi terhadap etanol yang tinggi dan dapat menghasilkan etanol yang banyak dengan waktu yang cepat, juga dapat mempertahankan viabilitas sel yang tinggi selama fermentasi khususnya pada fermentasivery high gravity(VHG).
Penelitian Sasano et al. (2012b) menunjukkan bahwa strain khamir MSN2-OP yang ditumbuhkan pada media 30% glukosa juga tidak lebih toleran dibanding strain kontrolnya (vektor) atau memiliki karakter pertumbuhan yang tidak berbeda signifikan ketika diuji pada spot test. Selain itu juga dikarenakan strain khamir ini hanya toleran terhadap freeze thaw stress dan stres oksidatif yang diinduksi oleh furfural (Sasanoet al.2012b, 2012c).
Gambar 5. Spot test 5 strain khamir yang berbeda [WT = khamir belum direkayasa, PRO1 = Pro1(I150T), MPR1 = Mpr1(K63R), PRO1-MPR1 = Pro1(I150T)/ Mpr1(K63R), MSN2-OP] pada media YPD kontrol, YPD yang mengandung 11%, 12%, 13%, dan 14% etanol.
Uji toleransi pada media yang mengandung etanol 11% hingga 14% (Gambar 5) juga menunjukkan bahwa strain MSN2-OP tidak toleran terhadap etanol tinggi. Dibuktikan dengan tidak tumbuhnya koloni pada media spot test yang mengandung etanol 11% hingga 14% tetapi pada pengujian lain strain MSN2-OP masih dapat tumbuh hingga konsentrasi etanol 10%. Hasil spot test pada penelitian Sasanoet al. (2012b) menunjukkan bahwa strain MSN2-OP tidak tumbuh dengan baik atau mengalami penghambatan pertumbuhan pada media yang mengandung etanol 20% dibanding strain kontrol/vektornya artinya bahwa strain MSN2-OP sangat sensitif terhadap etanol tinggi. Sasano et al. (2012b) menyatakan bahwa hal tersebut kemungkinan dikarenakan ketidakseimbangan
jumlah level ekspresi antaran gen penyandi Msn2 dan Msn4. Menurutnya, faktor transkripsi Msn4 yang merupakan homolog dari Msn2 memiliki peran lebih tidak hanya sebagai perespon stres etanol. Namun bagaimana mekanisme molekuler mengenai toleransi terhadap etanolnya masih belum diketahui dengan baik hingga saat ini sekalipun sudah banyak kajian yang dilakukan untuk meneliti mengenai toleransi terhadap etanol (Ma & Liu dalam Liu 2012).
Tabel 1. Jumlah koloniSaccharomyces cerevisiaepadaspot test(sel/mL)
Perlakuan
S.cerevisiae S.cerevisiaeterekayasa belum direkayasa PRO1 MPR1 PRO1-MPR1 MSN2-OP Sukrosa Kontrol 4,0 x 105 9,0 x 105 5,5 x 105 5,5 x 105 4,0 x 105 50% 5,3 x 105 1,3 x 105 5,0 x 105 4,8 x 105 4,3 x 105 60% 5,3 x 105 1,3 x 105 5,0 x 105 4,8 x 105 4,3 x 105 70% 5,3 x 105 5,3 x 105 5,0 x 105 5,3 x 105 1,3 x 105 Etanol Kontrol 4,3 x 105 3,3 x 105 4,8 x 105 3,0 x 105 1,1 x 105 11% 2,5 x 105 1,3 x 105 3,8 x 105 4,8 x 105 0 12% 1,2 x 105 3,5 x 105 2,0 x 105 2,9 x 105 0 13% 1,2 x 105 3,3 x 105 2,8 x 105 1,9 x 105 0 14% 0 0 0 0 0
*PRO1 = Pro1(I150T); MPR1 = Mpr1(K63R); PRO1-MPR1 = Pro1(I150T)/ Mpr1(K63R)
Pada konsentrasi etanol 14% seluruh strain tidak dapat tumbuh. Hanya saja ketika waktu inkubasi ditambah lebih lama beberapa hari koloni khamir mulai terlihat. Artinya pertumbuhan khamir jauh lebih terhambat pada konsentrasi 14%. Pada konsentrasi etanol 13%, seluruh strain khamir tumbuh (kecuali MSN2-OP). Strain khamir yang belum direkayasa telah mengalami penghambatan pertumbuhan yang dibuktikan dengan jumlah koloni yang tumbuh paling sedikit dibandingkan strain khamir terekayasa yang lain [Pro1(I150T), Mpr1(K63R), Pro1(I150T)/Mpr1(K63R)]. Oleh karena itu, ketiga strain khamir terekayasa diuji kembali kemampuannya dalam melakukan fermentasi dengan menentukan sejumlah parameter kinetikanya.
Uji Fermentasi dan Pengukuran Parameter Kinetika
Uji fermentasi dilakukan untuk mengetahui karakter strain khamir dalam melakukan fermentasi baik itu pada aspek pola pertumbuhan maupun penghasil produk berupa etanol. Uji fermentasi dilakukan pada media yang mengandung sukrosa 30%. Nilai tersebut dipilih berdasarkan uji toleransi sebelumnya yaitu strain khamir hanya tahan hingga konsentrasi etanol 13% dan mengalami penghambatan pertumbuhan pada konsentrasi etanol 14% dan juga berdasarkan perhitungan teoritis berupa faktor konversi glukosa menjadi etanol menurut stoikiometri biokimia khamir yaitu 0,51 gram etanol/gram glukosa (Mousdale 2008) sehingga etanol yang akan dihasilkan pada konsentrasi sukrosa 30% diprediksi sebesar maksimal 15,1%. Berdasarkan hasil penelitian total gula awal
17
sebelum kultivasi yang terukur pada media fermentasi YPD+30% sukrosa adalah sebesar 58,67%. Nilainya hampir menyerupai total gula molase yaitu 62%. Hal tersebut dikarenakan total gula media YPD sendiri sudah mencapai 35,17%. Uji fermentasi dilakukan selama 48 jam dan menghasilkan data berupa kurva pola pertumbuhan, substrat yang dikonsumsi berupa data total gula sisa, dan jumlah etanol yang terbentuk dari setiap strain terekayasa terpilih pada jam tertentu (Gambar 6).
Gambar 6. Kurva pola pertumbuhan, total gula sisa, dan etanol yang diproduksi oleh strain khamir: a) Pro1(I150T), b) Mpr1(K63R), dan c) Pro1(I150T)/ Mpr1(K63R).
Seluruh strain khamir memiliki tipikal pola pertumbuhan, penggunaan substrat, dan produksi etanol yang relatif sama. Seluruh strain khamir memiliki 4 fase pertumbuhan pada titik-titik waktu yang relatif sama pula, diantaranya fase lag/awal pada jam 0-3 yang merupakan masa penyesuaian khamir sejak inokulum sel khamir diinokulasikan ke dalam media. Pada fase ini etanol yang terbentuk sangat kecil dan bahkan tidak ada penambahan jumlah sama sekali. Substrat yang tersedia pada media mulai mengalami penurunan yang artinya khamir mengkonsumsi gula untuk pertumbuhan dan untuk mensintesis enzim-enzim yang diperlukan sel untuk metabolisme (Mangunwijaya & Suryani 1994). Setelah fase lag selesai dilanjutkan dengan fase eksponensial/log dimana mulai terjadi reproduksi selular dan konsentrasi biomassa yang semakin lama semakin meningkat yaitu pada jam ke-3 hingga 15. Pada fase tersebut mulai terbentuk
) ) ) a) b) c) ) ) ) b)
etanol dengan jumlah yang cukup besar dan jumlah gula yang tersisa di dalam media semakin kecil.
Semakin banyak etanol yang terakumulasi di dalam media kultivasi menyebabkan sel khamir mulai mengalami penurunan laju pertumbuhan dan penghambatan pertumbuhan. Khamir memasuki fase perlambatan dan pada akhirnya mencapai titik konsentrasi biomassa terbesar/maksimal yang menandakan khamir memasuki fase stasioner. Fase perlambatan pada setiap strain relatif sama yaitu pada jam ke-15 hingga 18 yang kemudian dilanjutkan dengan fase stasioner hingga jam ke-48. Pada fase stasioner pertumbuhan sel berhenti yang ditandai dengan konstannya jumlah biomassa hingga waktu tertentu. Namun jumlah etanol yang diproduksi semakin meningkat hingga ±140 g/L pada jam ke-48. Hal tersebut dikarenakan jumlah gula yang tersedia pada media kultivasi masih sangat besar dan masih bisa dikonsumsi oleh khamir untuk diubah menjadi etanol dan juga karena tingginya toleransi khamir terhadap etanol dan gula tinggi, sehingga khamir masih dapat bertahan hidup untuk memproduksi etanol. Besarnya total gula yang tersisa pada setiap strain pada jam ke-48 menyebabkan khamir belum mengalami fase penurunan/kematian yang diakibatkan karena kekurangan nutrisi, sehingga ada kemungkinan khamir masih dapat meningkatkan jumlah etanol yang diproduksi jika waktu fermentasi ditambah. Untuk mengetahuinya perlu adanya pengujian dengan menambah waktu kultivasi.
Berdasarkan kajian pola pertumbuhan mikroba tersebut dapat ditentukan parameter kinetika pertumbuhan, yaitu rendemen biomassa yang terbentuk per substrat yang dikonsumsi (Yx/s), rendemen produk yang terbentuk per substrat yang dikonsumsi (Yp/s), rendemen produk yang terbentuk per biomassa (Yp/x), laju pertumbuhan spesifik maksimal (µmaks), biomassa maksimal, etanol maksimal yang dihasilkan, dan persentase efisiensi penggunaan substrat. Nilai-nilai parameter kinetika tersebut dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Parameter kinetika strain khamir terekayasa pada uji fermentasi/kultivasi selama 48 jam
Parameter Kinetika PRO1 MPR1 PRO1-MPR1
Xmaks (g/L) 29,97 ± 2,76 25,81 ± 0,07 32,53 ± 1,74 Pmaks (g/L) 139,55 ± 5,59 147,75 ± 3,61 146,00 ± 3,32 µmaks(/jam) 0,16 ± 0,01 0,16 ± 0,00 0,17 ± 0,00 Yp/s 0,30 ± 0,01 0,30 ± 0,01 0,30 ± 0.00 Yp/x 4,13 ± 0.08 4,84 ± 0,07 4,09 ± 0.42 Yx/s 0,05 ± 0.00 0,05 ± 0,01 0,05 ± 0,00 Efisiensi Penggunaan Substrat (%) 84,00 ± 1,65 83,30 ± 1,37 83,92 ± 0,64
*PRO1 = Pro1(I150T); MPR1 = Mpr1(K63R); PRO1-MPR1 = Pro1(I150T)/ Mpr1(K63R)
Jika melihat kinetika penggunaan substrat pada penghitungan parameter kinetika uji kultivasi, ketiga strain terekayasa Pro1(I150T), Mpr1(K63R), dan Pro1(I150T)/Mpr1(K63R) cukup efisien dalam menggunakan substrat dengan nilai efisiensi yang relatif sama yaitu sebesar 84,00±1,65%, 83,30±1,37%, dan
19
83,92±0,64%. Ketiga strain tersebut menggunakan substrat untuk membentuk biomassa dan etanol yang kemudian dihitung rendemen pembentukannya. Dari substrat yang digunakan, ketiga strain dapat menghasilkan biomassa per gram substrat (Yx/s) dengan nilai yang sama yaitu sebesar 0,05±0,00 g biomassa/g substrat untuk strain Pro1(I150T) dan Pro1(I150T)/Mpr1(K63R) dan sebesar 0,05±0,01 g biomassa/g substrat untuk strain Mpr1(K63R). Substrat juga digunakan untuk pembentukan produk berupa etanol dengan nilai rendemen etanol per gram substrat (Yp/s) sebesar 0,30±0,01 g etanol/g substrat untuk strain Pro1(I150T) dan Mpr1(K63R), dan sebesar 0,30±0,00 g etanol/g substrat untuk strain Pro1(I150T)/Mpr1(K63R).
Nilai rendemen etanol yang terbentuk per gram biomassa (Yp/x), menunjukkan bahwa strain Mpr1(K63R) menghasilkan etanol per gram biomassa yang paling besar dengan standar deviasi yang tidak berhimpit dengan strain lainnya. Hal tersebut menandakan bahwa setiap satu satuan biomassa, strain Mpr1(K63R) dapat menghasilkan etanol lebih besar dibanding strain yang lainnya yaitu sebesar 4,84±0,07 g etanol/g biomassa, sedangkan strain Pro1(I150T) dan Pro1(I150T)/Mpr1(K63R) menghasilkan Yp/x yang relatif sama yaitu sebesar 4,13±0.08 g etanol/g biomassa Pro1(I150T) dan 4,09±0.42 g etanol/g biomassa Pro1(I150T)/Mpr1(K63R).
Hasil penghitungan parameter kinetika juga menunjukkan bahwa ketiga strain khamir memiliki nilai laju pertumbuhan spesifik (µmaks) yang sama. Artinya setiap strain tumbuh dengan laju relatif yang sama yaitu sebesar 0,16±0,01 /jam. Hal tersebut ditunjang dengan nilai biomassa maksimal (Xmaks) dan etanol maksimal (Pmaks) yang juga tidak jauh berbeda dimana menunjukkan standar deviasi yang berhimpit walaupun nilai rata-rata setiap strain berbeda. Nilai biomassa maksimal strain Pro1(I150T), Mpr1(K63R), dan Pro1(I150T)/ Mpr1(K63R) berurutan adalah sebesar 29,97±2,76 g/L, 25,81±0,07 g/L, dan 32,53±1,74 g/L dengan nilai etanol yang dihasilkan sebesar 139,55±5,59 g/L, 147,75±3,61 g/L, dan 146,00±3,32 g/L atau setara dengan 13,96%, 14,78%, dan 14,6% (w/v) etanol dengan waktu fermentasi selama 48 jam.
Menurut Puligundha et al.(2011), kondisi fermentasi dapat menyebabkan stres hiperosmosis (fermentasi very high gravity) pada khamir yaitu pada media yang mengandung total gula lebih dari 300 g/L padatan terlarut yang berisi nutrisi lain seperti amino nitrogen bebas, yeast extract, sterol, dan lain-lainnya. Hasil penelitian Zhang et al. (2012) menunjukkan bahwa rendemen etanol maksimal yang dihasilkan pada fermentasi media yang mengandung gula 300 g/L oleh khamirSaccharomyces cerevisiae yang belum direkayasa dan diisolasi dari wine adalah sebesar 137 g/L pada jam ke-48 dengan jumlah glukosa akhir sebesar 4,71 g/L.
Snoek et al. (2010) di dalam penelitiannya menggunakan khamir Ethanol Red sebagai kontrol pada fermentasi yang dilakukan selama 7 hari pada media YP (yeast extract peptone) yang ditambah dengan 320 g/L glukosa dapat menghasilkan rendemen etanol sebesar 149,7 ± 2,94 g/L dengan nilai Yp/ssebesar 0,49 ± 0,01 g etanol/g substrat. Nilai tersebut lebih besar dibandingkan penelitian yang dilakukan terhadap khamir Ethanol Red terekayasa Pro1(I150T), Mpr1(K63R), dan Pro1(I150T)/Mpr1(K63R) karena waktu fermentasi yang dilakukannya lebih lama dibanding fermentasi yang dilakukan terhadap khamir Ethanol Red terekayasa. Penelitian Mukhtar et al. (2010) yang melakukan
fermentasi terhadap media molase dengan nilai total gula yang lebih rendah yaitu sebesar 15 - 17% dan menggunakan khamir Ethanol Red mutan sebagai agen fermentasinya yang dilakukan selama 16 jam pada suhu 32 ± 2oC dapat menghasilkan rendemen etanol sebesar 8,8% (v/v) atau setara dengan 111,53 g/L. Penelitian lain yang juga menggunakan khamir Ethanol Red (Dziugan et al. 2013) pada fermentasi bioetanol selama 96 jam di dalam media thick sugar beet juice dengan kandungan ekstrak sebesar 250 g/kg dan ditambah dengan (NH4)2HPO4sebesar 0,3 g/L dapat menghasilkan rendemen etanol sebesar 14,2 ± 0,4% (v/v) atau setara dengan 112,04 ± 3,16 g/L.
Jayus et al. (2016) di dalam penelitiannya yang menggunakan khamir komersial lain dengan nama New Aule Alcohol Yeast terhadap fermentasi bioetanol selama 72 jam pada media molases yang diencerkan hingga mengandung gula pereduksi sebesar 300 g/L dengan penambahan (NH4)2HPO4 sebesar 100 ppm dapat menghasilkan bioetanol maksimal sebesar 74,80 g/L pada jam ke-48 dengan nilai Yp/s sebesar 0,378 g etanol/g substrat. Khamir komersial New Aule Alcohol Yeast merupakan khamir yang toleran terhadap suhu, konsentrasi asam, alkohol dan gula tinggi, yaitu toleran pada suhu 32 - 42oC, pH 2,5, kadar alkohol 13% dan kandungan glukosa sebesar 60%. Selain itu khamir ini memiliki kecepatan yang tinggi dalam menghasilkan etanol dengan sisa gula yang rendah dan menghasilkan rendemen yang tidak asam (non-acil yielding).
Nilai tersebut lebih rendah dibanding dengan jumlah etanol yang dihasilkan oleh strain Pro1(I150T), Mpr1(K63R), dan Pro1(I150T)/Mpr1(K63R) pada penelitian ini yaitu sebesar 140-150 g/L atau sekitar 14-15% dengan waktu fermentasi selama 48 jam. Nilai tersebut juga lebih besar dari jumlah etanol yang dihasilkan pada kondisi gula normal yang biasa dilakukan oleh banyak industri etanol yaitu sebesar 6-10% (v/v) selama 48 jam (Zhang et al.2012) atau sebesar 10-12% (v/v) (Puligundla et al. 2011). Oleh karena itu, ketiga strain khamir terekayasa Pro1(I150T), Mpr1(K63R), dan Pro1(I150T)/Mpr1(K63R) dapat direkomendasikan untuk dimanfaatkan guna memperbaiki produktivitas etanol pada industri etanol dengan kondisi fermentasi very high gravity (menggunakan media dengan konsentrasi gula tinggi).
21
5 SIMPULAN
SimpulanBerdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa seluruh strain khamir terekayasa [Pro1(I150T), Mpr1(K63R), dan Pro1(I150T)/Mpr1(K63R)] toleran dan dapat tumbuh pada media berkonsentrasi sukrosa tinggi hingga 70% dan etanol tinggi hingga 13%, kecuali strain MSN2-OP yang mengalami penghambatan tumbuh dan lebih sensitif terhadap konsentrasi sukrosa 70% dan etanol 11%. Pola kurva pertumbuhan ketiga strain terekayasa pilihan [Pro1(I150T), Mpr1(K63R), Pro1(I150T)/Mpr1(K63R)] tidak berbeda signifikan, begitu juga parameter kinetikanya. Namun untuk nilai rendemen etanol per gram biomassa (Yp/x), strain Mpr1(K63R) memberikan nilai yang paling besar diantara strain lainnya yaitu sebesar 4,84±0,07 g etanol/g biomassa. Ketiga strain terekayasa dapat digunakan untuk memperbaiki produktivitas etanol di industri dengan nilai rendemen etanol yang dihasilkan sebesar 139,55±5,59 g/L untuk strain Pro1(I150T), 147,75±3,61 g/L untuk strain Mpr1(K63R), dan 146,00±3,32 g/L untuk strain Pro1(I150T)/Mpr1(K63R). Perolehan ini lebih besar dari perolehan etanol pada proses konvensional di industri (6 – 12% v/v atau setara dengan 47,34–94,68 g/L).
Saran
Metode pengujian toleransi khamir terekayasa maupun belum direkayasa dengan metodespot testpada media agar berpeluang menyebabkan koloni khamir yang tumbuh tidak terpapar langsung dengan sukrosa berkonsentrasi tinggi pada media bila media agar tidak homogen. Oleh karena itu disarankan pengujian toleransi terhadap konsentrasi gula tinggi dilakukan menggunakan media cair dengan konsentrasi gula bertingkat yang selanjutnya diuji viabilitasnya dengan ditumbuhkan pada cawan agar atau dihitung dengan mikroskop dengan teknik pewarnaan agar khamir yang terhitung hanya khamir hidup. Selain itu perlu dilakukan penelitian lanjutan berupa pengaplikasian langsung strain khamir terekayasa pada media molase dengan perlakuan tingkat pengenceran yang berbeda-beda untuk memproduksi bioetanol.