DENGAN METODE BRADFORD DAN LOWRY

TERHADAP PERTUMBUHAN MIKROORGANISME

DENGAN METODE BRADFORD DAN LOWRY

Kompetensi: Mahasiswa mampu melakukan pengukuran kadar protein mikroba

A. Dasar Teori

Uji Bradford adalah suatu uji untuk mengukur konsentrasi protein total dengan secara kolorimetri dalam suatu larutan. Dalam uji Bradford melibatkan pewarna Coomassie Brilliant Blue (CBB) yang berikatan dengan protein dalam suatu larutan yang bersifat asam sehingga memberikan warna (kebiruan). Karena menghasilkan warna, sehingga secara kolorimetri dapat diukur

absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometri (Lambert‐Beer) pada panjang gelombang 465‐595 nm (cahaya tampak).

B.

Alat dan Bahan

Spektrofotometer Coomasie brilian blue (CBB) G‐250 Etanol 95%

Asam fosfor 85%

BSA (bovine serum albumin)

Biakan bakteri

C.

Cara Kerja

PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BRADFORD

1. PembuatanReagen Bradford

Reagen Bradforddibuat dengan cara menimbang 0.01 g coomasie brilian blue (CBB) G‐250 yang kemudian dilarutkan dalam 5 ml etanol 95% (v/v), lalu ditambahkan 10 ml asam fosfor 85% (v/v). Campuran dihomogenkan (dikocok kuat) lalu disaring dengan kertas saring dan disimpan dalam botol gelap dan suhu rendah. Stok pereaksi Bradford harus diencerkan 5 kali sebelum digunakan..

2. Pembuatan Larutan standar protein

Standar proteindibuat dengan menimbang 0,01 g BSA (bovine serum albumin) yang kemudian dilarutkan dengan 10 ml H2O steril sehingga diperoleh larutan stok BSA dengan konsentrasi 1000 ppm. Larutan stok dengan konsentrasi 1000 ppm diencerkan dengan melarutkan 0,5 ml larutan stok ditambahkan 4,5 ml H2O steril sehingga diperoleh larutan stok BSA 100 ppm. Dari larutan stok tersebut dilakukan pengukuran terhadap standar protein terlarut dengan konsentrasi 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 dan 100 ppm. Kemudian dilakukan pengukuran terhadap standar protein dengan menambahkan 0.1 ml seri larutan standar dengan 5 ml reagen Bradford. Kemudian larutan divortex dan di inkubasi pada suhu ruang selama 10‐60 menit. Larutan ini memberikan warna biru dan dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Dengan menggunakan regresi linear, akan didapatkan persamaan matematik untuk larutan standar protein yang diperoleh dari nilai absorbansi standar, yang akan digunakan pada pengukuran kadar protein terlarut.

3. Pengukuran protein terlarut

Bahan yang digunakan adalah biakan bakteri Bacillus subtilis. umur 18 jam dalam larutan kaldu nutrient yang ditambahkan 1% pati tapioca yang kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4°C. diperoleh supernatant yang kemudian disebut dengan ekstrak enzim kasar (EEK).

Pengukuran sampeldilakukan dengan cara menambahkan 0,1 ml ekstrak enzim kasar dengan 5 ml reagen Bradford divortex dan diinkubasi pada suhu ruang selama 10‐60 menit. Absorbansi Larutan

84

sampel protein dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Dengan persamaan matematik dari kurva standar protein, akan didapatkan kadar protein terlarut yang terkandung dalam larutan ekstrak enzim kasar.

Penentuan kadar protein dengan Metode Lowry

Penentuan kadar protein dilakukan dengan menggunakan metode termodifikasi Lowry dkk., menggunakan larutan standar Bovine Serum Albumin.

Disiapkan reagen Lowry A (larutan asam phosphor-tungstic-phospho-molibdic),kemudian ditambahkan foolindan akuades dengan perbandingan 1:1 sedangkan Lowry B dibuat dari campuran antara 100 mL larutan Na2CO3 2 % dalam larutan NaOH 0,1 N dengan 1 mL CuSO4.5H2O 1 % dan 1,0 mL natrium-kalium tartrat 2 %.

Prosedur Pembuatan Kurva Standar

a) Dimasukkan ke dalam deret tabung reaksi : 0 (blanko); 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 mL protein standar BSA.

b) Ditambahkan aquadest sampai volume total masing-masing 2 mL. sehingga diperoleh protein standar BSA dengan konsentrasi 0,10; 0,15; 0,20; 0,25, 0,30 mg/mL.

c) Selanjutnya dipipet masing-masing 1 mL ke dalam deret tabung reaksi lalu ditambahkan masing-masing 8 mL pereaksi Lowry B, dihomogenkan lalu dibiarkan selama 10-15 menit. d) Ditambahkan 1 mL pereaksi Lowry A ke dalam tabung reaksi yang telah berisi Lowry B,

dikocok merata dengan cepat sesudah penambahan.

e) Dibiarkan selama 30 menit sampai warna biru terbentuk. Diukur pada gelombang maksimum lalu dibuat kurva standarnya.

Penentuan Kadar Protein sampel :

a) Dipipet 1 mL larutan enzim tiap fraksi kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi.

b) Diberi perlakuan yang sama dengan larutan standar dan blanko(Ahmad, A., Patta, A. M., and Natsir, H., 2013).

85

ISOLASI BAKTERIOFAGE

Kompetensi: Mahasiswa mampu melakukan isolasi bakteriofaga dari limbah cair A. Dasar Teori

Bakteriofage adalah virus yang menginfeksi bakteri dan dapat menghancurkan secara langsung sel bakteri , atau memadukan DNA-nya ke dalam kromosom bakteri. DNA fage yang terintegrasi ke dalam kromosom sel inang dan tinggal di dalamnya tanpa membahayakan inang dinamakan siklus lisogeni. Disisi lain fage juga dapat melisis sel inang setelah bereproduksi dan keluar dengan sejumlah progeni melalui siklus litik. fage umum ditemukan di lingkungan, terutama pada sampel limbah cair. Limbah merupakan habitat bakteri fekal (coliform) dan diduga di dalam limbah mengandung banyak galur fage bakteri koliform yang beragam. Keberadaan fage pada media agar

dapat dilihat dengan terbentunya plak pada media tersebut. Plak menandakan bakteri yang ada pada area tersebut mengalami lisis.

B. Alat dan Bahan Water bath Limbah cair

Kultur cair E. coli umur 3-5 jam Nutrient Agar semi padat (agar 0.7%) Nutrient Agar

Buffer Salin C. Cara Kerja

 Lakukan pengenceran sampel limbah cair 10-1

dan 10^-2 dengan menggunakan buffer salin.

 Siapkan media agar semi padat (suhu 50 °C) dalam 4 tabung reaksi, beri label masing-masing tabung dengan 1, 2, 3, dan4.

 Inokulasikan 1 ml limbah cair yang tidak diencerkan dam 1 ml kultur E. coli pada tabung 1. Tuang pada media NA dan sebar dengan cara memutar cawan petri membentuk angka 8.

 Inokulasikan 1 ml limbah cair yang telah diencerkan (10-1

dan 10^-2) pada tabung 2 dan 3. Buat control pada tabung 4 dengan buffer salin tanpa limbah cair. Tuang pada media NA dan sebar dengan cara memutar cawan petri membentuk angka 8.  Biarkan media memadat. Inkubasi selama 48 jam.

 Hitung jumlah plak yang terbentuk pada setiap cawan, catat ukuran dan bentuk plak.

86

DAFTAR PUSTAKA

Ali, A., 2004. Penuntun Praktikum Mikrobiologi I. Makassar; Universitas Negeri Makassar.

Bibiana W. Lay, 1994. Analisis Mikrobiologi di Laboratorium. Penerbit Rajawali Pers. PT. Raja Grafindo Persada Jakarta.

Fardiaz S., 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan. Jakarta.

Hafsah, 2008. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Analitik. Makassar; Universitas Islam Negeri Makassar.

Suriawiria, U., 1985. Pengantar Mikrobiologi Umum. Bandung; Angkasa.

Tiwari RP, Hondal GS, Tewari R. 2008. Laboratory techniques in Microbiology and biotechnology. India. Abshike Publication Chandigarh.

______ , 2008. Materi Pelengkap Perkuliahan Mikrobiologi Analitik. Makassar; Universitas Islam Negeri Makassar.

87

LAMPIRAN

1. Syarat Perhitungan SPC

Syaratsyarat perhitungan SPC sebagai berikut :

- Pilih cawan yang ditumbuhi koloni dengan jumlah 30-300 koloni. > 300 = TNTC (Too Numerous To Count) atau TBUD (Terlalu Banyak Untuk Dihitung). < 30 = TFTC (Too Few To Count).

10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan

234 20 5 2,3X10⁴ 28 dan 5 <30

650 127 10 1,3X10⁵ 650 >300

TNTC TNTC 195 2X10⁶ TNTC >300

- Jumlah koloni yang dilaporkan terdiri dari 2 digit yaitu angka satuan dan angka sepersepuluh yang dikalikan dengan kelipatan 10 (eksponensial), missal 2,3 X 10⁴, bukan 2,34 X 10⁴. pembulatan keatas dilakukan pada angka seperseratus yang sama atau lebih besar dari lima, missal 2,35 X 10⁴ menjadi 2,4 X 10⁴, atau 2,34 X 10⁴ menjadi 2,3 X 10⁴.

- Bila diperoleh perhitungan < 30 dari semua pengenceran, maka hanya dari pengenceran terendah yang dilaporkan.

-

10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan

15 1 0 1,5X10³ Semua <30

- Bila diperoleh perhitungan > 300 dari semua pengenceran, maka hanya dari pengenceran tertinggi yang dilaporkan.

10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan

TNTC TNTC 358 3,6X10⁶ Pngc.trtgg(10^-4) TNTC 325 18 3,3X10⁵ Pngc.trtgg(10^-3)

- Bila ada 2 cawan, masing-masing dari pengenceran rendah dan tinggi yang berurutan dengan jumlah koloni 30-300 dan hasil bagi dari jumlah koloni pengenceran tertinggi dan terendah ≤ 2, maka jumlah yang dilaporkan adalah nilai rata-rata. Jika hasil bagi dari pengenceran tertinggi dan terendah > 2 maka jumlah yang dilaporkan adalah dari cawan dengan pengenceran terendah.

10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan

295 40 5 3,5X10⁴ 40.000/29.500<2 140 35 1 1,4X10⁴ 35.000/14.000>2

- Apabila setiap pengenceran digunakan 2 cawan petri (duplo), maka jumlah angka yang digunakan adalah rata-rata dari kedua nilai jumlah masingmasing setelah diperhitungkan.

10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan

175 15 5 (17.500+20.800)/2 15 dan 20 <30

208 20 2 = 1,9X10⁴

88 165 45 8 = 1,5X10⁴ 45.000/10.500>2 Dilap. Pengc. terendah 275 35 5 (27.500/35.000)/2=a 27.500/35.000<2 285 40 7 ^{(28.500+40.000)/2=b} (a+b)/2 = 3,3X10⁴ 28.500/40.000<2 Dilap. Hasil

rata-rata 290 25 5 ^{(29.000+30.000)/2 =} 3X10⁴ 25 dan 28 <30 meskipun 305>300 305 28 0