Uji aktivitas antimikroba dilakukan menggunakan metode difusi sumur agar. Metode difusi sumur agar dilakukan dengan memasukan komponen antimikroba ke dalam lubang sumur pada media agar. Komponen tersebut akan berdifusi ke dalam media agar dan akan menghambat pertumbuhan mikroba yang terdapat pada media agar.
Aktivitas antimikroba ekstrak kayu siwak (Salvadora persica Wall.) pada metode difusi sumur ditunjukkan dengan adanya area bening di sekitar sumur yang berisi ekstrak kayu siwak pekat pada media agar yang telah diinokulasi dengan bakteri uji. Pada uji difusi sumur digunakan tiga variabel yang Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Diameter zona penghambatan dapat dilihat pada Tabel3. berikut ini :
Tabel 3. Diameter zona hambat ekstrak kayu siwak terhadap bakteri uji (mm)
Keterangan : Uji difusi sumur dilakukan sebanyak 2 kali ulangan; diameter sumur 0.4 mm; uji statistik ANOVA dengan p = 0.05
Pada perlakuan ekstrak siwak dengan konsentrasi 100% didapatkan hasil diameter zona penghambatan sebesar 21.20±1.80 mm untuk bakteri uji Staphylococcus aureus. Pada perlakuan yang sama dengan bakteri uji Pseudomonas aeruginosa didapatkan diameter zona penghambatan yang lebih kecil yaitu sebesar 20.11±1.76 mm. Bakteri gram positif dan gram negatif memiliki ketahanan yang berbeda terhadap senyawa antimikroba. Hasil diameter zona penghambatan pada bakteri Staphylococcus aureus lebih besar jika dibandingkan dengan hasil zona penghambatan pada bakteri Pseudomonas aeruginosa. Hasil tersebut menunjukkan bahwa bakteri gram positif lebih mampu dihambat oleh senyawa antibakteri yang terdapat di dalam ekstrak kayu siwak. Pola penghambatan terhadap bakteri gram positif dan bakteri gram negatif dari ekstrak kayu siwak ini mirip dengan pola penghambatan antibiotik penisilin G. Menurut Prescott et al.(2003), penisilin G lebih aktif menghambat pertumbuhan bakteri gram positif daripada gram negatif.
Perlakuan Diameter zona penghambatan (mm)
Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa
Ekstrak siwak 100% 21.20±1.80a 20.11±1.76a Amoxycillin 2% (kontrol positif) 22.24±1.03a 21.34±0.75a Akuades steril (kontrol negatif) 0.00±0.00 0.00±0.00
Gambar 12. Diameter zona penghambatan ekstrak kayu siwak
Bakteri gram positif lebih sensitif terhadap senyawa antimikroba dibandingkan dengan bakteri gram negatif karena struktur dinding sel bakteri gram negatif yang lebih kompleks, yaitu lipopolisakarida, peptidoglikan, dan lipoprotein. Pada lapisan lipopolisakarida tersebut bakteri gram negatif memiliki sistem seleksi (screening) terhadap zat-zat asing (Branen dan Davidson, 1993). Bakteri gram negatif umumnya lebih sensitif terhadap senyawa antimikroba yang bersifat polar karena dinding sel bakteri gram negatif bersifat polar sehingga lebih mudah dilewati oleh senyawa antimikroba yang bersifat polar.
Sebaliknya, bakteri gram positif lebih sensitif terhadap senyawa antimikroba yang bersifat non-polar. Sensitivitas bakteri gram positif terhadap senyawa antimikroba yang bersifat non-polar disebabkan karena komponen terbesar penyusun dinding sel bakteri gram positif adalah peptidoglikan yang salah satu penyusunnya adalah asam amino alanin yang bersifat non-polar. Hal inilah yang menyebabkan dinding sel bakteri gram positif menjadi lebih mudah dilewati dan diserang oleh senyawa antimikroba yang bersifat non-polar.
Menurut El-Mosterhy et al. (1998) siwak mengandung zat-zat kimia, seperti golongan alkaloid yang diduga sebagai salvadorin, klorida, sejumlah besar fluorida dan silika, sulfur, vitamin C, serta sejumlah kecil tannin,saponin, flavanoida dan sterol. Darout (2000) melaporkan bahwa kandungan kimiawi ekstrak kayu siwak sangat ampuh menghilangkan plak dan mengurangi virulensi bakteri periodontopatogenik. Kandungan anionik alami dalam siwak dipercaya sebagai antimikrobial yang efektif untuk menghambat dan membunuh mikroorganisme. Sementara itu, Pratama (2005) menyebutkan bahwa mekanisme penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri
Staphylococcus aureus diduga disebabkan adanya zat antibakteri pada kayu siwak seperti trimetilamin dan fluorida. Trimetilamin dapat merusak tegangan permukaan lapisan membran sel sehingga sel dapat kehilangan permeabilitasnya. Apabila sifat permeabilitas pada membran sel hilang maka aliran keluar masuknya bahan-bahan dan zat tertentu akan terganggu sehingga dapat mengganggu metabolisme dan menyebabkan kematian pada bakteri tersebut. Sementara itu, fluorida dapat mendenaturasi protein dan membuat enzim tidak bekerja pada membran sel sehingga metabolisme bakteri terganggu.
Kontrol positif menggunakan obat antibiotik komersial yaitu amoxycillin dengan konsentrasi 2% (b/v) dengan hasil zona penghambatan bakteri sebesar 22.24±1.03 mm pada bakteri Staphylococcus aureus dan 21.34±0.75 mm pada bakteri Pseudomonas aeruginosa.
Antibiotik merupakan produk metabolit yang dihasilkan oleh organisme tertentu yang dalam jumlah sangat kecil bersifat merusak atau menghambat mikroorganisme lainnya. Amoxycillin merupakan bubuk berwarna putih atau agak keputihan, sedikit memiliki aroma sulfur, sinergis dengan sitrat, fosfat, dan larutan buffer. Amoxycillin mudah larut di dalam air, sedikit larut pada etanol anhidrat, sangat sedikit larut pada etanol 96% (British Pharmacopoeia, 2009).Amoxycillin sebagai kontrol positif dalam penelitian ini merupakan turunan semisintetik dari penisilin.Penisilin mampu menghambat bakteri pada masa pertumbuhannya melalui mekanisme penghambatan sintesis peptidoglikan. Penisilin juga menghambat kerja enzim yang menjadi katalis dari reaksi transpeptidasi karena strukturnya yang sangat serupa. Peptidoglikan yang tidak tersintesis secara sempurna selanjutnya akan menyebabkan tekanan osmotik pada sel yang tidak normal kemudian lisis (Prescott et al.,2003). Kontrol positif amoxycillin 2% (b/v) menghambat pertumbuhan bakteri uji dengan penghambatan terhadap bakteri Staphylococcus aureus lebih besar daripada
Pseudomonas aeruginosa. Hal tersebut sesuai dengan Prescott et al.(2003) yang menyatakan bahwa penisilin G lebih mampu menghambat pertumbuhan bakteri gram positif dibandingkan pertumbuhan bakteri gram negatif.
Kontrol negatif yang menggunakan air destilasi steril tidak menunjukkan adanya aktivitas penghambatan bakteri uji. Hal itu ditunjukkan dengan tidak adanya area zona bening di sekitar sumur agar, baik untuk bakteri gram positif maupun bakteri gram negatif karena air destilasi steril tidak memiliki aktivitas antimikroba.
Berdasarkan uji statistik dengan ANOVA, perlakuan ekstrak siwak memiliki hasil yang tidak berbeda nyata (p > 0.05) dengan perlakuan kontrol positif amoxycillin 2%(b/v) (Lampiran 3). Hal tersebut menunjukkan bahwa ekstrak siwak yang diuji memiliki kemampuan daya hambat terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa yang sama dengan antibiotik komersial yaitu amoxycillin. Menurut Kaur (2011), amoxycillin merupakan antibiotik dengan spektrum luas yaitu antibiotik yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Penelitian yang dilakukan oleh Al-Bayati (2007) juga menyebutkan bahwa ekstrak siwak dengan pelarut air memiliki kemampuan antimikroba dengan spektrum yang luas karena mampu menghambat beberapa bakteri gram positif dan bakteri gram negatif seperti
S.aureus, S. mutans, S. faecalis, P. aeruginosa, dan L. acidophilus. Dari hasil uji difusi sumur tersebut dapat digunakan sebagai acuan untuk melakukan uji berikutnya yaitu penentuan nilai konsentrasi hambat minimal ekstrak kayu siwak karena aktivitas penghambatan yang dihasilkan pada uji difusi sumur bersifat kualitatif.