Pendahuluan
Air susu ibu (ASI) merupakan makanan yang terbaik bagi bayi. Kandungan zat gizi yang lengkap dan senyawa aktif di dalam ASI sangat penting bagi pertumbuhan dan perkembangan otak, sistem pencernaan, dan untuk kekebalan tubuh bayi (AAP 2005, M’Rabet L et al. 2008).
Produksi ASI yang optimal ditentukan oleh berbagai faktor, antara lain faktor fisiologis dan psikologis, kondisi hormonal, serta ketersediaan zat gizi dalam tubuh ibu menyusui. Selama laktasi, ketersediaan zat gizi dalam tubuh ibu menyusui mempengaruhi profil asam lemak susu dan ekspresi gen yang penting untuk fungsi, pertumbuhan, dan perkembangan kelenjar mammae. Selain itu, ketersediaan zat gizi juga mempengaruhi jumlah dan jenis senyawa yang terdapat dalam air susu, seperti protein, lipid, dan vitamin (Baldi et al. 2008).
Vitamin A adalah salah satu zat gizi yang penting pada masa laktasi. Kebutuhan akan vitamin A meningkat sebanyak 350 RE pada masa laktasi dibandingkan rata-rata kebutuhan wanita dewasa yang tidak menyusui, yaitu 600 RE (Solomon 2001). Sebagian besar masyarakat negara di dunia, khususnya negara berkembang, masih mengandalkan β-karoten yang banyak terdapat dalam sayuran hijau dan buah yang berwarna orange sebagai sumber vitamin A (Grune et al. 2010).
Nutrasetikal Galohgor terbuat dari berbagai jenis tanaman dengan komponen utama daun-daunan yang berwarna hijau tua serta jagung yang merupakan sumber β-karoten. Manfaat Galohgor sebagai nutrasetikal yang dapat meningkatkan produksi ASI telah diungkap dalam penelitian survei (Dahlianti et al. 2005), etnobotani (Roosita et al. 2008a, 2008b), maupun penelitian secara in vivo dengan menggunakan hewan coba (Roosita et al. 2003).
Penelitian yang membuktikan efek Galohgor terhadap produksi ASI pada tingkat selular belum pernah dilakukan. Namun, hasil penelitian Roosita et al. (2013b), β-karoten dapat meningkatkan difererensiasi sel kelenjar mammae yang ditandai dengan perkembangan mammosfer yang sinergis dengan peningkatan ekspresi gen Cx43 dan Csn2. Oleh karena itu, dalam penelitian ini digunakan mammosfer sebagai penanda proses diferensiasi dari kelenjar mammae (HC11) pada proses laktogenesis. Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan pengaruh Galohgor serbuk dan ekstrak dengan dosis yang berbeda terhadap proliferasi dan diferensiasi sel kelenjar mammae (HC11).
Bahan dan Metode
Waktu dan Tempat
Penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia dan Analisis Makanan, Departemen Gizi Masyarakat, Fakultas Ekologi Manusia untuk pembuatan Galohgor Serbuk dan Ekstrak. Kultur sel dilakukan di Laboratorium Embriologi,
42
Fakultas Kedokteran Hewan, IPB. Penelitian dilaksanakan pada bulan Juli hingga Oktober 2013.
Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah peralatan untuk membuat Galohgor Serbuk dan Ekstrak dan peralatan kultur jaringan. Jenis perlatan utama untuk membuat Galohgor Serbuk dan Ekstrak meliputi timbangan digital, blender, oven, wadal maserasi dan pengaduknya, drum dryer, dan evaporator.
Peralatan kultur jaringan dan pembuatan medium perlakuan, antara lain timbangan analitik, ultra sentrifus, tabung sentrifus, stirrer dan vorteks, alat gelas dan tabung sentrifus, lemari pendingin, clean bench, dan mikroskop cahaya (Olympus).
Bahan-bahan Serbuk dan Ekstrak Galohgor berasal dari Desa Sukajadi, Kecamatan Taman Sari, Kabupaten Bogor dan dibuat dengan prosedur sebagaimana dijelaskan pada Bab 3. Etanol dan aquades digunakan untuk membuat Ekstrak Galohgor dengan perbandingan 30:70. Pelarut tetrahydrofuran (THF) (Sigma) digunakan untuk melarutkan β-karoten murni dan β-karoten dalam Galohgor. Konsentrasi THF akhir dalam medium 1.25%. β-karoten (BCA) yang digunakan adalah β-karoten dengan kemurnian 99% (Sigma).
Medium kultur sel yang digunakan untuk HC11 adalah RPMI 1640 (Biowest) dengan antibiotik gentamisin. Hormon dan faktor pertumbuhan yang digunakan meliputi insulin (Sigma), EGF (Sigma), hidrokortison (Sigma), dan prolaktin (Sigma). Serum yang digunakan adalah heat-inactivated Fetal Bovine Serum (FBS). Kit 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) (Roche) digunakan untuk analisis proliferasi dan viabilitas sel.
Desain Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL). Unit percobaan dalam penelitian ini adalah kultur sel HC11 dalam cawan petri. HC11 Cell line diperoleh dari Prof Nancy Hynes, Friedrich Miescher Institute, CH-4002 Basel, Switzerland.
Konsentrasi dalam perlakuan ditentukan berdasarkan konsentrasi akhir β- karoten Galohgor serbuk dalam larutan medium, yaitu sebesar 10.0, 5.0, dan 0.5 µM, sedangkan untuk Galohgor ekstrak 5.0; 1.5, dan 0.5 µM. Perbedaan dosis didasarkan pada hasil penelitian pendahuluan yang menunjukkan bahwa pada konsentasi yang setara dengan 5.0 µM β-karoten, Galohgor serbuk belum menunjukkan perubahan morfologis yang signifikan. Prosedur pembuatan medium perlakuan selengkapnya dijelaskan pada Bab 3.
Kontrol positif yang digunakan adalah β-karoten murni dengan konsentrasi bertingkat yang sama dengan kadar β-karoten galohgor, mengacu pada penelitian Wojcik (2008). Konsentrasi sel pada awal kultur dalam setiap cawan/ulangan sebesar 1 x 105 sel/mL. Untuk MTT assays digunakan 60 dari 96 sumur dengan jumlah sel 2x104 sel per sumur selama 3x24 jam dalam inkubator steril bersuhu 36°C, CO2 5%. Prosedur penelitian selengkapnya dijelaskan pada Bab 3.
Jumlah ulangan (contoh) untuk setiap kelompok berjumlah tiga (3) cawan kultur, sedangkan untuk MTT assays masing-masing 6 ulangan. Jumlah dan jenis ulangan untuk setiap perlakuan menurut kelompok percobaan selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 6.
43 Tabel 6 Jumlah dan jenis perlakuan menurut kelompok percobaan
Kelompok
Kandungan β-karoten dalam Medium pada Setiap Jenis Perlakuan
MTT assays Galohgor (µM /mL ) Beta-karoten murni (µM /mL ) Kontrol 0 0 6
Kontrol negatif (Triton) 0 0 6
Beta-karoten 0 5 6
Galohgor Serbuk (GS1) 10.0 0 6
Galohgor Serbuk (GS2) 5.0 0 6
Galohgor Serbuk (GS3) 0.5 0 6
Galohgor Ekstrak (GE1) 5.0 0 6
Galohgor Ekstrak (GE2) 1.5 0 6
Galohgor Ekstrak (GE3) 0.5 0 6
Total 54
Pengamatan yang dilakukan meliputi proliferasi dan diferensiasi sel yang ditandai dengan perkembangan mamosfer. Namun untuk pengukuran dengan MTT assays hanya dilakukan pada tahap proliferasi.
Analisis Data
Semua data kualitatif disajikan secara deskriptif, sedangkan data-data kuantitatif diuji dengan menggunakan Analysis of Variance (ANOVA) yang dilanjutkan dengan uji Duncan untuk menentukan beda nyata antar perlakuan.
Hasil
Kandungan β-karoten Produk Jamu Galohgor Serbuk dan Ekstrak
Berdasarkan Tabel 7 diketahui kandungan β-karoten ekstrak lebih tinggi dibandingkan dengan sediaan serbuk. Data kadar β-karoten Galohgor dalam bentuk sediaan serbuk dan ekstrak diperlukan untuk menentukan jumlah gram jamu yang harus ditambahkan ke dalam medium untuk menghasilkan konsentrasi akhir yang diinginkan, yaitu 0.5, 1.5, dan 5.0μM.
Tabel 7 Kandungan β-karoten dalam galohgor ekstrak dan serbuk No Bentuk Sediaan Galohgor Kandungan β-karoten ppm mg/100g 1. Serbuk 188.43 18.84 2. Ekstrak 213.66 21.37
Medium persediaan (stok) yang telah disentrifus diperlihatkan pada Gambar 17. Proses sentrifus bertujuan untuk memisahkan bagian yang terlarut dan tidak terlarut dalam medium yang mengadung THF (1.25%) dan serum FCS (10%). Penambahan THF dan Serium pada medium stok bertujuan untuk meningkatkan kelarutan β-karoten. Pada Gambar 17, terlihat endapan serbuk dan ekstrak
44
Galohgor yang berwarna kuning kehijauan di bagian bawah medium yang berwarna merah muda (pink).
Gambar 16 Medium persediaan (stok) hasil sentrifus
Osmolalitas Medium Kontrol dan Perlakuan
Salah satu syarat medium yang baik adalah molaritas atau molalitas larutan tidal melebihi 0.400 mOsm/kg. Hasil pengukuran osmolalitas medium selengkapnya disajikan pada Tabel 8. Berdasarkan data pada Tabel 8 tersebut, nilai osmolalitas larutan medium kontrol dan perlakuan berada pada batas normal.
Pengaruh Galohgor Ekstrak dan Galohgor Serbuk pada Proliferasi Sel Kelenjar Mammae (HC11)
Perlakuan sediaan Galohgor ekstrak pada konsentrasi tinggi dengan kandungan setara β-karoten murni 5µM secara signifikan menekan proliferasi dan viabilitas sel kelenjar mammae HC11. Namun, pada konsentrasi yang lebih rendah tidak berbeda secara signifikan. Sementara itu, untuk perlakuan dengan
No Medium Kode Rataan Osmolalitas (mOsm/Kg) 1 Kontrol D1 282 2 Β-karoten murni [5.0 µM] BC 392 3 Galohgor Ekstrak [0.5 µM] D5 312 4 Galohgor Ekstrak [1.5 µM] D6 328 5 Galohgor Ekstrak [5.0 µM] D7 379 6 Galohgor Serbuk [0.5 µM] D8 359 7 Galohgor Serbuk [5.0 µM] D9 334 8. Galohgor Serbuk[10.0 µM] D10 354
45 sediaan Galohgor serbuk pada konsentrasi semua konsentrasi perlakuan tidak berbeda dibandingkan dengan kontrol (Gambar 18).
Gambar 17 Pengaruh Galohgor Ekstrak (GE) dan Galohgor Serbuk (GS) pada konsentrasi yang berbeda dibandingkan dengan Kontrol dan Triton X-144 pada Proliferasi Sel Kelenjar Mammae (HC11).
Pengaruh Sediaan Galohgor Serbuk dan Ekstrak pada Diferensiasi sel Kelenjar Mammae HC11
HC11 cell line adalah sel kelenjar mammae yang mampu melakukan proses laktogenesis seperti pada kondisi in vivo. HC11 cell line mampu mengekpresikan protein susu (β-kasein) sebagai respons terhadap hormon prolaktin dan glukokortikoid (Ball et al, 1988; Hynes 1990 dan Doppler et al. 1989).
Gambar 19 menunjukkan morfologi sel HC11 dalam medium diferensiasi yang mendapat perlakuan Ekstrak Galohgor 0.5 µM (A), 1.5 µM (B), 5.0 µM (C), dan Serbuk Galohgor 0.5 µM (D), 1.5 µM (E), 5.0 µ M (F). Struktur mammosfer yang berukuran besar terlihat pada Ekstrak Galohgor konsentrasi paling rendah (0.5 µM), sedangkan pada perlakuan serbuk Galohgor dengan konsentrasi paling tinggi 5.0 µM. Pada ketiga perlakuan ekstrak galohgor terlihat globula lemak (milk fat globule = MFG), sedangkan pada perlakuan dengan serbuk galohgor struktur MFG tidak terlihat secara nyata.
Nagatami dan Oka (1983) menjelaskan bahwa ekspresi gen kasein merupakan penanda terjadinya sintesis protein kasein susu di sel kelenjar mammae yang disebut laktogenesis. Berdasarkan hasil studi tersebut, kasein juga berfungsi sebagai penanda khusus untuk fungsi sel kelenjar epitel mammae. Selain itu, seperi halnya laktalbumin, kasein merupakan protein yang sangat penting dalam menentukan kualitas air susu.
46
Gambar 18 Perbedaan morfologi sel HC11 yang mengalami diferensiasi ditandai dengan struktur mammosfer (lingkaran) akibat perlakuan Galohgor ekstrak 0.5 µM (A), 1.5 µM (B), 5.0 µM (C), dan Galohgor serbuk 0.5 µM (D), 5.0 µM (E), 10.0 µM (F).
Pembahasan
Perlakuan β-karoten murni dan galohgor juga menyebabkan perkembangan mammosfer yang baik. Perkembangan mammosfer yang paling baik pada perlakuan β-karoten murni konsentrasi suprafisiologis (5.0 μM).
Demikian pula pada Galohgor serbuk, perkembangan mammosfer yang paling baik adalah pada konsentrasi yang setara dengan β-karoten murni suprafisiologis (5.0 μM). Sebaliknya, pada Galohgor ekstrak perkembangan mammosfer sudah terlihat sangat baik pada konsentrasi yang setara dengan β- karoten murni terendah (0.5 μM).
Pada konsentrasi yang lebih tinggi, sel kelenjar mammae yang mendapat perlakuan Galohgor ekstrak menunjukkan perkembangan globula lipid susu (milk fat globule = MFG). Hal ini menurut Jager et al. (2008) karakteristik fisiologis sel kelenjar mammae yang telah berdiferensiasi juga ditandai ditandai dengan kemampuan sel tersebut untuk mensintesis lemak susu dan laktosa, selain protein kasein maupun whey protein.
Boisgard et al. (2001) menjelaskan bahwa setelah sempurna, kasein yang berbentuk misel akan bergabung dengan molekul lain, seperti laktoferin, α- laktalbumin, immunoglobulin, dan protein-whey dalam bentuk vasikula sekretorik (secretory vesicle). Selanjutnya menurut Borellini dan Oka (1989) dan Neville (2009) proses penumpukan vasikula yang menyimpan sejumlah besar kasein dan tumpukan butiran lemak akan berkumpul di bagian tepi membrane sel dan akan dikeluarkan dari sel secara eksositosis.
Pada sel HC11 yang mendapat perlakuan Galohgor ektrak dengan kandungan β-karoten setara dengan 1.5 dan 5.0 μM β-karoten murni,
47 menunjukkan penumpukkan vasikula dan butiran lemak di luar sel. Hal ini diduga sebagian sel telah mengalami involusi.
Borellini dan Oka (1989) mengemukakan bahwa secara alamiah sel kelenjar mammae juga mengalami involusi. Proses involusi pada tingkat selular diawali dengan penumpukan vakuola yang menyimpan sejumlah besar kasein dan tumpukan butiran lemak. Penumpukan tersebut dapat menyebabkan tekanan pada mitokondria dan lisosom yang menyebabkan terlepasnya berbagai enzim hidrolitik ke sitoplasma. Proses autofagi ini menyebabkan sel mengalami deplesi dan lisis. Sisa-sisa hasil autofagi ini akan dihancurkan oleh makrofag yang terdapat dalam jumlah yang sangat banyak di kelenjar mammae.
Berdasarkan hasil tersebut dapat diketahui bahwa perlakuan galohgor ekstrak lebih efektif dibandingkan dengan β-karoten murni dalam mempengaruhi diferensiasi sel kelenjar mammae yang ditandai dengan perkembangan mammosfer. Efektivitas pemberian galohgor serbuk setara dengan β-karoten murni pada konsentrasi suprafisiologis (5.0 μM). Hal ini diduga kandungan senyawa aktif lain yang terdapat dalam galohgor ekstrak juga berpengaruh pada diferensiasi kelenjar mammae.
Mekanisme efek β-karoten pada diferensiasi kelenjar mammae diperantarai oleh perkembangan gap junction yang disusun oleh protein koneksin. Protein ini dikode oleh gen koneksin, di antaranya adalah Cx43. Talhouk et al. (2005), Cruciani dan Mikalsen (2006), dan Gropper et al. (2009) menjelaskan bahwa gap junction berfungsi untuk menghubungkan atau membangun koneksi atau komunikasi antara sel-sel yang bertetangga. Struktur gap junction ini juga berperan penting dalam mengatur proses metabolism, pertumbuhan, dan proses fisiologis sel kelenjar mammae.
Hasil penelitian ini menunjukkan semua sel kelenjar mammae HC11 yang juga mengekspresikan gen kasein dan mengalami diferensiasi yang ditandai dengan perkembangan mammosfer.
Simpulan
Galohgor serbuk tidak menekan proliferasi sel kelenjar mammae (HC11). Namun Galohgor ekstrak konsentrasi tinggi setara dengan 5μM β-karoten murni dapat menekan proliferasi sel kelenjar mammae (HC11) secara signifikan (p<0.05) .
Galohgor serbuk dan Galohgor ekstrak mempengaruhi diferensiasi sel kelenjar mammae yang ditandai dengan perkembangan struktur mammosfer. Galohgor ekstrak lebih efektif dibandingkan dengan β-karoten murni dan galohgor serbuk dalam mempengaruhi diferensiasi sel. Efektivitas Galohgor serbuk setara dengan efektivitas β-karoten murni pada konsentrasi suprafisiologis (5.0 μM).
48