d Analisis Statistik
A. Ekstraksi Teh Hitam
Ekstraksi merupakan suatu proses penyarian zat-zat aktif pada tanaman yang bertujuan untuk menarik komponen kimia yang ada dengan menggunakan pelarut tertentu. Proses ekstraksi teh dilakukan dengan cara penyeduhan. Penyarian zat-zat aktif dari dalam matriks teh hitam akan berlangsung melalui proses difusi. Menurut Astill et al. (2001), perbedaan cara penyeduhan teh dapat memengaruhi komposisi senyawa kimia yang terdapat pada produk akhir minuman teh. Hasil penelitiannya menunjukkan bahwa total padatan terlarut seperti komponen polifenol dan kafein akan semakin meningkat seiring meningkatnya konsentrasi teh, padatan terlarut terekstrak dengan cepat pada menit pertama penyeduhan tetapi menurun secara bertahap dengan meningkatnya waktu penyeduhan, dan suhu penyeduhan yang direkomendasikan untuk menyeduh teh hitam adalah 100oC, lebih tinggi daripada teh hijau (75-90oC). Komposisi senyawa kimia minuman teh akan berpengaruh langsung terhadap kualitas minuman teh dan manfaat kesehatan yang dihasilkan. Hal ini didukung pula oleh Madsuda di dalam Ho et al. (2009) yang menyatakan bahwa perbedaan cara penyeduhan teh akan memengaruhi flavor dan cita rasa yang terbentuk.
Suhu penyeduhan dan waktu penyeduhan merupakan dua faktor yang sangat menentukan komposisi senyawa kimia yang terekstrak dari teh hitam. Oleh karena itu, kedua faktor tersebut dijadikan perlakuan dalam penelitian ini. Perlakuan penyeduhan yang dilakukan ialah penyeduhan teh hitam pada suhu awal 70oC, 85oC, dan 100oC dengan waktu penyeduhan masing-masing 5, 10, dan 15 menit. Konsentrasi teh yang digunakan adalah 0,02 g/ml (2 gram teh ditambah 100 ml air) pada semua perlakuan penyeduhan. Konsentrasi 0,02 g/ml dipilih sesuai dengan saran penyajian teh dengan tujuan mendapatkan cita rasa dan manfaat dari teh (Pettigrew 2009; Laresolo 2007). Walaupun demikian, konsentrasi tersebut tidaklah bersifat mutlak karena setiap orang memiliki selera yang berbeda terhadap cita rasa dan tujuan yang berbeda pula ketika mengkonsumsi teh. Disisi lain, Gondoin et al. (2010) menyatakan bahwa diperlukan konsentrasi yang lebih tinggi dari 0,01 g/ml untuk mendapatkan daya penghambatan teh hitam terhadap enzim lipase pankreas.
Variasi suhu penyeduhan didasarkan atas kebiasaan masyarakat dalam menyeduh teh sehari- hari. Pada umumnya, masyarakat menggunakan air mendidih untuk menyeduh teh dimana suhu air mendidih adalah sekitar 100oC. Suhu penyeduhan 70oC diperoleh dari kebiasaan masyarakat kota yang sering menggunakan air panas yang berasal dari dispenser untuk menyeduh teh dimana suhu air tersebut adalah sekitar 70oC. Suhu penyeduhan 85oC dipilih sebagai suhu antara suhu 70oC dan 100oC. Sementara itu, waktu penyeduhan divariasikan untuk mendapatkan komposisi komponen bioaktif terekstrak yang mungkin memiliki kemampuan yang berbeda dalam menghambat enzim lipase. Menurut Astill et al. (2001), senyawa-senyawa kimia seperti polifenol, kafein, tanin, dan theaflavin meningkat jumlahnya dengan cepat hingga batas tertentu dan menurun secara bertahap seiring meningkatnya suhu dan waktu penyeduhan teh hitam.
Ekstrak teh hitam yang dihasilkan dibedakan atas perlakuan yang diberikan, yaitu kombinasi suhu dan waktu penyeduhan. Berdasarkan hal tersebut, terdapat sembilan ekstrak yang berbeda. Disebabkan oleh suhu penyeduhan yang menurun seiring lamanya waktu penyeduhan maka dilakukan pengecekan suhu akhir. Pengecekan suhu akhir juga dimaksudkan untuk mengetahui kisaran temperatur selama penyeduhan. Data-data tersebut dapat dilihat pada Tabel 7. Kesembilan ekstrak ini disebut ekstrak awal yang kemudian sebagian akan dianalisis daya inhibisi enzim lipase, total fenol, dan kadar tanin terkondensasi dan sebagian lainnya akan diberi perlakuan simulasi pH pencernaan.
18
Salah satu tujuan dari penelitian ini adalah mengetahui pengaruh kondisi pencernaan secara in vitro terhadap kemampuan ekstrak teh hitam dalam penghambatan pencernaan lipid. Oleh karena itu, ekstrak teh hitam awal diberikan perlakuan simulasi proses pencernaan dengan cara mengubah nilai pH sesuai dengan kondisi saluran pencernaan. Makanan pertama-tama akan dicerna di mulut kemudian masuk ke lambung melalui kerongkongan. Kondisi di dalam lambung sangat asam, yaitu sekitar pH 1-2. Seberapa lama makanan berada di dalam tergantung dari jenis makanan dan jumlah yang dimakan. Aryani (2011) menyatakan bahwa diperlukan waktu sekitar 30 menit untuk makanan cair atau minuman mengalir dari lambung ke usus kecil. Miller (1998) juga menambahkan bahwa waktu yang diperlukan lambung untuk mencerna minuman adalah sekitar 30 menit. Setelah keluar dari lambung, makanan setengah cair yang memiliki pH sekitar netral akan bercampur dengan enzim-enzim pencernaan yang diproduksi oleh pankreas (Siregar 2004), seperti enzim lipase yang merupakan enzim pencernaan lipid. Berdasarkan hal tersebut, maka ekstrak teh hitam yang merupakan cairan atau minuman tersebut diubah pH nya sesuai dengan pH lambung dan didiamkan selama 30 menit, setelah itu diubah lagi pH larutannya menjadi sekitar pH 6.8 sesuai dengan kondisi usus halus.Ekstrak awal yang telah melalui simulasi pH pencernaan disebut ekstrak simulasi pH pencernaan. Berdasarkan data pH awal pada Tabel 7, ekstrak awal teh hitam memiliki pH sekitar 5, mendekati netral. Oleh karena itu, diperkirakan ekstrak teh hitam akan bercampur dengan enzim-enzim pencernaan termasuk lipase di dalam usus.
Tabel 7. Suhu akhir penyeduhan dan pH ekstrak awal Perlakuan Rata-rata pH awal Rata-rata Suhu akhir (Co) Suhu (oC) Waktu (menit) 70 5 5,02 ± 0,06 59,50 70 10 5,10 ± 0,08 52,50 70 15 5,20 ± 0,04 49,50 85 5 5,07 ± 0,00 65,00 85 10 5,15 ± 0,01 58,50 85 15 5,14 ± 0,00 51,00 100 5 5,14 ± 0,00 70,00 100 10 5,19 ± 0,01 59,50 100 15 4,90 ± 0,01 56,00
B.Nilai pH Ekstrak Awal Teh Hitam
Teh hitam yang diekstrak dengan suhu dan waktu yang berbeda kemudian diukur derajat keasamannya menggunakan pH meter disebut sebagai pH ekstrak awal. Data hasil pengukuran pH ekstrak awal teh hitam dapat dilihat pada Tabel 7. Analisis statistik menunjukkan bahwa faktor suhu penyeduhan tidak berpengaruh terhadap nilai pH awal ekstrak teh (p>0.05), sedangkan waktu penyeduhan dan interaksi suhu dan waktu memiliki pengaruh (p<0.05) terhadap nilai pH ekstrak awal teh hitam (Lampiran 1 dan Lampiran 2).
Menurut Astill et al. (2001), perbedaan cara penyeduhan teh dapat memengaruhi komposisi senyawa kimia yang terdapat pada produk akhir minuman teh sehingga diduga juga akan berpengaruh terhadap nilai pH awal ekstrak teh hitam. Nilai pH awal ekstrak teh hitam akan mempengaruhi pH lingkungan sehingga akan berpengaruh pula terhadap kemampuan suatu komponen bioaktif dalam
19
mengikat protein. Nilai pH lingkungan yang mendekati titik isoelektrik protein (enzim) akan memberikan peluang yang lebih besar bagi senyawa tanin untuk berikatan dengan protein tersebut (Kawamoto et al. 1997).C.
Inhibisi Enzim Lipase
1.
Inhibisi Enzim Lipase Awal
Inhibisi enzim lipase pada ekstrak awal dilakukan untuk melihat kemampuan ekstrak teh hitam pada kondisi awal dalam menghambat aktivitas enzim lipase. Ekstrak teh awal merupakan ekstrak teh yang belum melalui proses pencernaan in vitro. Nilai inhibisi ekstrak awal digunakan sebagai pembanding bagi ekstrak simulasi pH pencernaan, sehingga dapat diketahui apakah proses pencernaan memiliki pengaruh terhadap kemampuan teh hitam dalam menghambat enzim lipase. Hasil penelitian menunjukkan ekstrak teh hitam yang diberi berbagai perlakuan suhu dan waktu penyeduhan memiliki daya inhibisi yang berbeda-beda terhadap enzim lipase, yaitu berkisar antara 14.77-63.21%. Masing-masing ekstrak teh beserta daya inhibisinya: ekstrak 70oC 5 menit (62.44%), 70oC 10 menit (54.99%), 70oC 15 menit (22.87%), 85oC 5 menit (33.33%), 85oC 10 menit (48.73%), 85oC 15 menit (54.85%), 100oC 5 menit (14.77%), 100oC 10 menit (44.91%), dan 100oC 15 menit (63.21%) (Gambar 11).
Gondoin et al. (2010), dengan metode yang sama dengan Mc Dougall et al. (2009), meneliti bahwa 2 gram teh hitam yang diseduh menggunakan 200 ml air mendidih selama 15 menit memiliki daya inhibisi terhadap enzim lipase pankreas. Namun, nilai inhibisi teh hitam lebih kecil dari teh putih dan teh hijau yang diseduh dengan konsentrasi dan cara yang sama. Kusano et al. (2008) menambahakan bahwa teh hitam memiliki daya inhibisi terhadap enzim lipase sekitar 40%- 80%, tergantung dari pelarut yang digunakan. Teh hitam diekstrak menggunakan air dingin lalu dengan aseton, kemudian ekstrak aseton difraksionasi menjadi eter aseton (EtOAc), n-BuOH, fase air, dan endapan kental. Daya inhibisi lipase yang dihasilkan oleh tiap ekstrak berbeda-beda yaitu ekstrak EtOAc (47.7%), n-BuOH (46.8%), fase air (28.3%), dan endapan kental (61.1%). Metode pengujian yang digunakan dalam penelitian ini mengikuti metode yang dilakukan oleh Han et al. (2005) dengan glyceryl trioleat digunakan sebagai substrat.
Hasil analisis statistik ekstrak awal teh hitam menunjukkan bahwa faktor suhu, waktu, dan interaksi keduanya memiliki pengaruh yang signifikan (p< 0.05) terhadap daya inhibisi enzim lipase (Lampiran 4). Selanjutnya, analisis statistik dilanjutkan dengan melibatkan Orlistat menggunakan uji faktorial dimana hasilnya adalah ekstrak awal teh hitam pada semua perlakuan memiliki daya inhibisi yang berbeda secara signifikan (p<0.05) dan lebih rendah jika dibandingkan Orlistat (Lampiran 7). Hasil uji lanjut Duncan menunjukkan bahwa ekstrak teh penyeduhan 70oC 5 menit dan 100oC 15 menit memiliki daya inhibisi enzim lipase yang tidak berbeda nyata (p>0.05) dan merupakan ekstrak dengan daya inhibisi tertinggi jika dibandingkan ekstrak lainnya (Lampiran 7). Berdasarkan hasil tersebut, diduga bahwa senyawa atau komponen bioaktif yang berperan dalam menghambat aktivitas enzim lipase berbeda pada kedua ekstrak tersebut. Astill et al. (2001) menyebutkan bahwa perbedaan suhu dan waktu saat menyeduh teh dapat memengaruhi komposisi senyawa kimia yang terekstrak pada produk akhir minuman teh.
Daya penghambatan enzim lipase pada ekstrak teh penyeduhan 70oC 5 menit diduga dihasilkan oleh suatu komponen bioaktif yang terekstrak pada suhu 70oC tetapi tidak tahan panas karena daya inhibisi ekstrak teh hitam cenderung menurun dengan meningkatnya suhu awal penyeduhan dari 70oC menjadi 85oC (Gambar 11). Salah satu senyawa yang terdapat pada ekstrak teh hitam dan diduga sebagai senyawa tersebut adalah senyawa polifenol golongan flavanol yang
20
didominasi oleh epikatekin (1.21%), epikatekin galat (3.86%), dan epigalokatekin galat (4.63%) (Graham di dalam Liss 1984). Ketiga senyawa tersebut memiliki kemampuan menghambat aktivitas enzim lipase (Tucci et al.2010; Kusano et al.2008; Nakai et al.2005) dan juga tidak tahan panas (Hukmah 2007). Cheong et al.(2005) menambahkan bahwa waktu penyeduhan teh yang semakin lama akan menyebabkan dekomposisi senyawa epikatekin, epikatekin galat, dan epigalokatekin galat.Disisi lain, daya penghambatan enzim lipase pada ekstrak teh penyeduhan 100oC 15 menit diduga dihasilkan oleh suatu komponen bioaktif yang terekstrak mulai dari suhu sekitar 85oC hingga 100oC dan tahan terhadap panas karena daya inhibisi ekstrak 85oC dan 100oC cenderung meningkat seiring bertambahnya suhu dan waktu penyeduhan. Salah satu senyawa yang terdapat pada ekstrak teh hitam dan diduga sebagai senyawa tersebut adalah tanin. Senyawa tanin baik tanin terkondensasi maupun tanin terhidrolisis memiliki kemampuan menghambat aktivitas enzim lipase (Gondoin et al.2010; Kusano et al. 2008; Nakai et al. 2005) dan juga tahan terhadap panas (Clydesdale dan Francis 1976). Pettigrew (2009) menyatakan bahwa kadar tanin akan meningkat seiring semakin lamanya waktu penyeduhan teh.
Kusano et al.(2008) menemukan bahwa senyawa polimer hasil oksidasi atau polymer-like oxidation product (POPs) dan galloyl oolongtheanin pada teh hitam juga berperan dalam menghambat aktivitas enzim lipase pankreas. Senyawa polimer hasil oksidasi yang dimaksud adalah theaflavin, theasisnensis, dan thearubigin. Penelitian secara in vivo yaitu pemberian ekstrak teh hitam kepada tikus menunjukkan terjadinya penurunan berat badan tikus, dengan theaflavin-
3.3‘-digalat sebagai inhibitor lipase paling efektif (Kobayashi et al. 2009). Lin dan Shiau (2009) juga menambahkan bahwa teh yang difermentasi lebih efektif dibandingkan teh tanpa fermentasi dalam menurunkan berat badan dan lipogenesis pada tikus. Pada penelitian tersebut, tikus Sprague- Dawley diberi pakan dengan tambahan 4% daun teh (teh hijau, teh hitam, teh oolong) selama 30 hari. Hasil penelitiannya menunjukkan bahwa berat badan kelompok tikus yang diberi pakan dengan tambahan daun teh hijau 6%, teh oolong 11%, dan teh hitam 7% lebih rendah dari kelompok tikus tanpa perlakuan. Namun, secara in vitro teh hijau yang diseduh pada beberapa suhu dan waktu berbeda memiliki daya inhibisi enzim lipase sebesar 44.29-91.48% (Nindyasari 2012) lebih tinggi daripada teh hitam (6.83-54.23%). Hal tersebut disebabkan oleh lebih besarnya kandungan senyawa polifenol pada teh dalam bentuk daun teh daripada minuman teh (Bhagwat et al. 2003).
21
Keterangan: Nilai yang diikuti oleh huruf yang berbeda menunjukkan inhibisi yang berbeda nyata (p<0.05) dengan uji lanjut Duncan
Gambar 11. Nilai inhibisi enzim lipase dari ekstrak teh hitam
2.
Inhibisi Enzim Lipase Setelah Melewati Simulasi pH Pencernaan
Kesembilan ekstrak teh setelah melalui simulasi pH sistem pencernaan mengalami penurunan kemampuan inhibisi enzim lipase, daya inhibisinya menjadi sekitar 6.83-54.23% (Gambar 11). Masing-masing ekstrak teh setelah melalui simulasi pH sistem pencernaan memiliki daya inhibisi yang berbeda, yaitu ekstrak 70oC 5 menit (47.92%), 70oC 10 menit (46.38%), 70oC 15 menit (17.46%), 85oC 5 menit (10.42%), 85oC 10 menit (28.66%), 85oC 15 menit (24.24%), 100oC 5 menit (6.83%), 100oC 10 menit (21.17%), dan 100oC 15 menit (54.23%) (Gambar 11). Hal yang sama terjadi pula pada Orlistat sebagai kontrol positif yaitu menurun menjadi sebesar 62.00% (Gambar 11). Kondisi ini dapat menggambarkan daya inhibisi teh hitam terhadap enzim lipase pankreas yang bekerja di usus halus.
Hasil analisis statistik menunjukkan bahwa setelah mengalami simulasi pH pencernaan secara in vitro, daya inhibisi ekstrak teh hitam pada semua perlakuan memiliki daya inhibisi yang berbeda secara signifikan (p<0.05) dan lebih rendah jika dibandingkan Orlistat (Lampiran 7). Hasil uji lanjut Duncan menunjukkan bahwa ekstrak teh penyeduhan 70oC 5 menit, 70oC 10 menit dan 100oC 15 menit memiliki daya inhibisi enzim lipase yang tidak berbeda nyata (p>0.05) dan merupakan ekstrak dengan daya inhibisi tertinggi jika dibandingkan ekstrak lainnya (Lampiran 7). Hasil tersebut mengindikasikan bahwa adanya kemungkinan pengaruh simulasi pH pencernaan terhadap kemampuan ekstrak teh hitam dalam menghambat aktivitas enzim lipase.
Uji T-Test dua berpasangan dilakukan untuk mengetahui apakah ada perbedaaan yang signifikan antara daya inhibisi ekstrak awal teh dengan daya inhibisi ekstrak teh setelah melalui simulasi pH pencernaan in vitro. Uji T-Test dua berpasangan dilakukan antara ekstrak awal dengan ekstrak setelah simulasi pH pencernaan pada setiap perlakuan penyeduhan. Hasil uji T-Test dua berpasangan dapat dilihat pada Lampiran 19 sampai Lampiran 27. Ekstrak teh awal yang mengalami penurunan daya inhibisi secara signifikan (p<0.05) setelah melewati simulasi pH
F E B C DE E A D F G e e bc ab d cd a cd e f 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 70 C 5 menit 70 C 10 menit 70 C 15 menit 85 C 5 menit 85 C 10 menit 85 C 15 menit 100 C 5 menit 100 C 10 menit 100 C 15 menit Orlistat In h ib isi Li p ase (% ) Perlakuan Penyeduhan
22
pencernaan adalah teh yang diseduh pada perlakuan 70oC 5 menit, 70oC 10 menit, 85oC 5 menit, 85oC 10 menit, 85oC 15 menit, 100oC 5 menit, dan 100oC 10 menit (Tabel 8). Hasil tersebut menunjukkan bahwa senyawa atau komponen bioaktif yang memiliki kemampuan menghambat enzim lipase peka terhadap perubahan pH. Disisi lain, ekstrak teh awal yang diseduh pada kondisi 70oC 15 menit dan 100oC 15 menit juga mengalami penurunan daya inhibisi setelah melewati simulasi pH pencernaan akan tetapi penurunannya tidak signifikan (p>0.05) (Tabel 8). Hal ini mungkin disebabkan oleh perubahan pH kurang memberi pengaruh terhadap kemampuan komponen bioaktif dalam menghambat enzim lipase.Tabel 8. Penurunan daya inhibisi lipase ekstrak teh hitam dan Orlistat setelah melalui simulasi pH pencernaan
Perlakuan Penyeduhan
Daya Inhibisi (%) Penurunan (%) Awal Simulasi 70o C 5 menit 62,44 47,92 14,52* 70o C 10 menit 54,99 46,38 8,61* 70o C 15 menit 22,87 17,46 5,40 85o C 5 menit 33,33 10,42 22,91* 85o C 10 menit 48,73 28,66 20,07* 85o C 15 menit 54,85 24,24 30,60* 100o C 5 menit 14,77 6,83 7,94* 100o C 10 menit 44,91 21,17 23,74* 100o C 15 menit 63,21 54,23 8,98 Orlistat
71,64
62,00
9,64*
Keterangan: * penurunan signifikan (p<0.05)
Namun, pada umumnya daya inhibisi enzim lipase pada semua ekstrak mengalami penurunan setelah melalui simulasi pH pencernaan. Hal tersebut menunjukkan bahwa kemampuan komponen bioaktif dalam menghambat enzim lipase menjadi menurun akibat terjadinya perubahan pH yang mungkin menyebabkan degradasi atau perubahan struktur molekul. Beberapa senyawa yang sebelumnya telah diduga sebagai komponen antilipase seperti senyawa polifenol dan theaflavin ternyata memiliki kepekaan terhadap perubahan pH. Setiap senyawa polifenol memiliki kestabilan yang berbeda-beda terhadap perubahan pH sehingga akan sangat memengaruhi kemampuannya dalam menghambat aktivitas enzim. Lee et al. (2005) menambahkan bahwa theaflavin stabil pada kondisi pH dibawah 6.5, namun terdegradasi secara perlahan pada pH 7.0-7.5 dan pada pH 9 terdegradasi dengan cepat.
Ekstrak teh yang memiliki daya inhibisi enzim lipase tertinggi setelah melewati simulasi pH pencernaan secara in vitro adalah ekstrak teh yang diseduh pada kondisi 70oC 5 menit, 70oC 10 menit, dan 100oC 15 menit.Tucci et al. (2010) menerangkan bahwa penghambatan enzim lipase berdampak pada penurunan daya cerna lipid yang diharapkan dapat menurunkan penyerapan lipid dan asupan energi sehingga dapat menurunkan resiko kegemukan atau obesitas. Selain itu, Anggraeni (2011) meneliti bahwa teh hitam juga memiliki aktivitas penghambatan enzim alfa amilase dan alfa glukosidase yang merupakan enzim pencernaan karbohidrat. Oleh karena itu, teh hitam akan sangat efektif dalam mencegah berlebihnya asupan energi yang merupakan salah satu penyebab timbulnya obesitas.
23
D.
Total Fenol
Analisis total fenol dilakukan pada ekstrak teh awal maupun ekstrak teh setelah simulasi pH pencernaan dengan tujuan untuk mengetahui hubungan antara keberadaan senyawa fenolik dengan daya inhibisi enzim lipase pada teh hitam. Komponen fenolik di dalam pangan khususnya tumbuhan merupakan komponen hasil metabolisme sekunder dari phenylalanine atau tyrosine (Shahidi dan Ho 2005). Komponen tersebut dikategorikan sebagai senyawa yang paling sedikit memiliki satu cincin aromatik dengan satu atau lebih gugus hidroksil (Crozier 2003). Senyawa yang termasuk ke dalam komponen fenolik sangat beragam, mulai dari senyawa yang sederhana, berbobot molekul rendah, bercincin aromatik tunggal hingga senyawa yang kompleks seperti tanin. Senyawa yang mengandung banyak gugus fenolik disebut sebagai polifenol. Oleh karena itu, hasil analisis total fenol akan mewakili secara kasar jumlah komponen polifenol pada ekstrak.
Daun teh mengandung polifenol sebanyak 20-30% berat kering (Duthie dan Crozier 2003). Sudah banyak penelitian yang melaporkan bahwa senyawa polifenol memiliki andil dalam menghambat aktivitas enzim. Pembentukan kompleks protein-fenol disebabkan salah satunya oleh adanya ikatan hydrogen antara gugus hidroksil fenolik dengan gugus NH- dan CO- pada protein dan juga terjadinya ikatan kovalen dan hidrofobik pada reaksi tersebut (Haslam et al. 1999 diacu dalam Ali 2002). Kompleks protein-fenol ada yang bersifat dapat balik atau tidak dapat balik. Polifenol teroksidasi berinteraksi lebih kuat dengan protein (Siebert 1999 diacu dalam Ali 2002) dan dapat berinteraksi dengan asam amino yang dapat menghambat aktivitas enzim (Milic et al. 1968 diacu dalam Ali 2002).
Langkah awal dalam analisis total fenol ialah membuat kurva standar asam galat dengan cara memplotkan beberapa absorbansi dengan konsentrasi asam galat yang sudah ditentukan (Lampiran 8). Setelah didapatkan kurva standar maka akan diperoleh pula persamaan garis regresi linernya, yaitu y = 0.005x + 0.0031 dengan R2 = 0.9996. Kurva standar asam galat dapat dilihat pada Lampiran 8. Selanjutnya, nilai absorbansi dari analisis total fenol baik ekstrak teh awal maupun ekstrak teh simulasi pH pencernaan akan diplotkan ke dalam persamaan tersebut sehingga didapatkan konsentrasi total fenol dari masing-masing ekstrak. Hasil analisis total fenol dinyatakan sebagai Asam Galat Ekuivalen (GAE).
1.
Total Fenol Awal
Analisis total fenol pada ekstrak awal dilakukan untuk mengetahui kandungan senyawa fenolik di dalam teh hitam yang diekstrak dengan kombinasi suhu dan waktu penyeduhan yang berbeda. Hasil penelitian menunjukkan ekstrak teh hitam yang diberi berbagai perlakuan suhu dan waktu penyeduhan mengandung komponen polifenol dengan jumlah yang berbeda-beda (35.50- 43.51 mg GAE/g berat kering). Masing-masing ekstrak teh beserta total fenolnya (dalam mg GAE/g berat kering): ekstrak 70oC 5 menit (39.12), 70oC 10 menit (39.00), 70oC 15 menit (36.02), 85oC 5 menit (40.00), 85oC 10 menit (35.50), 85oC 15 menit (37.43), 100oC 5 menit (43.51), 100oC 10 menit (41.67), dan 100oC 15 menit (42.22) (Gambar 12). Hal ini menunjukkan bahwa terdapat 39.12 mg komponen fenolik dalam 1 gram teh hitam (contohnya pada teh penyeduhan 70oC 5 menit), dan seterusnya. Moraes de Souza et al. (2008) meneliti bahwa kandungan komponen fenolik pada teh hitam sebesar 35-40 mg GAE/g sedangkan Lambert et al. (2005) melaporkan bahwa teh hitam mengandung komponen fenolik sebesar 30-40% berat kering. Perbedaan kandungan fenol dipengaruhi oleh varietas, unsur hara dalam tanah, musim, serta proses pengolahan pasca panen.
Hasil analisis statistik menerangkan bahwa faktor suhu, faktor waktu, dan interaksi keduanya memiliki pengaruh yang signifikan (p< 0.05) terhadap jumlah total fenol yang terkandung dalam ekstrak teh (Lampiran 10). Hal ini didukung oleh hasil penelitian Astill et al.
24
(2001), dimana perbedaan cara penyeduhan teh dapat memengaruhi komposisi senyawa kimia yang terdapat pada produk akhir minuman teh, termasuk komponen fenolik.Faktor-faktor yang memengaruhi ekstraksi komponen polifenol dari teh, diantaranya jenis pelarut, pH, suhu, jumlah tahap ekstraksi, ukuran dan bentuk partikel teh. Escribano dan Santos (2002) menyatakan bahwa suhu tinggi pelarut dapat meningkatkan efisiensi dari proses ekstraksi karena panas dapat meningkatkan permeabilitas dinding sel, meningkatkan kelarutan dan difusi dari senyawa yang diekstrak, dan mengurangi viskositas pelarut, namun suhu yang terlalu tinggi dapat mendegradasi senyawa polifenol. Harbourne et al. (2009) menambahkan bahwa penurunan total fenol pada suhu tinggi dikarenakan adanya penguapan komponen volatil fenol, penguraian senyawa fenol, dan penggabungan senyawa fenol tertentu dengan komponen lain. Marostica Jr et al. (2010) mengatakan bahwa beberapa komponen fenolik sensitif terhadap panas (thermosensitive). Cheong et al.(2005) meneliti tentang stabilitas panas pada senyawa fenolik dan melaporkan bahwa kadar epikatekin dan epigalokatekin galat menurun seiring dengan kenaikan suhu sedangkan epikatekin galat meningkat jumlahnya, dengan penggunaan suhu 60, 80, dan 100°C dengan waktu 0-300 menit.
Keterangan: Nilai yang diikuti oleh huruf yang berbeda menunjukkan nilai total fenol yang berbeda nyata (p< 0.05) dengan uji lanjut Duncan
Gambar 12. Nilai total fenol dari ekstrak teh hitam
CD CD AB DE A BC G EF FG b cd a de bc cd g ef f 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 70 C 5 menit 70 C 10 menit 70 C 15 menit 85 C 5 menit 85 C 10 menit 85 C 15 menit 100 C 5 menit 100 C 10 menit 100 C 15 menit To tal Fen o l ( m g G A E /g B K ) Perlakuan Penyeduhan
25
2.
Total Fenol Setelah Melewati Simulasi pH Pencernaan
Kesembilan ekstrak teh setelah melalui simulasi pH sistem pencernaan mengalami penurunan nilai total fenol, nilai total fenolnya menjadi sekitar 31.32-41.77 mg GAE/ g berat kering (Gambar 12). Masing-masing ekstrak teh setelah melalui simulasi pH sistem pencernaan memiliki kandungan total fenol (dalam mg GAE/ g berat kering) yang berbeda, yaitu ekstrak 70oC 5 menit (33.78), 70oC 10 menit (36.67), 70oC 15 menit (31.32), 85oC 5 menit (37.08), 85oC 10 menit (35.07), 85oC 15 menit (35.79), 100oC 5 menit (41.77), 100oC 10 menit (38.45), dan 100oC 15 menit (39.00) (Gambar 12). Hal ini mengindikasikan bahwa perubahan pH pada simulasi pencernaan yaitu pH 2 selama 30 menit lalu menjadi pH 6.8 memberikan efek penurunan kandungan komponen fenol dalam ekstrak teh hitam.
Analisis T-Test dua berpasangan dilakukan untuk mengetahui apakah ada perbedaaan yang signifikan antara kandungan total fenol ekstrak awal teh dengan kandungan total fenol ekstrak teh setelah melalui simulasi pH pencernaan in vitro. Analisis T-Test dua berpasangan dilakukan antara ekstrak awal dengan ekstrak setelah simulasi pH pencernaan pada setiap perlakuan penyeduhan.
