BAB III. METODE PENELITIAN
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional
2. Definisi operasional
a. Daun M. tanarius adalah daun yang diambil dari tanaman M. tanarius, memiliki daun yang berwarna hijau, tidak berlubang dan segar
b. Ekstrak metanol-air daun M. tanarius berupa ekstrak kental yang diperoleh dengan mengekstraksi serbuk kering daun M. tanarius seberat 10 gram yang dilarutkan dalam 100 ml pelarut metanol 50% secara maserasi selama 72 jam. Kemudian disaring dengan kertas saring dan diuapkan di oven selama 24 jam. c. Larutan ekstrak metanol-air daun M. tanarius pekat adalah larutan dengan
konsentrasi 38,4% yang diperoleh dengan cara melarutkan ekstrak metanol-air daun M. tanarius seberat 1,92 gram dengan CMC Na 1% ke dalam labu ukur 5 ml.
d. Dosis ekstrak metanol-air daun M. tanarius adalah sejumlah berat ekstrak metanol-air daun M. tanarius tiap satuan berat badan hewan uji dengan satuan mg/kg BB.
e. Efek antiinflamasi adalah kemampuan suatu zat untuk mengurangi udema pada kaki hewan uji akibat injeksi karagenin 1% subplantar.
f. Metode Langford termodifikasi dilakukan dengan menggunakan mencit betina galur Swiss sebagai hewan uji yang diradangkan telapak kaki kirinya dan diukur bobot udema kakinya dengan cara memotong kedua kaki belakang mencit pada sendi torsocrural, kemudian ditimbang dan dihitung selisih bobot kaki kiri dan kanan hewan uji tersebut. Bobot udema kelompok perlakuan kemudian dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif.
g. Uji antiinflamasi adalah uji dengan menggunakan mencit galur Swiss sebagai hewan uji yang diradangkan telapak kaki kirinya, dan diukur bobot kedua kaki belakangnya dengan menggunakan neraca analitik (Mettler Toledo), kemudian dibandingkan dengan perlakuan per oral ekstrak metanol-air daun M. tanarius. h. Injeksi sub plantar adalah injeksi pada telapak kaki hewan uji, arah jarum harus
menuju ke jari-jari hewan uji.
i. Sendi torsocrural adalah sendi pada hewan uji yang terdapat pada pergelangan kaki bagian bawah.
C. Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain sebagai berikut:
1. Hewan uji yang digunakan yaitu mencit betina galur Swiss, dengan umur 2-3 bulan, berat badan 20-30 g yang diperoleh dari Laboratorium LPPT Universitas Gajah Mada Yogyakarta.
2. Bahan uji yang digunakan adalah daun M. tanarius yang dipanen pada bulat Maret 2010 dan diperoleh dari Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
3. Zat inflamatogen : Karagenin tipe I (Sigma Chemical Co.), yang diperoleh dari Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
4. Tablet Cataflam D 50 (Novartis Indonesia) yang mengandung kalium diklofenak 50 mg sebagai kontrol positif diperoleh dari Apotek Dina Farma.
5. NaCl fisiologis 0,9 % (Otsuka) sebagai pelarut karagenin diperoleh dari Apotek Kimia Farma.
6. Carboxymethylcellulose-natrium (Dai-Ichi Seiyaku Co., Ltd.), sebagai pensuspensi ekstrak metanol-air daun M. tanarius diperoleh dari Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi, Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
7. Aquades diperoleh dari Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
D. Alat atau Instrumen Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari : 1. Alat ekstraksi
a. Oven (Memmert)
b. Mesin penyerbuk (Retsch) c. Ayakan
d. Seperangkat alat gelas berupa gelas beker, erlenmeyer, gelas ukur, labu ukur, cawan porselen, pipet tetes, batang pengaduk (Pyrek Iwaki Glass)
e. Shaker
2. Alat induksi udema telapak kaki belakang a. Gunting bedah
b. Spuit injeksi 1 mL yang digunakan untuk pemberian peroral memiliki jarum yang ujungnya berbentuk bulat dan berlubang di bagian tengah (Terumo) c. Spuit injeksi 1 mL yang memiliki ujung runcing dan digunakan untuk
pemberian secara intraperitoneal (Terumo) 3. Lain-lain
a. Kamera digital
b. Neraca analitik (Mettler Toledo, Germany) c. Timbangan
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Determinasi tanaman M. tanarius menggunakan biji, bunga, daun, batang yang dilakukan secara benar sesuai dengan buku acuan, di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Pengumpulan bahan
Daun M. tanarius diperoleh dari kebun obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta yang di panen pada bulan Maret 2010. Daun yang diambil adalah daun segar yang berwarna hijau dan tidak berlubang.
3. Pembuatan simplisia
Pembuatan simplisia daun M. tanarius yang telah dikumpulkan, dicuci dengan air mengalir, kemudian ditiriskan dengan sinar matahari, untuk meniadakan air pada daun. Selanjutnya daun dikeringkan kembali menggunakan oven pada suhu 40-50 0C selama 24 jam dan diserbuk menggunakan mesin penyerbuk di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Kemudian serbuk simplisia diayak menggunakan ayakan nomor 40.
4. Pembuatan ekstrak metanol-air daun M. tanarius
Seberat 10 gram serbuk kering daun M. tanarius dilarutkan dengan 100 ml metanol 50 % pada erlenmeyer bersumbat. Kemudian diekstraksi secara maserasi selama 72 jam. Setelah 72 jam saring larutan hasil maserasi tadi pada cawan porselen menggunakan kertas saring. Kemudian uapkan di oven dengan suhu 40 0C selama 24
jam hingga diperoleh bobot tetap ekstrak. Buat sebanyak 6 replikasi. Kemudian akan didapatkan rendemen rata-rata ekstrak kental daun M. tanarius sebesar 1,92 gram. 5. Penetapan konsentrasi pekat ekstrak metanol-air daun M. tanarius
Ekstrak daun M. tanarius yang kental dihitung rata-rata rendemennya dari ke-6 replikasi yang telah dibuat.
Setelah didapat rata-rata rendemennya maka dapat ditetapkan konsentrasi ekstrak. Konsentrasi yang digunakan adalah konsentrasi terpekat yang dapat dibuat dan dapat dimasukkan serta dikeluarkan dari spuit oral 1 ml adalah dengan cara melarutkan ekstrak percawannya yaitu 1,92 gram dalam labu ukur terkecil dengan pelarut yang sesuai yaitu CMC Na 1%. Labu ukur terkecil yang tersedia yaitu labu ukur 5 ml sehingga dapat ditetapkan konsentrasi ekstrak metanol-air dari daun M. tanarius sebesar 0,384 atau 384 atau 38,4%.
6. Penetapan dosis ekstrak metanol-air daun M. tanarius
Dalam penelitian ini, ekstrak metanol-air daun M. tanarius dibuat dalam tiga peringkat dosis, yaitu 711 mg/kg BB; 2133 mg/kg BB; dan 6400 mg/kg BB. Dasar penetapan peringkat adalah bobot tertinggi mencit dan pemberian cairan secara peroral separuhnya yaitu ml
Perhitungan dosis ekstrak metanol-air daun M. tanarius yang diuraikan sebagai berikut:
Keterangan: D = dosis (mg/kg)
BB = berat badan mencit (g) C = konsentrasi (g/ml) V = volume (ml)
Penetapan dosis tertinggi ekstrak metanol-air daun M. tanarius:
Peringkat dosis dalam penelitian:
7. Penyiapan hewan uji
Hewan uji yang dibutuhkan adalah 59 ekor mencit betina galur Swiss, umur 2-3 bulan, berat badan 20-30 g. Hewan uji dibagi secara acak menjadi 2 kelompok. Kelompok untuk uji pendahuluan sebanyak 24 ekor dan kelompok perlakuan sebanyak 35 ekor. Sebelum digunakan, hewan uji dipuasakan selama 18-24 jam tanpa menghentikan pemberian minum. Kelompok perlakuan terdiri dari 5 kelompok yang masing-masing terdiri dari 5 ekor.
8. Pembuatan larutan karagenin 1 %
Larutan karagenin yang digunakan sebagai zat peradang dibuat dengan dengan cara : 100,0 mg karagenin dilarutkan dalam NaCl fisiologis (0,90%) hingga volume 10,0 ml, akan diperoleh larutan karagenin 1% (b/v) yang setara dengan dosis 25 mg/kgBB. Perhitungan karagenin adalah sebagai berikut
9. Pembuatan CMC-Na 1 %
CMC-Na sebanyak 1,0 g dilarutkan dengan aquades hangat sampai 100,0 ml, kemudian aduk sampai diperoleh larutan yang homogen.
10. Pembuatan larutan diklofenak
Tablet Cataflam D 50 yang mengandung kalium diklofenak 50 mg sebanyak 20 tablet diuji keseragaman bobotnya. Diambil 1 tablet Cataflam D 50 yang mengandung kalium diklofenak 50 mg yang telah diuji keseragaman bobotnya tersebut, digerus dalam mortir, lalu dilarutkan dalam aquades hingga volume 100,0 ml sehingga diperoleh konsentrasi 0,819 mg/ml.
Dosis diklofenak dipilih berdasarkan penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya (Djunarko, Donatus, dan Noni, 2003). Menurut penelitian, dosis diklofenak untuk tikus dengan berat badan 250 gram adalah 40 mg/kgBB.
Dosis diklofenak untuk tikus dengan berat badan 200 gram adalah (200 gram x 40 mg/kgBB) : 250 gram = 32 mg/kgBB. Dari tikus dengan berat badan 200
gram kemudian dikonversikan ke mencit dengan berat badan 20 gram, perhitungannya sebagai berikut :
0,14 x 32 mg/kgBB = 4,48 mg/kgBB
Sehingga dosis diklofenak untuk mencit dengan berat badan 20 gram adalah 4,48 mg/kgBB. Kemudian digunakan satu dosis lain yang diperoleh dari dosis lazim pemakaian diklofenak pada manusia 50 kg adalah 75 mg (Anonim, 2000). Dosis diklofenak untuk manusia 70 kg adalah (70 kg x 75 mg) : 50 kg = 105 mg. Dari manusia dengan berat badan 70 kg kemudian dikonversikan ke mencit dengan berat badan 20 gram, perhitungannya sebagai berikut :
0,0026 x 105 mg = 0,273 mg
Sehingga dosis diklofenak untuk mencit dengan berat badan 20 gram adalah 0,273 mg/20 gramBB atau 13,65 mg/kgBB. Dosis diklofenak yang digunakan sebagai dosis orientasi adalah 4,48 dan 13,65 mg/kgBB.
11. Uji Pendahuluan
a. Uji pendahuluan waktu pemotongan kaki setelah injeksi karagenin 1%
Dua belas ekor hewan uji dibagi dalam 4 kelompok, tiap kelompok diberi perlakuan pada kaki kiri bagian belakang diinjeksi dengan suspensi karagenin 1 % subplantar, kaki kanan diinjeksi dengan spuit injeksi subplantar tanpa suspensi karagenin 1 %. Kemudian hewan uji dikorbankan pada selang waktu tertentu, yaitu 1, 2, 3, dan 4 jam setelah injeksi karagenin subplantar, lalu kedua kaki belakangnya dipotong pada sendi torsocrural dan ditimbang. Waktu yang menunjukkan bobot
udema paling besar dijadikan acuan untuk perlakuan dengan karagenin 1% selanjutnya.
b. Uji pendahuluan dosis efektif dan rentang waktu pemberian dosis efektif diklofenak
Waktu pemberian dosis efektif diklofenak dipilih berdasarkan penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya, yaitu 15 menit (Esvandiary, 2006; Martin, 2010; Gunawan, 2010) dan 30 menit (Hidayat, 2010). Dalam penetapan ini dilakukan digunakan 12 ekor yang terbagi dalam 4 kelompok. Kelompok I, II, III, dan IV secara berturut-turut diberikan pemberian p.o. diklofenak dengan dosis 4,48 mg/kgBB dengan rentang waktu pemberian 15 menit, dosis 13,65 mg/kgBB dengan rentang waktu pemberian 15 menit, dosis 4,48 mg/kgBB dengan rentang waktu pemberian 30 menit, dan dosis 13,65 mg/kgBB dengan rentang waktu pemberian 30 menit sebelum injeksi karagenin 1% secara subplantar. Tiga jam setelah injeksi karagenin, dilakukan pengukuran udem. Waktu efektif pemberian diklofenak merupakan rentang waktu antara sesaat setelah pemberian diklofenak sampai saat injeksi karagenin, yang mampu menurunkan udem secara berarti.
12. Perlakuan hewan uji
Tiga puluh lima ekor mencit dibagi secara acak menjadi 7 kelompok, masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor dengan perlakuan sebagai berikut:
a. kelompok I : kelompok kontrol negatif karagenin 1%
b. kelompok II : kelompok kontrol negatif aquades sebagai pelarut diklofenak c. kelompok III : kelompok kontrol negatif CMC-Na 1% sebagai pelarut
ekstrak metanol-air daun M. tanarius
d. kelompok IV : kelompok kontrol positif diklofenak secara peroral dengan dosis 13,65 mg/kgBB
e. kelompok V : kelompok perlakuan ekstrak metanol-air daun M. tanarius dengan dosis 711 mg/kgBB
f. kelompok VI : kelompok perlakuan ekstrak metanol-air daun M. tanarius dengan dosis 2133 mg/kgBB
g. kelompok VII : kelompok perlakuan ekstrak metanol-air daun M. tanarius dengan dosis 6400 mg/kgBB
Setelah hewan uji dikelompokkan dan diberi perlakuan secara peroral, 15 menit kemudian diinjeksi dengan larutan karagenin 1% secara subplantar pada kaki kiri sementara kaki kanan disuntik dengan spuit tanpa larutan karagenin. Tiga jam kemudian hewan uji dikorbankan, kedua kaki belakang dipotong pada sendi torsocrural kemudian ditimbang bobot masing-masing kaki (kanan dan kiri).
13. Perhitungan daya antiinflamasi
Metode Langford yang telah dimodifikasi digunakan untuk mengetahui efek anti inflamasi, yang dihitung dalam persen (%) daya anti inflamasi dengan rumus sebagai berikut :
Keterangan :
U = harga rata-rata berat kelompok karagenin (kaki kiri) dikurangi rata-rata berat kaki normal (kaki kanan)
D = harga rata-rata berat kaki kelompok perlakuan (kaki kiri) dikurangi rata-rata berat kaki normal (kaki kanan)
14. Perhitungan prosentase relatif daya antiinflamasi
Untuk mengetahui % potensi relatif daya antiinflamasi ekstrak metanol-air daun M. tanarius terhadap diklofenak sebagai kontrol positif digunakan rumus :
Keterangan : DAp = % daya antiinflamasi kelompok perlakuan DAd = % daya antiinflamasi larutan diklofenak
