BAB VI PEMBAHASAN
6.4 Ekspresi MMP-9 pada KTP Klasik dan KTPVF dengan Infiltras
Penelitian ini menggunakan 40 sampel yang dibagi menjadi 4 kelompok yaitu 10 sampel dari kelompok KTP Klasik infiltrasi intrakompartemen, 10 sampel kelompok KTP Klasik ekstrakompartemen, 10 sampel kelompok KTPVF intrakompartemen dan 10 sampel kelompok KTPVF ekstrakompartemen. Setelah dilakukan pemeriksaan immunohistokimia dengan MMP-9 dan uji statistik didapatkan bahwa terdapat perbedaan rerata skor ekspresi MMP-9 yang sangat bermakna antara kelompok KTP intrakompartemen dengan ekstrakompartemen (p<0,001). Dari data diketahui bahwa terjadi peningkatan rerata skor ekspresi dari KTP Klasik intrakompartemen ke KTP Klasik ekstrakompartemen, dari KTP Klasik intrakompartemen ke KTPVF ekstrakompartemen, dari KTPVF intrakompartemen ke KTP Klasik ekstrakompartemen, dan dari KTPVF intrakompartemen ke KTPVF ekstrakompartemen, meskipun antar varian (antara KTP Klasik dengan KTPVF) tidak menunjukkan perbedaan secara bermakna. Rerata skor ekspresi MMP-9 pada KTP infiltrasi ekstrakompartemen yang lebih besar secara sangat bermakna dibandingkan KTP intrakompartemen pada penelitian ini membuktikan bahwa proses invasi yang lebih dalam dan metastasis akan menarik aktivitas MMP-9 secara lebih banyak. Namun hasil ini tidak sejalan dengan beberapa penelitian sebelumnya yang menyimpulkan bahwa ekspresi MMP-9 pada kanker tiroid tidak dapat menggambarkan agresivitas KTP (Korem et al., 2004; Buergy et al., 2009; Delektorskaia et al., 2010). Pada penelitian tersebut dikatakan bahwa ekspresi MMP-9 juga tinggi pada karsinoma tiroid yang
belum menunjukkan gambaran metastasis KGB maupun metastasis jauh, hal ini disebabkan karena sebelum terjadinya penetrasi sel ganas melewati membran basalis limfovaskuler, sel ganas harus berpenetrasi diantara sel stroma sehingga aktivitas MMP-9 menjadi cukup kuat pada area stroma sehingga memberikan skor ekspresi yang relatif tinggi dalam pulasan imunohistokimia MMP-9. Beberapa penelitian tersebut juga lebih membuktikan peranan MMP-9 dalam diagnostik, dimana terdapat perbedaan ekspresi MMP-9 yang sangat bermakna antara kelompok karsinoma tiroid dan adenoma tiroid. Sedangkan penilaian peranan MMP-9 dalam menentukan kemampuan invasi dan metastasis tumor hanya dilakukan dengan melihat hubungan antar variabel tanpa menyeimbangkan perbandingan besar sampel karsinoma tiroid yang dengan dan tanpa metastasis. Meskipun beberapa penelitian menunjukkan hasil yang bertentangan, beberapa penelitian lanjutan lainnya sejalan dengan penelitian ini dan menemukan bahwa ekspresi MMP-9 berhubungan secara bermakna dengan perluasan ekstratiroid, adanya metastasis ke limfonodi dan metastasis jauh serta derajat infiltrasi tumor (Marecko et al., 2008; Frasca et al., 2008; Wang et al., 2009; Liang et al., 2010; Ansari et al., 2013). Persamaan hasil yang didapat pada penelitian ini berkaitan dengan fakta bahwa MMP-9 terlibat dalam berbagai tahap proses invasi yang lebih jauh maupun metastasis tumor seperti yang terangkum dalam bagan pada gambar 6.1.
Keterangan:
= Faktor yang mempengaruhi ekspresi MMP-9 = Faktor yang tidak mempengaruhi ekspresi MMP-9
Gambar 6.1
Bagan jalur patogenesis keterlibatan MMP-9 dalam proses infiltrasi tumor pada penelitian
MMP-9 mendapat perhatian dalam berbagai studi karena protein ini diperlukan dalam memunculkan sifat invasif maupun metastasik melalui peran utamanya dalam mendegradasi kolagen IV yang merupakan komponen utama
Lingkungan sekit ar sel
t umor
St rom a Sel radang (neut rofil m akrofag)
Sit okin dan kem okin sekit ar
membran basalis. Selain berperan dalam degradasi komponen ECM, MMP-9 juga mampu memicu transisi epitelial menjadi progenitor mesenkimal (EMT) sehingga memiliki kemampuan motilitas tinggi. Selama terbentuknya proses metastasis, sel-sel epitelial ganas akan terlepas dari tumor primer dan mengalami transisi mesenkimal, menginvasi jaringan stroma, memasuki sirkulasi, diam sementara pada area perifer vaskuler, ekstravasasi, menginvasi interstisium dan parenkim organ target, dan membentuk koloni metastatik (Stuelten et al., 2005; Deryugina et al., 2006; Marecko et al., 2008; Loffek et al., 2011; Ansari et al., 2013).
MMP-9 selanjutnya berperan pula dalam proses angiogenesis, invasi menuju jalur angiolimfatik (intravasasi), ekstravasasi dan pertahanan koloni metastatik dari respon imun. Untuk proses angiogenesis, MMP-9 dapat berperan sebagai molekul proangogenik yang dapat memicu aktivasi angiogenik dengan cara mengatur proliferasi perisit, apoptosis dan penarikan perisit serta memobilisasi perekrutan prekursor angiogenik sumsum tulang ke stroma tumor dan beberapa mitogen angiogenik seperti FGF dan VEGF (Nowak et al., 2008; Yang et al., 2011; Ansari et al., 2013). Sedangkan peran dalam proses intravasasi, melibatkan neutrofil yang direkrut MMP-9, dimana neutrofil ini terlebih dahulu akan ditarik menuju permukaan sel endotel kemudian menjadi teraktivasi sehingga kembali mampu menghasilkan MMP-9 yang terbebas dari pengaruh TIMP. Aktivasi MMP-9 yang dihasilkan neutrofil ini selanjutnya kembali melepaskan faktor angiogenik yang tersimpan dalam matriks ekstraseluler dan sekaligus membantu intravasasi dan penyebaran sel tumor. Aktivitas beberapa kemokin seperti CCR7 yang sebelumnya ditargetkan untuk meningkatkan ekspresi MMP-9 juga berimbas
pada fasilitasi penyebaran sel tumor melalui jalur limfonodi (Stuelten et al., 2005; Marecko et al., 2008; Nowak et al., 2008; Ansari et al., 2013). Studi in vivo menunjukkan bahwa MMP-9 terlibat dalam proses intravasasi dengan cara mempengaruhi fenotip tumor sehingga memiliki potensi metastatik dengan membentuk sel tumor yang memiliki aktivitas protrusi terorientasi dan terpolarisasi menuju vaskuler sekitar tumor (Deryugina et al., 2006). Gambar 6.2 A merupakan gambaran adanya ekspresi MMP-9 yang kuat di sekitar vaskuler tumor, kemungkinan berkaitan dengan adanya proses intravasasi yang dipengaruhi oleh aktivitas MMP-9.
Diketahui pula bahwa beberapa sel radang seperti neutrofil dapat menghasilkan MMP-9 bahkan MMP-9 yang terbebas dari aktivitas TIMP, dan sebaliknya MMP-9 juga kembali dapat menarik aktivitas sel radang. Peran neutrofil terkait tumor masih belum jelas, tetapi diduga neutrofil memiliki kemampuan pro- sekaligus anti tumor tergantung fenotifnya dan jumlah infiltrat neutrofil di lingkungan tumor. Ditemukan bahwa infiltrat masif neutrofil dapat menimbulkan efek sitotoksik terhadap tumor sehingga tumor akhirnya mengalami regresi sedangkan infiltrat ringan neutrofil justru menunjukkan sifat progresif tumor (Leifler et al., 2014). Pada penelitian ini, ditemukan fokus infiltrat ringan neutrofil pada beberapa kasus KTP ekstrakompartemen seperti pada sampel 13 (Gambar 6.1 B).
Gambar 6.2
Pola Distribusi Ekspresi MMP-9 dan Sel Radang Penyerta di sekitarnya (A Pola distribusi ekspresi MMP-9 tampak dengan intensitas yang lebih kuat di
area perivaskuler {inset}. B. Di sekitar sel dan stroma yang terpulas MMP-9 tampak fokus sel radang PMN neutrofil)
Proses metastasis selanjutnya yang diperankan MMP-9 yaitu dalam ekstravasasi sel-sel ganas ke jaringan target yang juga diperantarai sel-sel inflamasi yang ditarik oleh MMP-9. Kerja VEGF sirkulasi pada reseptornya dalam pembentukan kelompok sel endotel dalam jaringan target metastatik juga mampu menghasilkan lebih banyak MMP-9 yang nantinya berperan mendegradasi membran basalis vaskuler. Berikutnya pada jaringan target, sel-sel ganas akan membentuk koloni metastatik dan kembali lagi MMP-9 ikut mengambil peranan terutama dalam dalam mempengaruhi pertahanan tumor maupun koloni metastatik terhadap respon imun, MMP-9 dapat menekan penarikan berbagai jenis sel-sel radang (Stuelten et al., 2005; Marecko et al., 2008; Nowak et al., 2008; Loffek et al, 2011; Ansari et al., 2013). Penelitian yang dilakukan pada kasus karsinoma serviks menunjukkan kemampuan MMP-9 dalam mendegradasi reseptor α IL-2
sehingga menekan aktivasi dan proliferasi Tumor Infiltrating Lymphocyte (TIL). MMP-9 juga mendegradasi Surfactant protein D (SP-D), komponen penting dalam respon innate immune. Hilangnya fungsi innate immune ini juga menyebabkan pasien onkologi rentan terhadap berbagai infeksi (Ansari et al., 2013). Beberapa penelitian menyebutkan bahwa peningkatan aktivitas MMP-9 pada kasus karsinoma dengan metastasis juga mempengaruhi tingginya MMP-9 serum yang dapat diamati melalui tes zymografi (Quaranta et al., 2007; Daniele et al., 2010). Namun pada penelitian ini tidak dilakukan penelusuran lebih jauh terhadap aktivitas MMP-9 serum.
Rerata skor ekspresi MMP-9 pada KTP ekstrakompartemen yang lebih besar secara sangat bermakna dibandingkan KTP intrakompartemen pada penelitian ini menunjukkan bahwa terjadinya proses invasi yang lebih jauh melewati kapsel organ dan metastasis merupakan proses yang lebih kompleks dan tentunya agak berbeda dengan proses invasif yang terbatas dalam organ itu sendiri. Sehingga diasumsikan bahwa luasnya invasi mempengaruhi agresivitas KTP karena sebanding dengan peningkatan skor ekspresi MMP-9 yang merupakan marka agresivitas tumor. Penelitian ini merupakan penelitian pertama yang menelusuri perbandingan ekspresi MMP-9 antara KTP ekstrakompartemen dengan KTP intrakompartemen.
Adanya skor ekspresi MMP-9 yang lebih rendah dibandingkan skor maksimal kasus-kasus KTP ekstrakompartemen seperti pada sampel 36 yaitu dengan skor 4 dapat berkaitan dengan berbagai faktor yang terlibat dalam proses ekspresi MMP- 9, diantaranya keseimbangan antara jumlah enzim dan penghambatnya (TIMP-1),
lokalisasi periseluler dan perubahan bentuk laten MMP-9 menjadi bentuk aktifnya. Sebuah studi telah membuktikan bahwa bentuk aktif MMP-9 tidak dapat menggambarkan keseluruhan aktivitas MMP-9, pada studi tersebut didapatkan bahwa ekspresi MMP-9 aktif tidak berkorelasi dengan beberapa faktor klinikopatologik seperti luasnya invasi dan metastasis, yang berkorelasi secara signifikan adalah ekspresi MMP-9 total (Daniele et al., 2010; Marecko et al., 2014). Sedangkan rasio aktivitas MMP-9/TIMP-1 dan proses lokalisasi periselulernya hingga saat ini sulit untuk diamati dan belum ada penelitian yang melaporkan. Penelitian ini hanya mengamati aktivitas MMP-9 aktif, sehingga skor rendah pada kasus KTP ekstrakompartemen ini belum tentu menunjukkan nilai total MMP-9 yang rendah. Mengingat dominan kasus KTP ekstrakompartemen menunjukkan skor ekspresi yang tinggi maka pada kasus seperti ini mungkin perlu penilaian ekspresi MMP-9 laten sehingga nantinya didapatkan nilai ekpresi MMP-9 total.
Salah satu kasus KTPVF ekstrakompartemen dengan skor ekspresi yang lebih rendah dibandingkan kelompok KTPVF ekstrakompartemen lainnya menunjukkan diferensiasi solid yang cukup luas dengan sedikit sisa komponen folikuler. Tidak diketahui apakah peningkatan diferensiasi solid berpengaruh terhadap sekresi MMP-9 sel tumor karena beberapa studi justru melaporkan bahwa sepertiga kasus KTP dengan diferensiasi solid akan menunjukkan perluasan ekstratiroid dan invasi vasa, namun belum ada penelitian yang menelusuri apakah proses ini tidak secara dominan dilatarbelakangi oleh peran MMP-9 sehingga pada kasus ini didapatkan skor imunohistokimia yang relatif
lebih rendah. Faktor lain yang mempengaruhi yaitu komponen stroma kasus ini lebih sedikit akibat adanya diferensiasi solid yang cukup luas, sedangkan beberapa studi melaporkan bahwa MMP-9 dominan dihasilkan oleh sel stroma fibroblas. Distribusi MMP-9 pada stroma juga menjadi kriteria penilaian ekspresi MMP-9 pada penelitian ini dimana ekspresinya diinduksi oleh berbagai mediator klasik seperti TNF-α, TGF-β, EGF atau HGF (Stuelten et al., 2005; Loffek et al., 2011; Ansari et al., 2013). Pada penelitian ini, beberapa kasus KTP menunjukkan distribusi ekspresi kuat MMP-9 diantara area stroma (Gambar 6.3 A).
Gambar 6.3
Pola Ekspresi MMP-9 pada Stroma sekitar Tumor dan pada Makrofag A. Ekspresi MMP-9 yang kuat pada area stroma. B Ekspresi MMP-9 pada sel
makrofag yang bergranul (tanda panah)
Beberapa kasus KTP Klasik maupun KTPVF Intrakompartemen dan Ekstrakompartemen pada penelitian ini menunjukkan ekspresi MMP-9 pada sitoplasma sel makrofag sehingga mendukung beberapa penelitian sebelumnya yang membuktikan keterlibatan Tumor Associated Macrophage (TAM) dalam menghasilkan MMP-9, namun efeknya terhadap progresivitas tumor tergantung pada fenotifnya yang ditentukan oleh sitokin yang dihasilkannya. Makrofag
dipolarisasikan dalam dua fenotif yaitu M1 dan M2. Makrofag M1 mensekresikan arginase-1 dan IL-10 dalam jumlah sedikit serta IL-1b, IL-6, TNF-a, dan IL-12 dalam jumlah banyak, sedangkan makrofag M2 arginase-1, IL-10, dan IL-1Ra dalam jumlah yang lebih banyak serta IL-12, IL-1b, IL-6, and TNF-a dalam jumlah sedikit. Sitokin makrofag M1 cenderung memicu progresifitas tumor. Hal ini dibuktikan melalui efek IL-1b yang dapat meningkatkan kemampuan angiogenesis dan metastasis. Sedangkan sitokin makrofag M2 seperti IL-1Ra bersifat antagonis terhadap IL-1b sehingga cenderung berperan dalam regresi tumor. Penelitian ini tidak menelusuri lebih jauh fenotif makrofag yang terdapat pada beberapa sampel kasus karena diperlukan teknik microdyalisate dalam menilai aktivitas sitokin yang dihasilkan makrofag. Seperti halnya yang terjadi pada neutrofil, MMP-9 yang dihasilkan oleh makrofag dapat sebaliknya kembali mengaktivasi makrofag dengan bekerja pada reseptor PAR-1 dan PAR-2 (Ansari et al., 2013; Leifler et al., 2014).
Berbagai penelitian telah berhasil membuktikan peran MMP-9 sebagai marka agresivitas tumor melalui keterlibatannya dalam proses invasi maupun metastasis. Agresivitas antara KTP Klasik dan KTPVF masih kontroversial, beberapa laporan morfologi dan studi longitudinal menyebutkan bahwa area berdiferensiasi buruk, lesi bilateral/multipel, invasi intravasa, invasi perineural maupun infiltrasi ekstrakompartemen meliputi invasi kapsel, perluasan ekstratiroid dan metastasis jauh lebih banyak dijumpai pada KTPVF dibandingkan dengan KTP klasik tetapi risiko metastasis ke limfonodi lebih rendah dibandingkan KTP klasik (Chang et al., 2006; Chrisoulidou et al., 2011; Chen et al., 2012; Gupta et al., 2012).
Penelitian lainya justru melaporkan bahwa KTPVF memiliki perangai klinis maupun patologis yang sebanding dengan KTP klasik (Gonzalez et al., 2011; Der Lin et al., 2010; Salajegheh et al., 2008; De Lellis et al., 2004). Penilaian agresivitas kedua tipe KTP melalui ekspresi MMP-9 pada penelitian ini membuktikan bahwa tidak terdapat perbedaan rerata skor ekspresi MMP-9 yang bermakna antara KTP Klasik dengan KTPVF, dimana perbedaan antara KTP Klasik Intrakompartemen dengan KTPVF Intrakompartemen memiliki nilai (p=0,496; p>0,005) dan antara KTP Klasik Ekstrakompartemen dengan KTPVF Ekstrakompartemen memiliki nilai (p= 0,309; p>0,005).
Secara molekuler, jalur karsinogenesis KTP Klasik memang berbeda dengan KTPVF. KTP Klasik melibatkan tata ulang RET atau NTRK dan point mutasi BRAFV600E sedangkan KTPVF selain melibatkan tata ulang RET atau NTRK dan
mutasi BRAFK601E, 13% melibatkan translokasi t(2;3)(q13p;p25) yang
menggabungkan PAX8-PPARɤ dan 21% mutasi RAS (Kondo et al., 2006; Santoro et al., 2006; Salajegheh et al., 2008; Viglieto et al., 2012; Chien et al., 2012). Tidak pernah terdapat laporan bahwa MMP-9 dapat mempengaruhi proses karsinogenesis pada kedua tipe KTP ini sehingga secara teoritis MMP-9 memang tidak terlibat dalam penentuan karakteristik molekuler maupun morfologi pada KTP Klasik maupun KTPVF. Keterlibatan MMP-9 pada inti sel yang diawali oleh degradasi matriks protein inti yaitu PARP hanya mempengaruhi peningkatan fragmentasi DNA dan pencegahan proses perbaikan DNA (Ansari et al., 2013). Proses ini terjadi setelah terjadinya proses karsinogenesis, sehingga pulasan
MMP-9 di inti yang ditemukan pada beberapa kasus penelitian ini tidak menggambarkan bahwa MMP-9 terlibat dalam proses karsinogenesis KTP. Berdasarkan berbagai literatur mengenai MMP-9, aktivitas transkripsi dan translasi MMP-9 yang dipicu oleh berbagai faktor pertumbuhan, sitokin dan promotor tumor dapat melalui berbagai jalur (gambar 6.3), diantaranya jalur inhibitor-kappa binding (I
microRNA yang mampu memodifikasi protein penting dalam progresi karsinoma tiroid.
Gambar 6.4
Bagan Jalur Transkripsi MMP-9 yang dilibatkan oleh beberapa Jalur Karsinogenesis KTP