Abstrak
Informasi keragaman genetik sangat penting untuk menunjang program pemuliaan manggis. RAPD (Random Amplified Polymorphyc DNA) adalah marka molekuler yang dapat membantu dalam proses seleksi dalam program pemuliaan tanaman manggis.Tujuan penelitian untuk mempelajari keragaman genetik akibat iradiasi sinar gamma. DNA 22 regeneran manggis yang sudah diseleksi diamplifikasi menggunakan random primer dalam mesin PCR. Primer yang digunakan adalah SBH 13, SBH 18, SB 13, SB 12, dan SB 19. Pembuatan dendogram dilakukan dengan program NTSys-pc versi 2.1.
Hasil analisis RAPD menunjukkan perubahan pita lima primer acak berkisar 250-2000 pasang basa (pb). Primer SB 19 menghasilkan jumlah pita paling banyak, sedangkan primer SBH 13 menghasilkan jumlah pita paling sedikit. Berdasarkan dendogram analisis RAPD 22 rege neran, nilai kemiripan genetik antara 60% - 91% atau keragaman genetik 9% - 40%. Pada nilai kemiripan genetik 60 % terbagi menjadi dua kelompok, yaitu kelompok E berbeda dengan kelompok lainnya (A, B, C, D), sehingga secara keseluruhan kelompok regeneran dan tanaman kontrol yang dianalisis menghasilkan lima kelompok utama. Sedangkan dendogram analisis morfologi regeneran dan kontrol dikelompokkan menjadi dua kelompok utama, yaitu kelompok utama A dan B dengan kemiripan genetik 59 % atau variasi genetik 41 %. Kata kunci : Manggis, RAPD, keragaman genetik,
Pendahuluan
Deteksi mutan dapat dilakukan dengan membedakan fenotipik tanaman karakter morfologi, analisis kandungan biokimia tanaman (Gallego & Martinez, 1996). Deteksi berdasarkan karakter morfologi tanaman mempunyai kelemahan karena penampakan karakter tersebut diketahui setelah tanaman mencapai fase pertumbuhan tertentu dan membutuhkan waktu yang lama seperti pada tanaman tahunan (Meunir, 1992). Selain itu, karakter morfologi sangat dipengaruhi oleh faktor lingkungan (Gallego & Martinez, 1996), adanya pengaruh pleiotropi dan epistasis (George & Sadasivam, 1997). Pengamatan sitologi jarang sekali digunakan
karena sulit untuk mengamati perbedaan kromosom terutama untuk tanaman-tanaman yang mempunyai jumlah kromosom banyak dan berukuran kromosom kecil.
Marka DNA merupakan alternatif dalam menganalisis keragaman genetik tanaman, karena mampu memberikan polimorfik pita DNA dalam jumlah banyak, konsisten/stabil, dan tidak dipengaruhi oleh faktor lingkungan. Saat ini telah banyak ditemukan marka molekuler yang didasari pada penggunaan enzim restriksi seperti RFLP maupun dengan penggunaan amplifikasi PCR, antara lain RAPD, AFLP dan SSR (Karp et al., 1997). Marka molekuler telah banyak digunakan dalam : (1) penapisan plasma nutfah, (2) estimasi diversitas genetik, (3) identifikasi strain dan proteksi varietas tanaman, (4) introgresi dan piramidisasi gen, (5) pengembangan galur murni dan hibrida (Mohapatra, 1997), (6) deteksi mutasi (Varghese, 1997).
Marka RAPD dihasilkan melalui proses amplifikasi DNA seperti halnya dalam melakukan PCR, perbedaannya terletak pada penggunaan primer oligonukleotida (dengan panjang 10 basa) yang sekuennya dibuat secara random. Teknik RAPD dapat mendeteksi variasi dengan ada atau tidak adanya amplifikasi polimorfik DNA oleh PCR (Dowling et al., 1996). RAPD digunakan untuk mengidentifikasi variasi genetik di dalam atau di antara populasi, dan pemetaan genom (Mayer et al., 1997).
Teknik RAPD mempunyai beberapa keuntungan dibandingkan teknik lain, yaitu membutuhkan sampel DNA yang lebih sedikit (10 – 25 ng), tidak bersifat radioaktif, pelaksanaanya relatif lebih mudah dan menghasilkan estimasi yang lebih tinggi untuk kesamaan interspesifik (Powell et al., 1996). Namun demikian teknik RAPD juga mempunyai beberapa keterbatasan, antara lain tidak dapat membedakan individu homosigot dan heterosigot karena bersifat dominan (Ronning & Schnell, 1995), perubahan kecil dalam kondisi reaksi dapat merubah jumlah dan intensitas produk amplifikasi sehingga reprodusibilitas sulit dipertahankan (Dowling et al., 1996), kesulitan dalam skoring data (Karp et al., 1997).
Iradiasi sinar gamma dapat menyebabkan mutasi dan perubahan fisiologis. Hasil penelitian sebelumnya tela h diperoleh regeneran manggis in vitro berasal dari beberapa dosis iradiasi sinar gamma. Akan tetapi belum diketahui pola pita DNA
Tujuan penelitian untuk mendeteksi regeneran manggis in vitro berdasarkan marka RAPD dan morfolo gi serta mengetahui keragaman genetik regeneran manggis in vitro berdasarkan analisis dendogram.
Bahan dan Metode Tempat dan Waktu Percobaan
Percobaan dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan dan Molekuler Pusat Kajian Buah-buahan Tropika (PKBT) IPB. Waktu percobaan dilaksanakan bulan Oktober 2004 sampai dengan Februari 2005.
Bahan dan Alat
Bahan tanaman untuk analisis RAPD adalah DNA 22 regeneran yang terdiri dari 21 regeneran yang telah diseleksi dan satu kontrol (Tabel 11). Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis RAPD adalah nitrogen cair, PVPP (Polyvinyl polypyrrolidone), merkaptoetanol, CTAB, akuades steril, larutan KIA (kloroform: isoamil: alkohol), alkohol absolut, isopropanol, etanol 70 %, natrium asetat, agarose, air bebas ion, agarose, parafilm, bufer TAE, loading dye, PCR kit, oil mineral , lima primer acak, yaitu SBH 13 (3’-GACGCCACAC-5’), SBH 18 (3’-ACGCGCATGT- 5’), SB 13 (3’-AGTCAGCCAC-5’), SB 12 (3’-GAATCGGCCA-5’), SB 19 (3’- CAGCACCCAC-5’) (Operon Tech Alameda, Calipornia) dan 1 kb DNA ladder (Promega).
Alat-alat yang digunakan tabung mikro, mortal, mikropipet (Gilson), vorteks, shaker, freezer, sentrifuge (Kubota 1-13), waterbath (tipe Memmert), spektrometer (UV 200-RS), mesin PCR (Temp Control PC 707), bak elektroforesis, UV transiluminator.
Ekstraksi DNA
Metode isolasi DNA mengikuti prosedur yang dikembangkan oleh Doyle dan Doyle (1990) yang dimodifikasi dengan penambahan 1 % PVPP (Polyvinyl Poly
Pyrolidon). Isolasi DNA dimulai dari jaringan daun manggis yang berasal dari planlet, yaitu seberat 0.25 g ditambah 10 mg PVPP dan nitrogen cair kemudian digerus sampai halus di dalam mortal. Serbuk daun yang didapatkan kemudian dimasukan ke dalam tabung mikro berisi 700 µl bufer ekstraksi CTAB (3 %; 1.4 M NaCl; 20 Mm EDTA; 100 mM Tris-HCl pH 8.0; dan â- mercaptoethanol). Selanjutnya campuran dikocok dengan menggunakan vorteks dan diinkubasikan dalam waterbath pada suhu 65 oC selama 30 menit. Setelah inkubasi kemudian didinginkan sampai suhu kamar dan ditambahkan 570 µl buffer kloroform : isoamil alkohol (24:1) ke dalam campuran tersebut, dikocok dengan vortek kemudian dipisahkan dengan sentrifus 12.000 rpm selama 15 menit. Cairan bagian atas (supernatan) diambil dengan pipet mikro dan dimasukan ke dalam tabung mikro baru. Selanjutnya supernatan ditambah dengan 600 µl isopropanol dingin kemudian disentrifugasi 12.000 selama 15 menit. Kemudian dibuang bagian atas, pelet DNA ditambah dengan 100 µl etanol 80 %, dan disentrifugasi selama 5 menit. Pelet dikeringkan sampai kering (1 jam di freezer atau semalam dalam suhu kamar), pelet diberi air bebas ion 100 µl dan disimpan dalam freezer.
Pemurnian DNA dilakukan mengikuti prosedur yang dikembangkan Sambrook et al. (1989). Larutan DNA yang diperoleh dimurnikan dengan penambahan 100 µl bufer fenol dan 100 µl KIA (kloroform : isoamil alkohol dengan perbandingan 24 : 1). Campuran disentrifus 12.000 rpm selama 15 menit, supernatan diambil dan dimasukan ke dalam tabung mikro baru dan ditambah dengan 10 µl natrium asetat dan 600 µl isopropanol dingin. Campuran dikocok dan diinkubasi dalam freezer selama 30 menit. Campuran disentrifus 12.000 rpm selama 15 menit, pelet DNA yang diperoleh dicuci dengan 200 µl etanol 70 % kemudian disentrifus (12.000 rpm) selama 5 menit. Tabung mikro dibalikan di atas tisu semalam. Setelah kering pelet DNA dilarutkan dengan 100 µl air bebas ion dan disimpan dalam freezer sebagai stok DNA.
Analisis Kuantitas dan Kualitas DNA
Kuantitas dan kemurnian DNA dari masing- masing hasil ekstraksi ditentukan dengan menggunakan spektrometer dengan membaca absorban pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Pembacaan absorbans λ260 = 1 berarti konsentrasi
DNA yang didapat sebesar 50 ìg/ml. Konsentrasi DNA yang didapat dihitung dengan rumus sebagai berikut :
DNA (ìg/ml) = absorbans λ260 x faktor pengenceran x 50
Kemurnian DNA ditetapkan berdasarkan nilai rasio absorbans λ260/280, batas
kemurniaan yang biasa dipakai dalam analisis molekuler mempunyai nilai rasio absorbans λ260/280 sekitar 1.8 – 2.0 (Sambrook et al., 1989).
Uji kualitas DNA dilakukan dengan mencampur 10 µl larutan DNA ditambah 2 µl loading dye di atas kertas parafilm. Campuran DNA dimasukan dalam sumur gel. Proses pembuatan gel, yaitu menimbang 0,8 gr agar agarose (Promega) ditambah larutan TAE 1X sebanyak 40 ml kemudian dipanaskan dalam microwave selama 5 menit. Elektroforesis dilakukan pada voltase konstan sebesar 60 volt selama 45 jam di dalam bak elektroporesis yang berisi buffer TAE 1X. DNA yang telah dielektroforesis direndam dalam larutan etidium bromida (0,5 mg/l) selama 45 menit, kemudian divisualisasikan di atas Ultraviolet transiluminator dan didokumentasikan. Amplifikasi DNA manggis dengan menggunakan primer acak dapat dilakukan mengikuti metode yang dikembangkan oleh William et al. (1990). Setiap reaksi amplifikasi menggunakan volume 25 ìl campuran larutan yang terdiri dari 14,37 ìl H2O, 2,5 ìl thermophillic DNA poli 10X buffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH
9.0, 0.1 % Triton X-100), 2,5 ìl PCR Nucleotide Mix /dNTP 2 mM, 2,5 ìl MgCl2 25
mM, 0,13 ìl Taq DNA polimerase (Promega), 1 ìl primer, dan 2 ìl DNA (50 ng). Primer-primer yang digunakan adalah SB 12, SBH 13, SBH 18, SB 13 dan SB 19. Campuran larutan tersebut ditambah oil mineral sebanyak 20 ìl (Promega). Tabung- tabung mikro tersebut dimasukan ke dalam blok mesin PCR (Temp Control System PC 707) yang diprogram dengan tahapan sebagai berikut:
b). PCR : denaturasi suhu 94 oC selama 1 menit, annealing (penempelan primer) pada suhu 36 oC selama 1 menit dan extention (perpanjangan) pada 72 oC selama 2 menit dan dilakukan 45 siklus.
c). Perpanjangan akhir pada suhu 72 oC selama 4 menit.
Hasil amplifikasi PCR di analisis dengan menggunakan elektroforesis 1.4 % gel agarose (Promega) dengan voltase konstan 50 Volt selama 45 menit di dalam bak elektroporesis yang berisi buffer TAE 1X. DNA yang telah dielektroforesis direndam dalam larutan etidium bromida 1 % selama 45 menit, kemudian divisualisasikan di atas UV transiluminator dan didokumentasikan.