BAB III METODE PENELITIAN
3.6 Definisi Operasional
Aktifitas Fisik Maksimal adalah kerja fisik maksimal yang menyangkut sistem lokomotor tubuh yang ditujukan dalam menjalankan aktifitas hidup sehari-harinya, dalam penelitian ini aktifitas maksimal berupa renang sekuat-kuatnya sampai hampir
tenggelam atau nampak tanda-tanda kelelahan berupa tenggelamnya hampir semua badan kecuali hidung dan melemahnya gerakan anggota gerak. Lamanya renang berkisar antara 25-45 menit. (Jawi,2001)
Jumlah Leukosit yaitu jumlah total leukosit yang diambil dari darah tepi yang diperiksa dengan menggunakan Kamar Hitung Improved Neubaeur dengan satuan sel/mm3.
Hitung Jenis Leukosit yaitu jenis-jenis leukosit yang diambil dari darah tepi yang diperiksa pada sediaan hapusan darah dengan mikroskop dengan satuan %.
3.7. Bahan
a) Darah EDTA
b) Larutan Turk untuk hitung jumlah leukosit.
c) Larutan ØGiemsa untuk pembuatan hapusan darah yang berguna untuk
pemeriksaan hitung jenis leukosit.
d) Minyak imersi
3.8. Alat
Peralatan yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah :
a) Stop watch untuk menghitung waktu atau lamanya mencit dapat berenang sampai
hampir tenggelam.
b) Pipet Leukosit
d) Objek glass (kaca objek) dan deck glass
e) Mikroskop cahaya
f) Bak yang dirancang dengan ukuran panjang 10 cm dan diameter 25 cm, dimana
hanya untuk satu ekor mencit berenang. (Ozaslan, M et al, 2004)
3.9. Pelaksanaan Penelitian
3.9.1. Penerbitan ethical clearance
Diminta penerbitan ethical clearance kepada komisi etik Fakultas Kedokteran
Universitas Sumatera Utara. 3.9.2. Pemeliharaan hewan coba
Sebelum perlakuan, semua mencit diadaptasikan dan dipelihara secara berkelompok (empat ekor mencit per kandang) dalam kandang hewan coba Jurusan
Biologi FMIPA Universitas Negeri Medan, yang terbuat dari bahan plastik ( 30 x 20 x 10 cm) yang ditutup dengan kawat kasa halus. Makanan berupa pellet dan
minuman (air PAM) secara berlebih (ad libitum). Dasar kandang dilapisi dengan
sekam padi setebal 0,5 – 1 cm dan diganti setiap hari. Cahaya ruangan pemeliharaan dikontrol persis 12 jam terang dan 12 jam gelap, sedangkan temperatur dan kelembaban ruangan dibiarkan berada pada kisaran alamiah.
3.9.3. Perlakuan hewan coba
a) Sebelum perlakuan, diambil darah dari pangkal ekor mencit, kenudian dilakukan
pemeriksaan jumlah leukosit dengan alat Haemocytometer dan pemeriksaan hitung jenis leukosit.
b) Selanjutnya mencit satu persatu diberikan perlakuan aktifitas fisik maksimal berupa renang sekuat-kuatnya sampai hampir tenggelam atau nampak tanda-tanda kelelahan berupa tenggelamnya hampir semua badan kecuali hidung dan melemahnya gerakan anggota gerak. Lamanya renang berkisar antara 25-45 menit (Jawi, 2001).
c) Mencit diberi stimulus ((kepalanya ditekan kedalam air) agar terus tetap berenang
sekuat-kuatnya sampai hampir tenggelam sehingga aktifitas fisik maksimal mencit tercapai.
d) Untuk memastikan bahwa mencit benar-benar telah melakukan aktifitas fisik
maksimal, peneliti dibantu oleh tim independen dari fakultas olahraga UNIMED.
e) Selanjutnya diambil darah dengan segera secara intrakardial
f) Kemudian dilakukan pemeriksaan jumlah leukosit dan hitung jenis leukosit.
3.9.4. Prosedur pemeriksaan jumlah leukosit
Alat yang diperlukan : a. Pipet Leukosit
b. Kamar hitung Improved Neubauer c. Deck glass
Reagensia : Larutan Turk, saring sebelum dipakai
Cara Pemeriksaan :
1. Sampel darah kapiler atau darah EDTA / Oksalat Wintrobe
2. Pipet lekosit diisi dengan darah sampai garis 0,5 bila diduga lekopeni sampai
garis 1, bersihkan ujung pipet dengan kertas tissue
angka 11, letakkan pipet horizontal untuk menghindari mengalirnya larutan keluar
4. Ujung pipet ditekan dengan kedua jari kemudian digoyang membuat angka 8
selama 3 sampai 5 menit
5. Buang 3 tetes larutan tersebut, kemudian dnegan membuat sudut 30 derajat
teteskan larutan ke dalam kamar hitung yang telah ditutup dengan kaca penutup
6. Diamkan kamar hitung selama 2 menit
7. Hitung dibawah mikroskop dengan pembesaran 10 x bidang besar kamar. Hitung
A+B+C+D
8. Perhitungan :Pengencer pipet 20 x luas bidang besar 1 mm2 dan tinggi kamar
hitung 1/10 mm. Lekosit yang dihitung dalam 4 bidang besar adalah A+B+C+D,
jumlah luasnya 4 mm3. Faktor perkalian 50 kali Jumlah lekosit adalah
(A+B+C+D) x 50 /mm3 (Depkes, 1992)
A B
C D
Gambar 3. Kamar Hitung Improved Neubauer 3.9.5 Prosedur pemeriksaan hitung jenis leukosit
3.9.5.1. Cara membuat sediaan hapus
1. Letakkan satu tetes kecil darah, pada 2 - 3 mm dari ujung kaca objek. Letakkan kaca penghapus dengan sudut 30 - 45 derajat terhadap kaca objek di depan tetes darah.
sampai darah menyebar pada sudut tersebut.
3. Dengan gerak yang mantap doronglah kaca penghapus sehingga terbentuk
hapusan darah sepanjang 3-4 cm pada kaca objek.
4. Biarkan hapusan darah mengering di udara. (Depkes, 1992)
Gambar 4. Cara Membuat Sediaan Hapus 3.9.5.2. Cara mewarnai sediaan hapus
1.Letakkan sediaan hapus pada dua batang gelas di atas bak tempat pewarnaan.
2.Fiksasi sediaan hapus dengan metanol absolut selama 2-3 menit.
3.Genangi sediaan hapus dengan zat warna Giemsa 5%. Biarkan selama 20-30 menit.
4. Bilas dengan air, mula-mula dengan aliran lambat kemudian lebih kuat dengan tujuan menghilangkan semua kelebihan zat warna. Biarkan mengering.
3.9.5.3.Pemeriksaan hitung jenis leukosit
1. Periksa hapusan darah yang telah diwarnai dan dikeringkan di bawah mikroskop
dengan pembesaran 10 x, cari bagian dimana eritrosit tersebar merata. Biasanya terdapat di bagian tipis sediaan.
2. Lensa obyektif diganti dengan pembesaran 40x, kemudian 100x dan sediaan
diberi minyak emersi.
3. Golongkan dan catat tiap sel berinti pada daerah yang dilalui sampai genap 100
sel. Kemudian masing-masing dibuat persentasenya. (Depkes, 1992) Nilai normal hitung jenis lekosit : (Dharma, 2007)
Eosinofil : 1 – 3 % Neutrofil Segmen : 50 -70 %
Basofil : 0 – 1 % Limfosit : 20 - 40 %
Neutrofil Batang : 2 – 6 % Monosit : 2 - 8 %
3.10. Analisa Data
Setiap data yang didapat terlebih dulu ditentukan distribusinya dengan uji Normalitas. Apabila data berdistribusi normal akan dilakukan uji t berpasangan dengan = 0.05, untuk melihat perbedaan hitung leukosit dan hitung jenis sel leukosit antara sebelum dan sesudah aktifitas fisik maksimal sedangkan apabila data berdistribusi tidak normal akan dilanjutkan dengan uji non parametrik.
3.11. Jadwal Penelitian
Keseluruhan kegiatan penelitian dari persiapan sampai pada penulisan hasil penelitian adalah lebih kurang lima minggu. Urutan kegiatan dan jadwal pelaksanaan secara lengkap dapat dilihat pada tabel berikut ini.
Tabel 2. Jadwal Pelaksanaan Penelitian MINGGU KE NO KEGIATAN 1 2 3 4 5 1 PERSIAPAN √ 2 PELAKSANAAN √ √ 3 ANALISA DATA √ 4 PENULISAN HASIL √
3.12. Kerangka Kerja
Pemeliharaan Hewan Coba (Tujuh Hari)
Pengambilan darah melalui pangkal ekor mencit
Aktifitas fisik maksimal berupa renang sekuat-kuatnya sampai hampir tenggelam
Pengambilan darah intrakardial
Pemeriksaan
Hitung Jenis Leukosit
Uji Statistik Pemeriksaan
Jumlah Leukosit