Penemuan 8-OHdG dilaporkan pertama kali oleh Kasai dan Nishimura pada tahun 1984 di dalam usaha mereka untuk mempelajari dan mengisolasi mutagens pada
34
glukosa yang dipanaskan (seperti model makanan yang dimasak). Karena kesulitan mengisolasi mutagens yang sangat tidak stabil, metode dikembangkan dengan memeriksa mutagen reaktif yang merupakan derivatif guanine dari kenyataan yang ada jika karsinogen dan reaksi mutagen dengan basa asam nukleat, dalam hal ini guanine. Peneliti yang sama menemukan radikal bebas oksigen berkembang pada reaksi C-8 oksidasi. Beberapa tahun kemudian bentuk 8-OHdG dapat dikonfirmasi dalam reaksi yang melibatkan radikal bebas oksigen seperti serat asbes dan H2O2. Beberapa tahun kemudian kadar 8-OHdG dapat dideteksi dan dianalisis dengan sensitifitas yang tinggi dengan menggunakan high-performance liquid chromatography (HPLC), gas-chromatography-mass spectrometry (GC-MS) dan liquid chromatograpy-mass spectrometry-mass spectrometry (LC-MS-MS) dan metode imunohistokimia dan eletroforesis pada sel tunggal. Pemeriksaan dan analisis 8-OHdG dapat menggunakan organ hewan dan sampel pada manusia seperti urin, leukosit DNA, serum, cairan cerebrospinal, organ manusia) dapat dipakai sebagai biomarker stress oksidatif , proses penuaan dan karsinogenesis.
Seperti yang telah disebutkan sebelumnya bahwa peningkatan stress oksidatif dapat menyebabkan radikal bebas menyerang molekul-molekul yang secara fisiologis sangat penting seperti lipid, protein termasuk enzim dan DNA. Sebagai akibat lanjutan dari kerusakan terhadap purin dan pirimidin akan terjadi modifikasi DNA yang teroksidasi. Guanin dapat diserang oleh OH-. pada posisi C-8 menghasilkan 8-hidroksideoksiguanosin (8-OHdG) sebagai produk oksidasinya.
35
Posisi lain juga dapat diserang dan produk-produk lainnya mungkin saja terbentuk. Di antara basa-basa yang teroksidasi itu 8-hidroksi-2’-deoksiguanosin yang terbanyak jumlahnya (Helbock, dkk., 1998)
Gambar 2.8. Mekanisme pembentukan produk oksidasi guanin oleh radikal hidroksil (Kohen dan Nyska, 2002)
Produk lesi dari oksidasi oleh radikal hidroksil adalah 8-hidroksiguanin, bersama dengan ekivalennya 8-hidroksi-2’-deoksiguanosin (8-OHdG) sangat mutagenik. Komponen ini menyebabkan mutasi (transversi) A:T menjadi C:C atau G:C menjadi T:Aoleh karena pasangan basanya dengan adenin sebaik sitosin (Kohen dan Nyska, 2002).
Radikal hidroksil juga dapat menyerang basa yang lain seperti adenin untuk membentuk 8 (atau 4-,5-) hidroksiadenin. Produk-produk lain hasil interaksi antara pirimidin dengan radikal hidroksil yaitu tiamin perokside, tiamin glikol, 5 (hidroksimetil) urasil dan produk-produk lainnya. Interaksi langsung lain antara ROS yang kurang reaktif seperti O.2- dan H2O2 tidak menimbulkan kerusakan pada jumlah fisiologi, tapi bagaimanapun produk ini adalah sumber–sumber intermediat reaktif yang mudah diserang dan menyebabkan kerusakan. Seperti
36
contoh H2O2 dan superoksid dapat menurunkan OH.- melalui reaksi Haber-Weiss/Fenton, NO dan O.2- dapat menurunkan formasi ONOO- dan mudah menyebabkan kerusakan DNA sama seperti kerusakan yang melibatkan radikal hidroksil. Transisi metal seperti besi yang menguasai high-binding affinity terhadap lokasi DNA dapat mengkatalisis produksi OH- dan memastikan serangan berulang atas DNA selain oleh karena radikal hidroksil sendiri.
Delapan-hidroksi-2’-deoksiguanosin (8-OHdG) adalah indikator kerusakan DNA yang sensitif sebagai akibat stress oksidatif. Disebutkan bahwa komponen yang dihasilkan melalui DNA yang rusak diakibatkan oleh radiasi, radikal hidroksil, superoksid atau peroksinitrit. Delapan-hidroksi-2’deoksiguanosin itu sendiri mempunyai peran biologi yang mampu menginduksi konversi G:C ke T:A selama replikasi DNA. Adanya assay yang sensitif untuk 8-hidroksi-2’deoksiguanosin menyebabkan 8-hidroksi-8-hidroksi-2’deoksiguanosin ini dipakai di banyak laboratorium sebagai biomarker kerusakan oksidasi DNA (Hung, dkk., 2010, Valavanidis, dkk., 2009)
Faktor-faktor lain yang mendukung adalah :
1. Formasinya di DNA oleh beberapa spesies reaktif seperti singlet oksigen dan radikal hidroksil.
2. Kemampuan mutagenisitinya dalam menginduksi transversi GCTA.
3. Mekanisme multipel yang terlibat dalam pemindahan 8-OHdG dari DNA atau dalam mencegah penyatuan 8-OHdG ke dalam sel DNA, dengan asumsi bahwa sel “menganggap” 8-OHdG adalah sebuah ancaman yang segera harus dimusnahkan.
37
4. Karena prevalensi dan kemudahan dalam mendeteksi senyawa ini pada sampel-sampel biologik
Beberapa penelitian telah menguji pengaruh stress oksidatif terhadap kualitas oosit in vitro. Persentase oosit matur (tahap meiosis II oosit dengan polar body pertama) secara signifikan menurun dengan pemberian radikal H2O2 dosis tertentu tetapi dengan menginkubasi oosit dengan antioksidan (melatonin) dosis tertentu maka pengaruh radikal terhadap pematangan oosit dihambat (Umekawa, 2008). Mungkin sangat besar juga pengaruhnya terhadap kejadian ovum patologis/besarnya oosit berkualitas rendah yang dipicu kronisnya paparan oleh radikal hidroksil.
Kelainan kromosom sangat menonjol dalam penilaian dampak penyakit genetik yaitu sekitar 50% kematian mudigah, 5-7% kematian janin, 6-11 % lahir mati dan kematian neonatus dan 0,9% dari bayi lahir hidup. Gamet-gamet abnormal kecil kemungkinannya menghasilkan konsepsi dibandingkan dengan gamet normal. Apabila tetap terjadi pembuahan maka seleksi menyebabkan sebagian besar hasil konsepsi aneuploidi (kelainan kromosom) akan lenyap sebelum implantasi (Cunningham, dkk., 2006).
Dari beberapa penelitian tentang kualitas oosit, didapatkan kosentrasi 8-hidroksi-2’-deoksiguanosin pada cairan intrafolikel wanita yang menjalani IVF-ET diperoleh dengan tingkat degenerasi oosit yang tinggi (Umekawa, 2008). Oksigenasi intrafolikel yang rendah berhubungan dengan penurunan potensi berkembangnya oosit seperti yang direfleksikan dengan meningkatkan frekuensi kerusakan sitoplasma oosit, menyebabkan lemahnya pembelahan dan kelainan
38
agregasi kromosom oosit yang berasal dari folikel yang miskin vaskularisasi. ROS bertanggung jawab terhadap terjadinya fragmentasi embrio sebagai akibat peningkatan apoptosis. Sehingga dengan meningkatnya level ROS tidak memungkinkan pertumbuhan dan perkembangan embrio. Penelitian terkini lebih memfokuskan diri kepada kemampuan growth factors untuk melindungi keadaan embrio in vitro dari pengaruh ROS yang merugikan seperti apoptosis. Plasentasi yang abnormal mengarah kepada stress oksidatif plasenta yang merugikan sinsitiotrofoblast dan terlibat dalam mekanisme etiopatogenesis abortus. Puncak ekspresi dari marker stress oksidatif pada trofoblast terdeteksi pada kehamilan normal dan jika berlebihan akan menyebabkan abortus dini. (Agarwal, dkk., 2006) Perkembangan embrio awal pada mamalia terjadi melalui diferensiasi sistem organ dasar dalam lingkungan rendah oksigen. Kosentrasi oksigen yang rendah pada lingkungan in vitro embrio menurunkan level H2O2 selanjutnya mengurangi fragmentasi DNA dengan demikian memperbaiki kemampuan berkembang. Kosentrasi oksigen yang tinggi (sampai 20%) berhubungan dengan turunnya kompetensi berkembang sebaliknya perkembangan yang cepat terjadi saat kosentrasi oksigen di bawah 5%.
Reactive Oxygen Species (ROS) bisa didapatkan endogenous atau eksogenous tetapi keduanya dapat mempengaruhi oosit dan embrio. Kultur media IVF bisa merupakan sumber ROS eksogenous yang mempengaruhi oosit dan embrio preimplantasi. Pada hari pertama level ROS yang tinggi pada media kultur berhubungan dengan perkembangan embrio yang terlambat, fragmentasi yang tinggi, dan berkembangnya morfologi blastokista yang abnormal setelah kultur
39
yang lama. Korelasi yang signifikan telah dilaporkan antara peningkatan level ROS pada hari pertama media kultur dengan tingkat fertilisasi yang rendah pada pasien yang menjalani ICSI (Intra Cytoplasmic Sperm Injection).
Fertilisasi dan perkembangan embrio in vivo terjadi dalam lingkungan rendah tekanan oksigen. Tekanan oksigen yang rendah lebih efektif untuk implantasi dibandingkan dengan yang tinggi tekanan oksigen. Vaskularisasi folikel menentukan kandungan oksigen intrafolikuler serta kemampuan berkembangnya oosit. Hipoksia intrafolikuler menyebabkan kelainan agregasi kromosom dan gangguan mosaik embrio. Hal tersebut menjelaskan kembali bagaimana ROS dapat merusak oosit (Agarwal, dkk., 2006).
Pada kehamilan sendiri metabolisme akan meningkat sehingga memerlukan oksigen lebih banyak, maka semakin meningkat pula radikal bebas yang ditimbulkan. Stress oksidatif yang terjadi dapat mengganggu kehamilan jika antioksidan tidak dapat mengimbanginya. Secara umum sudah diterima bahwa kelainan kromosom fetus merupakan penyebab pada paling sedikit separuh dari abortus dini. (Hasegawa, dkk., 1996; Griebel, dkk., 2005; Cunningham, dkk., 2006)
Mekanisme pasti yang menyebabkan abortus tidak jelas, tetapi pada bulan-bulan awal kehamilan, ekspulsi secara spontan hampir selalu didahului oleh kematian mudigah atau janin, dan kelainan kromosom pada mudigah dan janin awal ini menyebabkan banyak atau sebagian besar abortus pada awal kehamilan (Cunningham, dkk.,2006)
40
Dengan mengetahui kadar 8-hidroksi-2’-deoksiguanosin ini, secara tidak langsung dapat diketahui agresi dari radikal bebas atau antioksidan yang bekerja melawan radikal bebas itu dalam hal ini pasien yang mengalami abortus iminens. Sehingga jika memang kadarnya signifikan berbeda dengan pasien normal, kita dapat melakukan pencegahan abortus dan bahkan abortus berulang salah satunya dengan pemberian antioksidan secara dini.
41 BAB 3