A. Tujuan
Setelah praktikum mahasiswa diharapkan :
1. Memahami cara mengekstraksi menggunakan ekstraktor soxhletasi 2. Dapat menghitung rendemen hasil isolasi.
3. Mampu melakukan proses isolasi senyawa piperin dari Piper Nigri / Albi fructus 4. Mampu melakukan proses isolasi senyawa kafein dari daun teh / biji kopi.
5. Mampu melakukan identifikasi senyawa hasil isolasi secara Kromatografi Lapis Tipis.
B. Dasar Teori
Alkaloid, sekitar 5500 tahun telah diketahui, merupakan golongan zat tumbuhan sekunder terbesar. Tidak ada satu pun istilah alkaloid yang memuaskan, Tetapi pada umumnya alkaloid mencakup senyawa bersifat basa yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen, Biasanya dalam gabungan, sebagai bagian dari sitem siklik.
Alkaloid sering kali beracun bagi manusia dan banyak yang mempunyai kegiatan fisiologi yang menonjol, jadi digunakan secara luas dalam bidang pengobatan. Prazat alkaloid yang paling umum adalah asam amino. Meskipun sebenarnya, Biosintesis kebanyakan alkaloid lebih rumit.
Alkaloid sebagai golongan dibedakan dari sebagian besar komponen tumbuhan lain berdasarkan sifat basanya (kation). Oleh karena itu senyawa ini biasanya terdapat dalam tumbuhan sebagai garam dengan berbagai asam organik dan sering ditangani di laboratorium sebagai garam dengan asam hidroklorida dan asam sulfat. Bila alkaloid berada dalam bentuk garamnya, maka alkaloid dibebaskan dengan mereaksikannya dengan penambahan basa (NH4OH, Ca(OH)2,dsb) terlebih dahulu untuk mengekstraksinya. Alkaloid bebas biasanya dapat diekstraksi dengan pelarut kloroform dan dipisahkan dari campuran senyawa yang kompleks dengan menggunakan berbagai metode kromotografi.
C. Alat dan Bahan 1. Bahan
• Serbuk smplisia piper nigri / albi fructus
• Serbuk simplisia daun teh / biji kopi
• Ethanol 96 %
• KOH – ethanol 10 %
• Anilsadehid
• Asam sulfat 10 %
• Magnesium Oksida ( MgO)
29
• Seperangkat extractor soxhlet (volume ± 250 ml )
• Kompor listrik dan panic almunium
• Batang pengaduk
• Cawan penguap 50 mL
• Kertas saring
• Botol flakon
• Rotary evaporator vakum
• Gelas piala 100 ml
Isolasi Senyawa Piperina dari Piper Nigri/Albi Fructus
1. Timbang lebih kurang 40 gram serbuk simplisia, masukkan ke dalam alat ekstraktor soxchlet yang bagian dalamnya dilapisi kertas saring.
2. Tambahkan 400 ml ethanol 96 % melalui mulut soxhlet, yang sebelumnya sudah terpasang tegak lurus, sehingga terjadi pengaliran ke dalam labu pemanas (dengan 2 kali sirkulasi), Bila perlu dapat ditambahkan ethanol lagi secukupnya.
3. Lakukan soxhletasi selama 2.5 jam (minimal 4-5 kali sirkulasi) kemudian ekstrak hasil soxhletasi (dalam labu) dinginkan dengan air mengalir dan saring ekstraknya dengan kertas saring (terpasang dengan corong).
4. Ambil ekstrak jernih yang diperoleh sebanyak 3 ml (masukkan kedalam botol flakon kecil untuk pembanding), sisanya diuapkan dengan rotary evaporator vakum sampai konsistensi kental (± 20 ml), Hasilnya dipindahkan ke dalam gelas piala kecil (volume 100 ml), kemudian ditambahkan 10 ml KOH 10 % dalam
30 ethanol (1 gr dalam 10 ml ethanol 96%) sambil diaduk – aduk sehingga timbul endapan yang menggumpal.
5. Setelah mengendap, Pisahkan larutan ekstrak dari bagian yang tidak larut melalui penyaringan “glass wool“ sambil ditekan – tekan, Sehingga larutannya sampai habis tersaring.
6. Larutan ekstrak jernih yang diperoleh, Tempatkan dalam gelas kecil dan tutup dengan kertas almunium foil yang dilubangi beberapa buah lubang. Didiamkan dalam lemari pendingin / es selama semalam.
7. Kristal isolat yang timbul dipisahkan dengan disaring dengan kertas saring dan dikeringkan diatas kaca arloji dalam oven pada suhu 40oC sehingga kering, Jika Kristal belum murni atau kristalnya masih kotor (pemurniaan Kristal dapat di lakukann dengan metode rekristalisasi).
Isolasi Senyawa Kofeina dari Daun Teh/Kopi
1. Timbang lebih kurang 50 gram serbuk simplisia, masukkan ke dalam alat ekstraktor soxhlet yang bagian dalamnya dilapisi kertas saring
2. Tambahkan 400 ml ethanol 96 % melalui mulut soxhlet, yang sebelumnya sudah terpasang tegak lurus, sehingga terjadi pengaliran kedalam labu pemanas (cukup dengan 2 kali sirkulasi), bila perlu dapat ditambahkan ethanol 96 % lagi secukupnya.
3. Lakukan soxhletasi selama 2.5 jam, kemudian hasil soxhletasi dinginkan sebentar dan saring dengan kertas saring (terpasang dengan corong).
4. Uapkan larutan ekstrak dengan vakum rotavapor sampai konsistensi kental (± 20 – 30 ml ), hasilnya pindahkan kedalam gelas piala volume 500 ml
5. Tambahkan 25 gram Mg O sambil di aduk dengan batang pengaduk, Tambahkan 200 ml aquadest panas sambil diaduk, didihkan selama 10 menit dan disaring dalam keadaan panas – panas dengan corong Buchner dan bilas penyaring Buchner dengan 50 ml aquadesr panas.
6. Filtrat yang diperoleh kumpulkan dan ditempatkan dalam gelas piala, tambahkan 25 ml asam sulfat 5 % sambil diaduk, larutan filtrat dipanaskan lagi diatas penangas air selama 10 menit, larutan disaring panas kembali, filtrat yang diperoleh didinginkan.
7. Larutan filtrat tersebut netralkan dengan Ammonia pekat (NH4OH) yang ditambahkan tetes demi tetes sampai pH netral ( pH = 6-7)
8. Larutan yang sudah dinetralkan pindahkan kedalam corong pisah (volume 500 ml), lalu diekstraksi sebanyak 5 kali dengan 25 ml kloroform, hasil ekstrak kloroform dikumpulkan dan diuapkan dengan vakum rotavapor sampai menjadi kira – kira ± 10 ml dan tambahkan 15 ml ethanol 96 %, dipindahkan ke gelas piala kecil, tutup dengan kertas almunium foil yang dilubangi beberapa buah lubang, didiamkan dalam lemari pendingin / es ( bukan di dalam frezzer ) selama semalam ( 24 jam ).
9. Kristal kofeina yang timbul dipisahkan dengan disaring dengan kertas saring dan dikeringkan diatas kaca arloji dalam oven pada suhu 400C.
31 E. Tugas
Isolasi Senyawa Piperina dari Piper Nigri/Albi Fructus 1. Tentukan / hitung rendemen hasil isolasi yang diperoleh.
2. Lakukan identifikasi secara Kromatografi Lapis Tipis : a. Lempeng Kromatografi Lapis Tipis
Plat KLT dengan lapisan (fase diam) silica gel GF254
b. Pengembang (fase gerak )
Penjenuhan bejana : n-heksan – etil asetat ( 60 : 40 ) c. Deteksi
Dengan pereaksi anilsadehide – asam sulfat, setelah disemprot dengan pereaksi ( 2-3 kali penyemprotan ) panaskan 5 menit pada suhu 1100C, di periksa dibawah sinar UV.
d. Larutan Cuplikan
1) Larutan ekstrak : totolkan dengan pipa kapiler 10 µl (pada titik A) 2) Larutan isolat : 15 mg isolat dilarutkan dalam 1.0 ml methanol
dan totolkan 1 µL pada titik B
3) Larutan pembanding : Piperina sebanyak 10 mg dilarutkan dalam 1.0 ml methanol dan di totolkan 1 µl pada titik C.
3. Pembuataan spectrum UV, Tentukan puncak serapan maksimum
4. Pembuataan spectrum infra merah, Tentukan gugus fungsi yang penting.
Isolasi Senyawa Kofeina dari Daun Teh/Kopi
1. Tentukan / hitung rendemen hasil isolasi yang diperoleh.
2. Lakukan identifikasi secara KLT (Kromatografi Lapis Tipis) a) Metode standar
Sebelum di eluasi, lapisan fase diam lempeng KLT dimantapkan dengan uap amoniak yang lembab, untuk keperluan ini digunakan gelas piala kecil berisi 20 ml larutan ammonia 10 % ditempatkan didalam bejana kering berisi plat KLT, kedalam bejana ditambahkan larutan pengembang (pengeluasi)
b) Lapisan (fase diam) Silika gel GF254
c) Pengembang (fase gerak)
Penjenuhan bejana : kloroform – ethanol (99:1) d) Deteksi
Disemprotkan dengan larutan iodin – alkohol lalu dengan asam hidroklorida – alkohol.
e) Larutan Cuplikan
Kristal isolat kofeina 1 mg, dilarutkan kedalam 2 ml pelarut campuran kloroform – methanol dengan perbandingan 9 : 4 (1.4 ml : 0.6 ml) , untuk menotolkan bercak digunakan 5 µl.
3. Pembuatan spectrum UV dan spectrum Infra red (IR)
32 Catatan :
1. Untuk spectrum UV : Gunakan pelarut ethanol atau kloroform 2. Untuk spectrum IR : menggunakan cakram KBr.
33 BAB IX
EKSTRAKSI DAN IDENTIFIKASI FLAVANOID DARI SIMPLISIA