3 METODOLOGI
3.5 Ekstraksi dan Evaporasi Komponen Antioksidan
Ekstraksi komponen antioksidan dilakukan dengan menghasilkan ekstrak kasar terlebih dahulu. Komponen antioksidan diperoleh melalui ekstraksi bertingkat dengan menggunakan tiga jenis pelarut. Pelarut yang digunakan yaitu pelarut non polar (kloroform), pelarut semi polar (etil asetat), pelarut polar (metanol). Sampel lili laut yang disimpan dalam larutan etanol di hancurkan sampai halus sebanyak 25 gram dan dimaserasi dengan menggunakan pelarut kloroform sebanyak 100 ml selama 48 jam. Hasil maserasi yang berupa larutan disaring dengan menggunakan kertas saring whatman sehingga dihasilkan residu dan filtrat. Residu yang dihasilkan dimaserasi selama 48 jam menggunakan 100 ml pelarut etil asetat, kemudian disaring kembali dengan menggunakan kertas
saring whatman yang menghasilkan residu dan filtrat. Residu dari ekstrak etil asetat dimaserasi kembali dengan pelarut metanol sebanyak 100 ml selama 48 jam. Hasil larutan maserasi tersebut disaring kembali dengan menggunakan kertas saring whatman sehingga dihasilkan residu dan filtrat. Proses ekstraksi dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4 Diagram alir proses ekstraksi lili laut (Sumber: Quinn 1988 diacu dalam Darusman et al. 1995) Pencacahan
Sampel
Maserasi dengan kloroform selama 48 jam
Penyaringan
Residu
Maserasi dengan etil asetat selama 48 jam
Penyaringan
Evaporasi
Ekstrak kloroform
Maserasi dengan metanol selama 48 jam Residu Penyaringan Residu Filtrat Filtrat Evaporasi
Ekstrak etil asetat
Filtrat Evaporasi
Ekstrak metanol Sampel 25 gram
Filtrat dari kloroform, etil asetat, metanol dievaporasi untuk memisahkan pelarut dengan ekstraknya. Proses evaporasi menggunakan vacuum evaporator sehingga dihasilkan ekstrak kasar. Ekstrak kasar ini kemudian dimasukkan ke dalam botol ekstrak yang akan digunakan untuk dilakukan uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH (Bois 1958 diacu dalam Hanani et al. 2005) dan uji fitokimia secara kualitatif (Harborne 1987).
3.5.1 Uji aktivitas antioksidan (DPPH) (Bois 1958 diacu dalam Hanani et al. 2005)
Ekstrak kasar lili laut yang diperoleh dari ektraksi bertingkat dengan kloroform, etil asetat, metanol, etanol dilarutkan dengan pelarut metanol p.a dengan konsentrasi 200, 400, 600, 800 ppm. Antioksidan sintetik BHT digunakan sebagai pembanding dengan konsentrasi 2, 4, 6, 8 ppm. Larutan DPPH yang digunakan, dibuat dengan melarutkan kristal DPPH dalam pelarut metanol dengan konsentrasi 1 mM. Proses pembuatan larutan DPPH 1 mM dilakukan dalam kondisi suhu rendah dan terlindung dari cahaya matahari. Sebanyak 4,5 ml larutan uji dan pembanding direaksikan dengan 500 µl larutan DPPH 1 mM dalam tabung reaksi. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37 °C selama 30 menit, kemudian diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometri UV-VIS Hitachi U-2800 pada panjang gelombang 517 nm. Aktivitas antioksidan dari masing-masing sampel dan pembanding BHT dinyatakan dengan persen inhibisi, yang dihitung dengan rumus sebagai berikut:
inhibisi absorbansi blanko absorbansi sampel
absorbansi blanko x 00
Nilai konsentrasi sampel (ekstrak maupun pembanding BHT) dan persen inhibisinya diplot masing-masing pada sumbu x dan y pada persamaan regresi
linear. Persamaan regresi linear yang diperoleh dalam bentuk persamaan y = a + bx, digunakan untuk mencari nilai IC50 (inhibitor concentration 50%) dari
masing-masing sampel dengan menyatakan nilai y sebesar 50 dan nilai x yang akan diperoleh sebagai IC50. Nilai IC50 menyatakan besarnya konsentrasi larutan sampel (ekstrak maupun antioksidan pembanding BHT) yang dibutuhkan untuk mereduksi radikal bebas DPPH sebesar 50%.
3.5.2 Uji fitokimia (Harborne 1987)
Uji fitokimia dilakukan untuk menentukan komponen bioaktif yang terdapat pada ekstrak kasar lili laut masing-masing pelarut. Uji fitokimia yang dilakukan terdiri dari uji alkaloid, steroid/triterpenoid, flavonoid, saponin, fenol hidrokuinon, Molisch, Benedict, Biuret dan Ninhidrin. Metode uji ini berdasarkan Harborne (1987).
a) Uji alkaloid
Sejumlah sampel dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2 N kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid yaitu, pereaksi Dragendorff, pereaksi Meyer, dan pereaksi Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi Meyer terbentuk endapan putih kekuningan, endapan coklat dengan pereaksi Wagner dan endapan merah hingga jingga dengan pereaksi Dragendorff.
Pereaksi Meyer dibuat dengan cara menambahkan 1,36 gram HgCl2
dengan 0,50 gram KI lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 100 ml dengan labu takar. Pereaksi ini tidak berwarna. Pereaksi Wagner dibuat dengan cara 10 ml akuades dipipet kemudian ditambahkan 2,50 gram iodin dan 2 gram KI lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 200 ml dalam labu takar. Pereaksi ini berwarna coklat. Pereaksi Dragendorff dibuat dengan cara 0,80 gram bismut subnitrat ditambahkan dengan 10 ml asam asetat dan 40 ml air. Larutan ini dicampur dengan larutan yang dibuat dari 8 gram kalium iodida dalam
20 ml air. Sebelum digunakan, 1 volume campuran ini diencerkan dengan 2,30 volume campuran 20 ml asam asetat glasial dan 100 ml air. Pereaksi ini
berwarna jingga.
b) Uji steroid/triterpenoid
Sejumlah sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi. Anhrida asetat ditambahkan sebanyak 10 tetes kemudian ditambahkan asam sulfat pekat 3 tetes ke dalam campuran tersebut. Hasil uji positif mengandung steroid dan triterpenoid yaitu dengan terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau.
c) Uji flavonoid
Sejumlah sampel ditambah serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol (campuran asam klorida 37% dan etanol 95% dengan volume yang sama)
dan 4 ml alkohol kemudian campuran dikocok. Hasil uji positif sampel mengandung flavonoid ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol.
d) Uji saponin
Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan adanya saponin.
e) Uji fenol hidrokuinan (pereaksi FeCl3)
Sejumlah sampel diekstrak dengan 20 ml etanol 70%. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl3 5%. Hasil uji positif sampel mengandung fenol hidrokuinan ditunjukkan dengan terbentuknya warna hijau atau hijau biru.
f) Uji molisch
Sebanyak 1 ml larutan sampel diberi 2 tetes pereaksi Molisch dan 1 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Uji positif yang menunjukkan adanya karbohidrat ditandai terbentuknya kompleks berwarna ungu diantara 2 lapisan cairan.
g) Uji benedict
Larutan sampel sebanyak 8 tetes dimasukkan ke dalam 5 ml pereaksi Benedict. Campuran dikocok dan dididihkan selama 5 menit. Hasil uji positif sampel mengandung gula pereduksi ditunjukkan dengan terbentuknya larutan berwarna hijau, kuning atau endapan merah bata.
h) Uji biuret
Sebanyak 1 ml larutan sampel ditambahkan 4 ml pereaksi Biuret. Campuran dikocok dengan seksama. Hasil uji positif sampel mengandung senyawa peptida dengan terbentuknya larutan berwarna ungu.
i) Uji ninhidrin
Sebanyak 2 ml larutan sampel ditambah beberapa tetes larutan ninhidrin 0,1%. Campuran dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit. Hasil uji positif sampel mengandung asam amino ditunjukkan dengan warna biru.