Pada tahap ini, substrat yang telah dihidrolisis menggunakan asam, dinetralkan dengan kapur tohor hingga pH mencapai 5,5, kemudian dilanjutkan proses hidrolisis menggunakan enzim k-karagenase. Hidrolisat asam dengan konsentrasi 6%, 9% dan 12% yang telah dingin ditambahkan enzim k-karagenase dengan konsentrasi 0%, 2.5% dan 5%. Hidrolisis enzimatik dilakukan dengan cara menginkubasi substrat E.cottonii selama 2 jam (waktu hidrolisis yang terbaik untuk gula reduksi) pada suhu 40°C, dimana banyak enzim yang ditambahkan dalam 100 ml buffer adalah 5 ml untuk konsentrasi 2.5% dan 10 ml untuk konsentrasi enzim 5% dan kemudian sisanya ditambahkan dengan buffer fosfat pH 6 sehingga total volume hidrolisat E.cottonii yang digunakan adalah 200 ml. Kemudian hidrolisat dipanaskan pada suhu 90°C selama 15 menit yang bertujuan untuk menghentikan reaksi pada hidrolisat dan masing-masing substrat diambil sampelnya untuk dianalisa gula reduksi dan total gulanya setelah hidrolisis menggunakan enzim.
7. Fermentasi
Substrat yang telah dihidrolisis menggunakan enzim k-karagenase selanjutnya difermentasi, yang sebelumnya dilakukan persiapan inokulum S.cerevisiae IPBCC AL IX dan diambil sebanyak 2 ose untuk ditanam dalam 10 mL media YMGP (Yeast Malt Galactose Pepton), dimana banyaknya media YMGP yang ditambahkan pada hidrolisat adalah sebesar 10% dari total volume hidrolisat yaitu sebanyak 20 ml. Selanjutnya media diinkubasi pada suhu 30oC selama 24 jam (Yanagisawa et al. 2011). Proses fermentasi dilakukan pada kondisi anaerobik pada suhu ruang 30oC. Substrat yang telah dihidrolisis ditambahkan dengan pupuk urea 0.5% dan NPK 0.06% dari °Brix gula substrat sebagai sumber nutrient (Setyaningsih et al. 2012). Proses fermentasi dilakukan selama 6 hari. Hidrolisat yang telah difermentasi diambil sample sebanyak 2 ml untuk analisa gula reduksi dan total gulanya setelah fermentasi. Selanjutnya hidrolisat hasil fermentasi didistilasi, kemudian rendemen etanol yang diperoleh diukur dengan bantuan alat densitometer (%v/v). Perhitungan kadar etanol, efisiensi fermentasi, dan efisiensi penggunaan substrat dapat dilihat pada Lampiran 6.
Pengolahan Data
Pengolahan data dilakukan untuk mengetahui pengaruh konsentrasi substrat dan enzim terhadap proses hidrolisis dan fermentasi dilakukan uji F dengan RAL dua faktor. Faktor pertama yang mempengaruhi adalah konsentrasi substrat E.cottonii sebanyak 3 taraf yaitu 6% (S1), 9% (S2) dan 12% (S3). Faktor kedua konsentrasi enzim dengan 3 taraf yaitu 0% (E1), 2,5% (E2) dan 5%(E3). Percobaan dilakukan sebanyak 2 kali dengan masing-masing pengukuran diulang sebanyak 2 kali. Apabila
ada salah satu perlakuan atau interaksinya berpengaruh nyata maka analisis dilanjutkan dengan uji Duncan (Gomez dan Gomez 1995). Parameter yang diuji diantaranya gula reduksi dan total gula selama proses hidrolisis dan fermentasi, kadar etanol, efisiensi penggunaan substrat dan efisiensi fermentasi.
Persamaan model rancangannya sebagai berikut : Yikj = μ+ Si+ Ej+ (SE)ij+ ε(ij)k
Keterangan :
Yijk = Hasil pengamatan μ = Nilai rata-rata umum
Si = Pengaruh faktor konsentrasi substrat E.cottonii pada taraf ke-i; i=1,2,3..n Ej = Pengaruh faktor konsentrasi enzim pada taraf ke-j; j=1,2,3..n
SEij = Pengaruh interaksi antara faktor konsentrasi substrat ke-i dan enzim ke-j ε(ij)k = Galat percobaan
13
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Stabilitas Aktivitas Enzim k-Karagenase pada Berbagai Waktu Inkubasi Pengukuran aktivitas enzim k-karagenase dilakukan untuk melihat berapa lama enzim dapat bekerja secara maksimal pada suhu optimum. Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai 1 mikromol galaktosa (gula reduksi) yang dihasilkan per satuan waktu pada kondisi pengukuran enzim, yang dinyatakan dalam satuan unit/ml yang merupakan mikromol yang dilepas per menit per mililiter enzim.
Gambar 5 Aktivitas enzim k-karagenase selama waktu inkubasi
Pada Gambar 5 terlihat bahwa aktivitas enzim mengalami peningkatan di menit 30 hingga menit ke-60 yaitu sebesar 0.007 IU/ml – 0.01 IU/ml. Kemudian aktivitas enzim menurun dimenit 90 hingga menit ke-180, dimana pada waktu ini enzim sudah kurang aktif sehingga tidak menghasilkan kenaikan gula reduksi yang tinggi. Berdasarkan grafik dapat disimpulkan bahwa aktivitas enzim yang tinggi dapat diperoleh pada awal masa inkubasi yaitu pada kisaran 30 hingga 60 menit.
Perbandingan Aktivitas Enzim Ekstrak Kasar dan Enzim Hasil Pengendapan Aseton
Perbandingan enzim ekstrak kasar dengan enzim hasil pengendapan aseton dilakukan untuk membandingkan aktivitas enzim dan aktivitas spesifikasi enzim sebelum dan setelah pengendapan aseton. Tabel 3 adalah perbandingan enzim ekstrak kasar dan enzim hasil pengendapan aseton.
Tabel 3 Perbandingan aktivitas enzim ekstrak kasar dan enzim hasil pengendapan Aseton 80% Sampel Gula reduksi (mg/ml) Aktivitas Enzim (IU/ml) Total Akt. Enzim (IU) Kadar protein (mg/ml) Akt. Spesifik Enzim (IU/mg) Total akt. Spesifik. Enzim (IU)
Enzim Ekstrak Kasar 0.029 0.016 8 1.051 0.015 7.5
Enzim Hsl Pengendapan 0.156 0.086 4.3 1.428 0.060 3
Total Yield Enzim (%) 53.7 40
Pada Tabel 3 dapat dilihat bahwa nilai aktivitas enzim mengalami peningkatan pada saat sebelum dan setelah diendapkan. Aktivitas enzim diperoleh berdasarkan nilai gula reduksi yang dihasilkan pada masing-masing enzim yaitu sebesar 0.029 mg/ml dan 0.0156 mg/ml. Secara umum, gula pereduksi berhubungan erat dengan aktivitas enzim dimana semakin tinggi aktivitas enzim maka semakin tinggi pula gula
0,007 0,010 0,008 0,008 0 0 0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010 0,012 30 60 90 120 150 180 Ak ti v it a s E nzim (lU/m l)
Waktu Inkubasi (menit)
Aktivitas Enzim (IU/ml)
pereduksi yang dihasilkan. Nilai aktivitas enzim ekstrak kasar sebesar 0.016 IU/ml menjadi 0.086 IU/ml dengan kelipatan hasil pengendapan aseton sebanyak 5 kali lipat.
Sedangkan nilai aktivitas spesifikasi enzim ekstrak kasar adalah 0.015 IU/mg dan mengalami peningkatan sebanyak 4 kali lipat menjadi 0.060 IU/mg saat setelah diendapkan dengan aseton. Aktivitas spesifikasi enzim diperoleh bedasarkan kadar protein pada masing-masing enzim, dimana kadar protein pada enzim ekstrak kasar sebesar 1.051 mg/ml dan 1.428 mg/ml pada enzim hasil pengendapan. Pemekatan enzim karagenase dengan metode pengendapan aseton merupakan metode yang cukup baik dalam meningkatkan aktivitas enzim dengan persentase total yield yang dihasilkan sebesar 53.7%.
Kadar Gula Reduksi selama Hidrolisis oleh Enzim k-Karagenase
Enzim k-karagenase diperoleh dengan cara mencampurkan media produksi karagenase dengan media starter isolat IH22 dan diinkubasi selama 12 jam. Enzim ekstrak kasar yang dihasilkan disentrifus untuk memisahkan supernatan dan endapannya (crude) yang kemudian dipekatkan dengan metode pengendapan aseton 80% (Meliawati 2015). Perlakuan waktu hidrolisis yang diberikan dimulai dari 0 hingga 180 menit dengan rentang waktu setengah jam. Tahapan ini bertujuan untuk mendapatkan waktu hidrolisis k-karagenan dalam menghasilkan gula reduksi yang tertinggi oleh k-karagenase.
Gambar 6 Gula Reduksi selama Proses Hidrolisis oleh Enzim k-Karagenase Gambar 6 menjelaskan bahwa gula reduksi yang dihasilkan dari menit pertama hingga menit ke-120 mengalami peningkatan, kemudian di menit ke-150 menurun hingga menit ke-180. Enzim karagenase menghasilkan gula reduksi yang tinggi pada saat mencapai waktu hidrolisis 2 jam (120 menit). Selain suhu, waktu inkubasi merupakan salah satu faktor yang dapat mempengaruhi besarnya gula reduksi yang dihasilkan. Semakin lama waktu hidrolisis maka akan semakin tinggi kadar gula reduksi yang dihasilkan. Namun waktu hidrolisis yang terlalu lama akan mengakibatkan gula reduksi terdegradasi, sehingga konsentrasi gula reduksi menurun (Idral et al. 2012). Waktu 2 jam ini selanjutnya digunakan untuk menghidrolisis substrat E.cottonii pada proses hidrolisis enzimatik.
0,082 0,094 0,117 0,125 0,142 0,080 0,075 0,00 0,05 0,10 0,15 0 30 60 90 120 150 180 G ula Reduk si (m g /m l)
Waktu Hidrolisis (menit)
Rata-rata Gula reduksi (mg/ml)
15
Penentuan Konsentrasi Asam H2SO4 3% pada Perlakuan Awal Hidrolisis Proses hidrolisis yang dilakukan pada tahap ini bertujuan untuk menentukan konsentrasi asam yang tepat agar substrat tidak mudah padat (berubah jadi gel) pada saat didinginkan. Proses penentuan konsentrasi asam dilakukan secara tersendiri, dimana masing-masing substrat E.cottonii diberi perlakuan konsentrasi asam sebanyak 0.1% hingga 1%, dengan kenaikan konsentrasi setiap 0.05% dan kemudian diautoklaf selama 30 menit pada suhu 121°C. Selanjutnya hidrolisat disaring dengan kain kassa yang bertujuan untuk memisahkan cairan dengan ampas dan mempermudah pengamatan terhadap penampakan hidrolisat secara visual. Hidrolisat yang diinginkan memiliki karakteristik warna tidak terlalu coklat (kuning keruh), konsistensi cairan kental, tidak membeku pada suhu ruang, viskositas sekitar 8 cP dan pH yang mendekati netral yaitu 5. Tabel 4 berikut menjelaskan secara rinci penampakan hidrolisat pada masing-masing substrat E.cottonii.
Tabel 4 Konsentrasi asam H2SO4 3% pada masing-masing substrat
Substrat
E.cottonii Warna Konsistensi
Viskositas
(cP) pH
Konsentrasi Asam (%)
6%
Kuning Pucat Padat (Agar) - - 0.1
Kuning Keruh Kental 8.15 5 0.15
Kuning Keruh Agak Kental 5.86 4.5 0.2
Kuning Kecoklatan Kental cair 4.81 4 0.25
Kuning Kecoklatan Kental cair 2.18 3.5 0.3
Kuning Terang Cair 1.21 3 0.4
Kuning Terang Cair 1.1 3 0.5
Kuning Terang Cair 1.07 3 1
9%
Kuning Pucat Padat (agar) - - 0.1
Kuning Pucat Padat (agar) - - 0.15
Kuning Pucat Padat (agar) - - 0.2
Kuning Keruh Kental 8,21 5 0.25
Kuning Keruh Agak kental 6,86 4 0.3
Kuning Keruh Agak kental 4,03 4 0.35
Kuning Keruh Kental cair 2,88 4 0.4
Kekuningan Kental cair 2,41 4 0.5
Kuning Terang Cair 1,15 3 1
12%
Kuning Pucat Padat (agar) - - 0.15
Kuning Pucat Padat (agar) - - 0.2
Kuning Pucat Padat (agar) - - 0.25
Kuning Pucat Padat (agar) - - 0.3
Kuning Keruh Setengah padat 9.79 5.5 0.35
Kuning Keruh Kental 8.73 5 0.4
Kuning Keruh Agak kental 7.07 4 0.5
Kuning Kecoklatan Kental cair 5,73 4 0.6
Kuning Kecoklatan Kental cair 5.11 4 0.7
Berdasarkan Tabel 4 dapat dilihat bahwa semakin tinggi konsentrasi substrat maka semakin banyak konsentrasi asam yang dibutuhkan. Hal ini dikarenakan besarnya konsentrasi substrat yang digunakan mengakibatkan kontak antara asam dengan substrat semakin kecil, sehingga dibutuhkan asam yang lebih banyak dalam menguraikan polisakarida galaktosa pada hidrolisat. Asam merupakan salah satu bahan pengurai oksigen dalam air pada proses hidrolisis. Sedikitnya konsentrasi asam yang digunakan, bertujuan agar tidak terbentuknya senyawa inhibitor pada hidrolisat rumput laut seperti Hydroxymethyl fulfural (HMF) dan asam levulinik (AL), karena salah satu akibat adanya senyawa tersebut dapat menghambat produktivitas fermentasi mikroorganisme sehingga menurunkan produksi etanol.
Hidrolisis E.cottonii dengan Asam dan Enzim k-Karagenase
a.
Konsentrasi Gula Reduksi dan Total Gula setelah Pelakuan Awal Asam Total gula merupakan campuran gula reduksi dan non reduksi yang merupakan hasil hidrolisis pati. Gula pereduksi merupakan golongan gula (karbohidrat) yang dapat mereduksi senyawa-senyawa penerima elektron, contohnya adalah glukosa dan fruktosa. Ujung dari suatu gula pereduksi adalah ujung yang mengandung gugus aldehid atau keton bebas. Semua monosakarida (glukosa, fruktosa, galaktosa) dan disakarida (laktosa, maltosa) kecuali sukrosa dan pati (polisakarida), termasuk sebagai gula pereduksi. Akan tetapi jika polisakarida dihidrolisis, maka akan menghasilkan lebih dari sepuluh monosakarida contohnya amilum, glikogen, dan selulosa. Karena polisakarida merupakan polimer monosakarida yang memiliki bobot molekul yang tinggi (Poedjiadi 2006).Karagenan merupakan polisakarida yang linier atau lurus, dan merupakan molekul galaktan dengan unit-unit utamanya adalah galaktosa dari hasil ekstraksi rumput laut. Sebagian besar karagenan mengandung natrium, magnesium, dan kalsium yang dapat terikat pada gugus ester sulfat dari galaktosa dan kopolimer 3,6-anhydro-galaktosa. Tingginya kandungan karagenan pada rumput laut akan memberikan pengaruh terhadap konsentrasi gula reduksi yang dihasilkan. Dimana semakin banyak karagenan/oligosakarida yang terhidrolisis semakin banyak gula reduksi yang terbentuk (Winarno 2004).
Analisis total gula dengan metode Fenol merupakan salah satu metoda penetapan total gula yang banyak digunakan untuk bahan pangan. Metode ini dapat mengukur dua molekul gula pereduksi. Gula sederhana, oligosakarida, dan turunannya dapat dideteksi dengan fenol dalam asam sulfat pekat yang akan menghasilkan warna jingga kekuningan yang stabil. Adapun tujuan analisa kadar gula total ini adalah untuk mengukur semua jenis gula pada substrat E.cottonii selama proses hidrolisis.
Berdasarkan hasil sidik ragam, faktor konsentrasi substrat E.cottonii memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap kadar gula reduksi dan total gula yang dihasilkan, dimana f hitung faktor A (substrat) lebih besar dari f tabel (Lampiran 8). Adanya pengaruh oleh faktor substrat terhadap konsentrasi gula yang dihasilkan, maka dilakukan uji lanjut Duncan dengan rata-rata nilai gula reduksi berkisar antara 0.59-1.09 dan total gulanya 3.26-4.66. Hasil tersebut dapat dilihat pada gambar histogram dibawah ini, yang merupakan kadar gula reduksi dan total gula yang dihasilkan setelah hidrolisis perlakuan awal asam pada konsentrasi substrat E.cottonii.
17
Gambar 7 Konsentrasi gula reduksi dan total gula setelah perlakuan awal asam Pada Gambar 7 terlihat bahwa semakin tinggi konsentrasi substrat maka semakin besar kadar gula reduksi dan total gula yang dihasilkan. Substrat 12% merupakan substrat yang paling tinggi dalam menghasilkan gula reduksi dan total gula selama proses hidrolisis menggunakan asam. Hal ini dikarenakan semakin tinggi konsentrasi substrat E.cottonii maka semakin banyak pati (polisakarida) yang tersedia untuk hidrolisis oleh asam.
Salah satu yang mejadi faktor utama yang berpengaruh terhadap hasil yang diperoleh dan kecepatan selama proses hidrolisis adalah susbtrat. Semakin tinggi konsentrasi substrat akan menjadi penghambat selama proses hidrolisis karena dapat memperlambat proses. Hal inilah yang menyebabkan kecilnya kandungan gula reduksi dan total gula pada substrat 12%. Berdasarkan rasio antara konsentrasi gula reduksi atau total gula terhadap konsentrasi substrat E.cottonii, konsentrasi gula reduksi yang terkandung setelah dihidrolisis pada perlakuan awal asam adalah 9-10% dan total gulanya sekitar 40-45%.
Derajat polimerisasi (DP) adalah jumlah total unit-unit struktur termasuk gugus fungsi, dan berhubungan dengan panjang rantai dan berat molekul. DP merupakan perbandingan antara total gula dengan gula pereduksi. DP dapat menunjukkan seberapa besar rantai polisakarida dapat dipecah menjadi monosakarida. Nilai DP yang kecil menunjukkan bahwa semakin banyak rantai polimer selulosa dan galaktan yang terputus sehingga dihasilkan senyawa-senyawa monosakarida dan oligosakarida. Hasil derajat polimerisasi dapat dilihat pada gambar histogram dibawah ini :
Gambar 8 Derajat polimerisasi setelah perlakuan awal asam
0,62 0,88 1,10 3,26 4,03 4,66 0 1 2 3 4 5 6% 9% 12% K o ns ent ra si G ula ( %)
Konsentrasi Substrat E.cottonii
Gula Reduksi Total Gula 5,26 4,58 4,24 0 1 2 3 4 5 6 6% 9% 12% Der a ja t P o lim er is a si
2,63 3,29 4,26 4,32 5,91 6,85 5,88 7,71 9,89 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 6% 9% 12% T o ta l G u la ( %)
Konsentrasi Substrat E.cottonii
Enzim 0% Enzim 2,5% Enzim 5%
Pada Gambar 8 dapat dilihat bahwa semakin tinggi konsentrasi substrat, nilai derajat polimerisasi yang dihasilkan semakin kecil. Hal ini menunjukan bahwa banyaknya rantai polisakarida yang terurai menjadi galaktosa selama proses hidrolisis. Substrat 12% merupakan substrat yang paling kecil nilai derajat polimerisasinya yaitu sebesar 4.24. Nilai DP yang diperoleh dapat diartikan bahwa rangkaian polisakarida yang terpecah menjadi beberapa rangkaian monosakarida dengan jumlah molekul antara 2-8 merupakan golongan dari oligosakarida.
Derajat polimerisasi yang diperoleh berbanding terbalik terhadap nilai rasio antara derajat polimerisasi dengan konsentrasi susbtrat E.cottonii, dimana pada substrat 12% kandungan galaktosa yang terkandung hanya sekitar 35% sedangkan kandungan yang tertinggi terdapat pada substrat 6% dengan persentase sebesar 87%. Hal ini dikarenakan tingginya konsentrasi substrat memberikan pengaruh terhadap banyaknya rantai polimer yang terputus selama proses hidrolisis.
b. Konsentrasi Gula Reduksi dan Total Gula setelah Hidrolisis Enzimatik Proses hidrolisis enzim merupakan proses penguraian suatu polimer yang kompleks menjadi monomer penyusunnya dengan menggunakan enzim. Enzim karagenase dalam proses hidrolisis berperan untuk memecah molekul karagenan pada posisi β-1,4 sehingga menghasilkan neokarrabiosa dan dirubah menjadi galaktosa.
Adanya perlakuan substrat, enzim maupun interaksi keduanya memberikan pengaruh yang nyata terhadap gula reduksi dan total gula yang dihasilkan setelah hidrolisis menggunakan enzim, hal ini terlihat pada tabel sidik ragam (Lampiran 8) dimana faktor substrat, enzim dan interaksi antar kedua faktor memiliki f hitung yang lebih besar daripada f tabel. Dan kemudian dilakukan uji lanjut Duncan dengan rata-rata gula reduksi yang dihasilkan berkisar antara 1.73-2.70 (faktor substrat) dan 1.53-2.73 (faktor enzim). Sedangkan rata-rata total gula pada kedua faktor (substrat dan enzim) adalah 4.28-6.99 dan 3.39-7.83. Berikut gambar histogram rata-rata konsentrasi gula reduksi dan total gula setelah hidrolisis menggunakan enzim pada konsentrasi substrat E.cottonii.
Gambar 9 Konsentrasi gula reduksi dan total gula setelah hidrolisis enzimatik Pada Gambar 9 terlihat bahwa semakin tinggi konsentrasi substrat dan enzim, gula reduksi dan total gula yang dihasilkan semakin meningkat pula. Dimana selain konsentrasi substrat, enzim k-karagenase memberikan pengaruh terhadap konsentrasi
1,18 1,47 1,94 1,72 2,54 2,98 2,29 2,67 3,21 0 2 4 6 8 10 6% 9% 12% G ula Reduk si (%)
19
gula yang dihasilkan. Hal ini dikarenakan semakin tinggi konsentrasi enzim maka substrat yang berikatan dengan lokasi aktif enzim akan semakin banyak sehingga jumlah produk yang dihasilkan akan semakin banyak (Mauliana 2015). Substrat 12% merupakan susbtrat yang memiliki kadar gula reduksi dan total gula yang tertinggi yaitu sebesar 1.94-3.21% dan 4.26-9.89%.
Sama halnya pada hidrolisat setelah diberi perlakuan awal asam, besarnya konsentrasi substrat juga dapat mempengaruhi kecepatan hidrolisis enzimatis. Terjadinya penghambatan selama proses hidrolisis selain karena konsentrasi substrat yang tinggi juga dipengaruhi oleh banyaknya enzim yang diberikan. Banyaknya konsentrasi enzim sangat berpengaruh terhadap kecepatan selama proses hidrolisis. Hal ini dapat dilihat dari hasil rasio antara kadar gula reduksi atau total gula terhadap substrat dengan atau tanpa perlakuan enzim. Dimana semakin tinggi konsentrasi substrat semakin kecil kandungan gula reduksi dan total gula yang dihasilkan akan tetapi semakin tinggi konsentrasi enzim yang ditambahkan pada masing-masing substrat semakin tinggi kandungan gula reduksi dan total gula setelah hidrolisis enzimatis. Adapun kandungan gula reduksi yang dihasilkan berkisar antara 16-38% dengan total gula sebesar 36-90%.
Gambar 10 Derajat Polimerisasi setelah hidrolisis enzimatik
Derajat Polimerisasi dihitung untuk mengetahui perbandingan antara total gula dengan gula pereduksi setelah hidrolisis enzimatik. Tingginya derajat polimerisasi yang dihasilkan, menunjukan bahwa jumlah galaktan yang terhidrolisis menjadi senyawa-senyawa oligosakaridanya sangat sedikit, sehingga dapat diartikan bahwa hidrolisis belum terjadi dengan sempurna. Derajat Polimerisasi setelah hidrolisis menggunakan enzim, konsentrasinya lebih kecil jika dibandingkan dengan DP setelah perlakuan awal asam. Hal ini dikarenakan selama proses hidrolisis menggunakan enzim konsentrasi gula yang dihasilkan lebih tinggi daripada setelah perlakuan awal asam.
Pada Gambar 10 dapat dilihat bahwa semakin banyak konsentrasi enzim yang ditambahkan pada substrat E.cottonii, nilai derajat polimerisasi yang dihasilkan semakin tinggi. Dimana substrat dengan penambahan enzim 5% memiliki nilai derajat polimerisasi paling tinggi yaitu sebesar 2.57-3.07. Lain halnya dengan substrat yang ditambahkan perlakuan enzim 0% dan 2.5%, derajat polimerisasi yang dihasilkan semakin kecil seiring meningkatnya konsentrasi substrat E.cottonii.
2,272,51 2,242,33 2,202,30 2,57 2,89 3,07 0 1 1 2 2 3 3 4 6% 9% 12% Der a ja t P o lim er is a si
Konsentrasi Substrat E.cottonii
Enzim 0% Enzim 2,5% Enzim 5%
1,57 1,73 3,11 2,24 3,54 5,04 3,43 4,96 7,92 0 1 2 3 4 5 6 7 8 6% 9% 12% T o ta l G ula ( %)
Konsentrasi Substrat E.cottonii
Enzim 0% Enzim 2,5% Enzim 5%
Fermentasi
Fermentasi merupakan penguraian senyawa organik menjadi senyawa sederhana dengan bantuan mikroorganisme sehingga menghasilkan energi (Banati et al. 2007). Ada tiga komponen yang terlibat dalam proses fermentasi diantaranya substrat, mikroba dan produk. Substrat merupakan salah satu sumber gula yang dibutuhkan khamir selama fermentasi. Adapun mikroba yang digunakan pada penelitian ini adalah jenis khamir yang telah teradaptasi pada media yang mengandung galaktosa. Sel S.cerevisiae hasil adaptasi mampu menggunakan galaktosa pada hidrolisat. Hong et al. (2011) menyatakan ketika galaktosa menjadi satu-satunya sumber karbon yang tersedia, S.cerevisiae akan menghasilkan enzim-enzim tertentu dalam metabolismenya untuk mengubah glukosa menjadi etanol atau untuk perbanyakan sel.
a. Konsentrasi Gula Reduksi Dan Total Gula Setelah Fermentasi
Pada tahap fermentasi, substrat E.cottonii mengubah menjadi gula sederhana salah satunya adalah galaktosa. Produksi etanol dari substrat gula oleh khamir S.cerevisiae merupakan proses fermentasi dengan kinetika sangat sederhana. Disebut sederhana karena hanya melibatkan satu fasa pertumbuhan dan produksi, pada fase tersebut galaktosa diubah secara simultan menjadi biomassa, etanol dan CO2. Terdapat dua parameter yang dapat mengendalikan pertumbuhan dan metabolisme khamir dalam keadaan anaerobik, yaitu konsentrasi gula dan etanol. Pada Gambar 11 dapat dilihat bahwa konsentrasi gula reduksi dan total gula yang dihasilkan setelah fermentasi mengalami penurunan saat setelah dihidrolisis menggunakan enzim k-karagenase, hal ini dikarenakan S.cerevisiae mengkonsumsi gula reduksi selama proses fermentasi untuk proses metabolismenya.
Berdasarkan hasil sidik ragam, adanya faktor konsentrasi substrat dan enzim memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap nilai gula reduksi dan total gula setelah fermentasi. Hal ini dapat dilihat pada Lampiran 8, perlakuan subtrat dan enzim mempunyai nilai f hitung lebih besar dari f tabel. Kemudian dilakukan uji lanjut Duncan dengan rata-rata nilai gula reduksi pada faktor substrat 0.82-1.89 dan 0.71-1.53 pada faktor enzim, sedangkan rata-rata total gula yang dihasilkan adalah 2.49-5.36 dan 2.13-5.44. Berikut gambar histogram yang menunjukan rataan atau konsentrasi gula reduksi dan total gula yang dihasilkan setelah fermentasi.
Gambar 11 Konsentrasi gula reduksi dan total gula setelah fementasi
0,39 0,44 1,31 0,85 1,24 2,20 1,22 1,18 2,18 0 1 2 3 4 5 6 7 8 6% 9% 12% G ula Reduk si (%)
21 1,06 1,56 1,15 2,08 2,37 1,81 2,45 2,75 1,97 0 1 2 3 6% 9% 12% K o ns um si T o ta l G ula ( %)
Konsentrasi Substrat E.cottonii
Enzim 0% Enzim 2,5% Enzim 5%
Pada Gambar 11 dapat dilihat bahwa substrat 12% masih menghasilkan kadar gula reduksi dan total gula yang tinggi. Besarnya kadar gula reduksi dan total gula yang dihasilkan setelah fermentasi, menunjukan bahwa sedikitnya gula yang dikonsumsi oleh S.cerevisiae selama proses fermentasi. Dimana menurut Osho (2005), khamir memiliki batas toleransi terhadap jumlah gula dalam hidrolisat (substrat). Adapun gula optimum bagi S.cerevisiae adalah sekitar 15-18%.
b. Konsumsi Gula Reduksi dan Total Gula selama Proses Fermentasi
Konsentrasi gula reduksi dan total gula sebelum dan setelah fermentasi dapat digunakan untuk menentukan besarnya gula reduksi dan total gula yang digunakan selama proses fermentasi. Adanya perbedaan jumlah gula yang dikonsumsi berhubungan dengan pembentukan etanol, karena gula reduksi yang terukur sebagai galaktosa dapat dimanfaatkan oleh khamir dalam proses metabolisme dalam menghasilkan etanol.
Gambar 12 merupakan histogram yang menunjukan besarnya konsumsi gula reduksi dan total gula selama proses fermentasi.
Gambar 12 Konsumsi gula reduksi dan total gula selama proses fermentasi Pada Gambar 12 menjelaskan bahwa pada substrat 9% merupakan substrat dengan konsentrasi gula reduksi dan total gula yang paling banyak dikonsumsi oleh khamir selama proses fermentasi, jika dibandingkan dengan substrat 6% dan 12%. Substrat dengan konsentrasi 9% merupakan substrat dengan konsumsi gula reduksi dan total gula yang tertinggi yaitu masing-masing sebesar 1.03-1.49% dan 1.56-2.75%. Sedangkan substrat 12% konsentrasi gula reduksi yang dikonsumsi masih sangat sedikit, dimana secara kinetik glukosa memiliki peran ganda dimana substrat dengan konsentrasi gula yang rendah yaitu kurang dari 1 g/L merupakan substrat pembatas, sedangkan konsentrasi gula yang tinggi dimana lebih dari 300 g/L akan
