Pendahuluan
Galohgor adalah salah satu jenis nutrasetikal tradisional yang memiliki khasiat untuk meningkatkan produksi air susu ibu (ASI). Galohgor telah dikenal dan dikonsumsi secara turun temurun oleh masyarakat Indonesia, khususnya masyarakat Sunda. Selain meningkatkan produksi ASI, Galohgor dapat mempercepat penyembuhan luka (Permana 2011) dan involusi uterus (Roosita et al. 2003).
Galohgor terbuat dari 56 jenis tanaman yang termasuk dalam kelompok serealia, kacang-kacangan, daun, batang dan rimpang (Roosita et al. 2003; Pratiwi 2010; Wicaksono 2010; Permana 2011). Salah satu zat gizi yang dominan dalam Galohgor adalah β-karoten (Permana 2011).
β-karoten adalah salah satu jenis karotenoid yang memiliki aktivitas vitamin A. Selain sebagai provitamin A, β-karoten juga mempengaruhi proliferasi dan diferensiasi sel dalam tubuh, serta memiliki aktivitas antikanker dan antioksidan (Gropper et al. 2009; Livny et al. 2002).
Penelitian tentang β-karoten terus berkembang hingga tingkat seluler. Metabolisme β-karoten di berbagai sel tubuh usus halus, ginjal, retina, hati, dan jaringan lemak menghasilkan retinal dan/atau retinol (Redmon et al. 2001 dan Gropper et al. 2009). Lebih lanjut retinal dimetabolisme menjadi asam retinoat oleh serangkaian enzim aldehida dehidrogenase hasil ekspresi kelompok gen ALDH (Jackson et al. 2011).
Hasil survei (Dahlianti et al. 2005) menunjukkan bahwa Galohgor aman untuk dikonsumsi, karena sudah digunakan secara turun temurun oleh masyarakat sunda khususnya di Wilayah Sukajadi, Kabupaten Bogor. Uji toksisitas akut pada hewan coba (Wicaksono 2010) menunjukkan bahwa Galohgor bersifat aman dan tidak toksik jika digunakan sesuai anjuran yaitu 0.370 g/KgBB selama masa nifas. Gangguan kesehatan berupa perubahan fungsi hati baru akan terjadi jika penggunaannya 9 kali dosis normal setara dengan 3.220 g/KgBB, dengan lama penggunaan lebih dari dua kali masa nifas atau setara dengan 80 hari secara terus menerus (Wicaksono 2010).
Penelitian kami sebelumnya (Roosita et al. 2013) menunjukkan bahwa β- karoten pada sel epitel usus (CMT-93) pada konsentrasi suprafisiologis (5.0μM) dapat menekan proliferasi, mempengaruhi morfologi, dan menginduksi ekspresi gen Aldh1a2. Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan respons sel epitel usus (CMT-93) terhadap Galohgor serbuk dan Galohgor ekstrak. Secara khusus penelitian ini bertujuan untuk membandingkan pengaruh Galohgor serbuk dan Galohgor ekstrak pada 1) proliferasi sel usus, 2) diferensiasi sel yang ditunjukkan dengan perubahan morfologi, dan 3) ekspresi gen Aldh1a2 pada sel epitel usus (CMT-93).
28
Bahan dan Metode
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium of Food and Enviromental Science, Division Food Science and Biotechnology, Faculty of Agriculture, Kyoto University, Japan dan Laboratorium Embriologi, Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari hingga Juli 2013.
Bahan
Galohgor serbuk dan Galohgor ekstrak dibuat berdasarkan prosedur yang telah dijelaskan pada Bab 3. β-karoten (BCA) yang digunakan adalah β-karoten dengan kemurnian 99% (Sigma) yang dilarutkan dalam pelarut tetrahydrofuran (THF) (Sigma) hingga konsentrasi akhir dalam medium 1.25%. Medium kultur sel terdiri atas DMEM (Gibco). Jenis antibiotik yang digunakan meliputi penisilin, streptomisin, dan gentamisin. Serum yang digunakan untuk kedua jenis sel adalah heat-inactivated Fetal Bovine Serum (FBS).
Kit 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) (Roche) digunakan untuk analisis proliferasi sel. Kit Rneasy (Qiagen) digunakan untuk isolasi RNA dan Kit Takara digunakan untuk analisis reverse transriptase polymerase chain reaction (RT PCR).
Metode
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan metode in vitro menggunakan rancangan acak lengkap (RAL). Kontrol dan perlakuan ditentukan dengan perbedaan konsentrasi β-karoten dalam larutan medium, yaitu sebesar 0.5, 1.5, dan 5.0 µM/mL.
Unit percobaan dalam penelitian ini adalah sel epitel saluran cerna (CMT- 93) dalam cawan kultur. Jumlah ulangan parameter ekspresi gen dan diferensiasi sel berjumlah tiga atau empat, sedangkan untuk proliferasi sel masing-masing enam ulangan. Konsentrasi sel pada awal kultur dalam setiap cawan/ulangan sebesar 1 x 105 sel/mL. Prosedur penelitian selengkapnya dijelaskan pada Bab 3.
Parameter yang diamati antara lain 1) proliferasi dan viabilitas sel dengan MTT assays; 2) morfologi sel dengan pengamatan langsung di bawah mikroskop fluorescent (Olympus), 3) ekspresi gen Aldh1a2 metode RT-PCR dan gel elektroforesis.
Analisis Data
Semua data kualitatif disajikan secara deskriptif. Data kuantitatif diuji dengan menggunakan Analysis of Variance (ANOVA) yang dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan/Dunnet untuk menentukan beda nyata antarperlakuan.
Hasil
Proliferasi Sel Epitel Usus (CMT 93)
Perlakuan Galohgor ekstrak (GE) pada konsentrasi suprafisiologis GE [5.0 μM] dan Triton X-114 (1.25%) menurunkan proliferasi sel epitel usus (CMT-93) secara signifikan (p<0.05) dibandingkan dengan kontrol. Sebaliknya, perlakuan ekstrak pada konsentrasi suprafisiologis tidak menyebabkan perbedaan proliferasi sel (Gambar 7).
Triton X-114 digunakan sebagai kontrol negatif karena dapat menekan proliferasi. Triton X-114 memiliki sifat toksik dan dapat menekan viabilitas sel.
29 Hal ini karena Triton X-114 mempunyai sifat yang mirip deterjen yang dapat menyebabkan kerusakan struktur lipoprotein dan fosfolipid pada membran sel (Malen et al. 2010).
Gambar 7 Nilai absorbansi hasil MTT assays pada kontrol negatif (Triton X-114 1.25%) perlakuan Galohgor ekstrak (GE), Galohgor serbuk (GS) dengan berbagai dosis (0.5, 1.5 dan 1.5 μM) dibandingkan dengan kontrol. Tanda *) pada grafik menunjukkan hasil ANOVA yang beda nyata pada p<0.05.
Pengaruh β-karoten pada Morfologi CMT-93
Gambar 8 menunjukkan morfologi sel CMT-93 yang mendapat perlakuan Galohgor ekstrak (GE) dan Galohgor serbuk (GS) dibandingkan dengan kontrol. Sel yang diberi Galohgor serbuk pada konsentrasi fisiologis (GS 0.5μM) menunjukkan perkembangan struktur sel yang tidak berbeda dari kontrol, namun tampak ukuran sel menjadi lebih besar dan lebih kompak. Pada perlakuan dengan Galohgor ekstrak (GE), pada konsentrasi GE 1.5 dan 5.0 μM, terlihat banyak sel yang mengalami degenerasi dan piknotik.
0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 Kontrol Triton 1,25% GE [5μM] GE [1.5μM] GE [0.5μM] GS [5.0μM] GS [1.5μM] GS [0.5μM] *) *)
30
Gambar 8 Morfologi sel CMT-93 dalam medium kontrol (A), THF 1.25% (B), BCA 0.1 µM (C), BCA 0.5 µM (D), BCA 1.5 µM (E), dan BCA 5.0 µM (F).
Ekspresi Gen Aldh1a2
Hasil analisis RT-PCR menunjukkan bahwa Galohgor ekstrak dan Galohgor serbuk mempengaruhi ekspresi gen Aldh1a2 oleh sel epitel usus (CMT-93) (Gambar 9). Hal ini diduga karena adanya β-karoten dalam Galohgor ekstrak dan Galohgor serbuk. Gen Gadph terekspresi pada semua sel yang ditumbuhkan dalam medium kontrol (DMEM) maupun perlakuan. Hal ini karena Gapdh merupakan gen yang mengkode enzim yang berperan dalam mempertahankan kondisi homeostatis pada sel (housekeeping enzyme).
Gambar 9 Ekspresi gen Gadph and Aldh1a2 pada sel CMT-93 kontrol negatif (neg) dan perlakuan Galohgor Ekstrak (GS 1.5μM), Galohgor Serbuk (GS 5.0µM dan GS 1.5 µM) (Keterangan: A= Aldh1a2, G = Gadph).
Pembahasan
Selain menunjukkan tingkat proliferasi berdasarkan jumlah sel yang masih hidup, MTT assays juga dapat digunakan untuk menguji tingkat toksisitas suatu
31 bahan. Semakin banyak sel yang mati, atau semakin rendah nilai absorbansi, berarti semakin toksik suatu bahan (Roosita et al. 2013). Hasil MTT assays pada penelitian ini juga menunjukkan bahwa Galohgor serbuk tingkat toksiknya lebih rendah jika dibandingkan Galohgor ekstrak yang menggunakan etanol sebagai pelarut dalam proses ekstraksi. Hal ini ditunjukkan dengan hasil bahwa secara signifikan konsentrasi suprafisiologis Galohgor ekstrak GE [5.0 μM] dapat menekan proliferasi, sedangkan pada konsentasi yang sama pada Galohgor serbuk tidak menekan proliferasi. Etanol yang digunakan sebagai pelarut dalam pembuatan Galohgor ekstrak diduga telah menarik lebih banyak senyawa bersifat nonpolar yang diduga dalam jumlah berlebih bersifat toksik.
Selain itu β-karoten dalam Galohgor Ekstrak (GE) memiliki kelarutan yang lebih tinggi dibandingkan Galohgor serbuk (GS) pada saat pembuatan larutan stok. Hasil ini selaras dengan penelitian sebelumnya (Roosita et al. 2013) yang menunjukkan bahwa β-karoten dengan konsentrasi suprafisiologis dapat menekan proliferasi pada sel epitel usus (CMT-93) (5.0μM). Hasil penelitian Wojcik et al. (2008) yang juga menunjukkan hasil yang selaras dan menyimpulkan bahwa β- karoten pada konsentrasi suprafisiologis [5.0 µM] dapat menekan proliferasi pada sel oval secara in vitro.
Perubahan morfologis terlihat pada morfologi sel CMT-93 subkonfluen yang diberi perlakuan Galohgor ekstrak dan Galohgor serbuk konsentrasi tinggi [5.0μM dan 1.5 μM]. Sel-sel tersebut mengalami perubahan ukuran, beberapa mulai menunjukkan degenerasi dan piknotik. Perubahan struktur morfologis pada sel CMT 93 diduga terjadi karena pemberian Galohgor ekstrak yang mengandung β-karoten lebih tinggi dari konsentrasi fisiologisnya.
Hasil ini sesuai dengan penelitian sebelumnya (Roosita et al., 2013) yang menunjukkan bahwa pada konsentrasi suprafisiologis (5.0μM) β-karoten dapat menekan proliferasi dan mempengaruhi morfologi sel epitel CMT-93. Sementra itu, Koshy et al. (1996) menjelaskan bahawa perubahan morfologi pada epitel usus manusia berkorelasi dengan adanya perubahan mikrofilamen aktin dan volume sel. Perubahan ini terjadi antara lain akibat perubahan struktur tight junction dan epitel usus yang terpolarisasi pada proses detoksifikasi.
Penelitian ini juga mengungkapkan bahwa Galohgor ekstrak dan Galohgor serbuk mempengaruhi ekspresi gen Aldh1a2 oleh sel epitel usus (CMT-93) (Gambar 3). Hal ini diduga karena adanya β-karoten dalam Galohgor ekstrak dan Galohgor serbuk. Hasil ini sesuai dengan penelitian Roosita et al. (2013) yang menunjukkan bahwa β-karoten dapat meningkatkan ekspresi gen Aldh1a2 pada sel epitel usus (CMT-93).
Jackson et al. (2011) dan Duester (2000) menjelaskan peranan Aldh1a2 dalam metabolisme β–karoten untuk diubah menjadi asam retinoat. Sebelumnya, proses tersebut didahului oleh kerja enzim β-karoten-15,15- dioksigenase yang mengkonversi β-karoten menjadi retinal. Selanjutnya, perubahan retinal menjadi asam retinoat ini memerlukan bantuan serangkain enzim aldehyde dehidrogenase yang salah satunya dikode oleh Aldh1a2. Asam 9-cis-retinoat memiliki fungsi sebagai ligan untuk reseptor asam retinoat RAR di inti sel (nucleus) yang mengatur ekspresi gen.
32
Simpulan
Galohgor ekstrak pada konsentrasi tingggi [5.0 μM] secara signifikan (p<0.05) dapat menekan proliferasi dan mempengaruhi morfologi sel epitel usus (CMT-93). β-Karoten dalam Galohgor ekstrak dan Galohgor serbuk mempengaruhi ekspresi gen Aldh1a2 pada sel epitel usus CMT-93.
33