TINJAUAN PUSTAKA
2.4 Ekstraksi Cair-Cair
Ekstraksi cairan-cairan merupakan suatu teknik pemisahan atau
pengambilan zat dalam suatu larutan menggunakan pelarut lain (biasanya pelarut
organik) yang tidak tercampurkan. Pemisahan yang dilakukan, bersifat sederhana,
bersih, cepat dan mudah. Pemisahan dapat dilakukan dengan mengocok-ngocok
dalam sebuah corong pemisah selama beberapa waktu hingga terbentuk dua
lapisan (Basset, dkk., 1994).
Prinsip metode ini didasarkan pada distribusi zat terlarut dengan
perbandingan tertentu antara dua pelarut yang tidak saling bercampur seperti
benzena, karbon tetraklorida atau kloroform. Teknik ini dapat digunakan untuk
kegunaan preparatif, pemurnian, memperkaya, pemisahan serta analisis (Khopkar,
1990).
2.5 Kromatografi
Kromatografi merupakan suatu untuk memisahkan suatu senyawa yang
terdistribusi antara dua fase, yaitu fase gerak yang membawa sampel dan fase
diam yang menahan sampel. Pemisahan dan pemurnian suatu bahan dapat
dilakukan menggunakan salah satu dari teknik kromatografi yang ada. Pemilihan
teknik kromatografi sebagian besar tergantung pada sifat kelarutan dan keatsirian
senyawa yang akan dipisah (Bintang, 2010).
Pemakaian kromatografi dapat memberikan informasi mengenai ada atau
dengan senyawa murni. Kromatografi juga dapat menunjukkan jumlah minimum
komponen yang ada dalam campuran (Gritter, dkk., 1991).
2.5.1 Kromatografi lapis tipis
Kromatografi lapis tipis termasuk kromatografi adsorpsi. Fase diam pada
kromatografi lapis tipis berupa lapisan tipis yang terdiri dari bahan padat yang
dilapiskan pada permukaan penyangga datar yang biasanya terbuat dari kaca atau
logam. Fase gerak pada kromatografi lapis tipis adalah zat cair yang disebut
larutan pengembang (Gritter, dkk., 1991).
Campuran yang akan dikromatografi harus dilarutkan terlebih dahulu
dalam pelarut yang sesuai. Hampir segala macam pelarut dapat dipakai, tetapi
yang terbaik adalah yang bertitik didih antara 50o hingga 100o C agar mudah
menguap dari lapisan (Gritter, dkk., 1991). Cuplikan ditotolkan berupa pita yang
harus sesempit mungkin karena pemisahan berdasarkan pita. Penotolan dapat
dilakukan dengan kapiler halus atau dengan penotol otomatis. Plat dielusi dengan
pelarut yang diinginkan dan setelah elusi selesai disemprot dengan penampak
bercak (Hostettman, dkk., 1995).
a. Fase diam
Fase diam berfungsi untuk menahan sampel, dapat berupa cairan ataupun
padatan. Fase diam yang digunakan pada kromatografi lapis tipis beberapa
diantaranya adalah silika gel, alumina dan kieselguhr. Silika gel adalah bahan
yang paling banyak digunakan untuk pemisahan sebagian besar senyawa, seperti
asam amino, alkaloid, lipid, steroid, triterpenoid dan gula. Alumina digunakan
untuk pemisahan alkaloid, vitamin, karoten, fenol, steroid dan asam amino
sedangkan kieselguhr digunakan untuk pemisahan gula, oligosakarida, asam
untuk mengikat lapisan pada lempeng (Bintang, 2010).
b. Fase gerak
Fase gerak ialah medium angkut dan terdiri dari satu atau beberapa
pelarut. Pemilihan sistem pelarut yang dipakai didasarkan atas prinsip like
dissolves like yaitu untuk memisahkan sampel yang bersifat non polar digunakan
sistem pelarut yang bersifat non polar dan untuk memisahkan pelarut sampel yang
bersifat polar digunakan sistem pelarut yang bersifat polar (Stahl, 1985).
c. Harga Rf
Identifikasi bercak komponen dilakukan dengan menghitung harga
Retardation Factor (Rf) sebagai derajat retensi, yang didefinisikan sebagai jarak
yang ditempuh senyawa pada kromatografi dari tempat totolan terhadap jarak
tempuh pelarut atau dapat dituliskan sebagai berikut:
Faktor yang mempengaruhi harga Rf antara lain adalah suhu, pelarut, sifat
penjerap dan jumlah cuplikan (Bintang, 2010).
2.5.2 Kromatografi lapis tipis preparatif
Kromatografi lapis tipis (KLT) preparatif merupakan salah satu metode
pemisahan yang memerlukan pembiayaan paling murah dan menggunakan
peralatan sederhana. Ketebalan penyerap yang sering dipakai adalah 0,5-2 mm,
ukuran plat kromatografi biasanya 20x20 cm. Penyerap yang paling sering dipakai
adalah silika gel. Cuplikan ditotolkan berupa pita dengan lebar yang sesempit
mungkin. Kebanyakan penyerap KLT preparatif mengandung indikator
fluorosensi yang membantu mendeteksi senyawa yang tidak menyerap sinar
dengan cara menutup plat dengan sepotong kaca lalu menyemprot kedua sisi
dengan pereaksi semprot (Hostettman, dkk., 1995).
2.5.3 Kromatografi lapis tipis dua arah
Kromatografi lapis tipis (KLT) dua arah bertujuan untuk meningkatkan
resolusi sampel ketika komponen-komponen mempunyai karakteristik kimia yang
hampir sama, karena nilai Rf juga hampir sama. Dua sistem fase gerak yang
sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan pada suatu campuran tertentu,
sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai
tingkat polaritas yang hampir sama, sehingga KLT dua arah dapat dipakai untuk
memeriksa kemurnian isolat (Rohman dan Ibnu, 2012).
KLT dua dimensi dilakukan dengan menotolkan sampel pada satu sudut
lapisan berbentuk bujur sangkar dan dikembang dengan satu sistem pelarut
sehingga campuran terpisah menurut jalur yang sejajar dengan salah satu sisi. Plat
diangkat, dikeringkan, diputar 90 derajat, lalu diletakkan di dalam sistem pelarut
kedua (Gritter, dkk., 1991).
2.6 Spektrofotometri
2.6.1. Spektrofotometri sinar ultraviolet
Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan pemeriksaan visual,
yaitu dengan menggunakan alat untuk mengukur absorbsi energi radiasi
macam-macam zat kimia dan memungkinkan dilakukannya pengukuran kualitatif dari
suatu zat dengan ketelitian yang lebih besar (Day dan Underwood, 1986).
Spektrum ultraviolet senyawa-senyawa organik dihasilkan oleh transisi
antara tingkat-tingkat energi elektron. Elektron dari orbital energi rendah dalam
gelombang. Panjang gelombang serapan merupakan suatu ukuran perbedaan
tingkat-tingkat energi pada orbital-orbital yang tereksitasi (William dan
Flemming, 2014).
2.6.2 Spektrofotometri sinar inframerah
Spektrofotometri sinar inframerah digunakan untuk mengidentifikasi
senyawa organik. Pengukuran spektrum inframerah paling banyak dilakukan pada
daerah bilangan gelombang 4000-400 cm-1 (Bintang, 2010). Spektrum inframerah
terjadi akibat adanya berbagai transisi antara tingkat-tingkat energi vibrasi yang
dihasilkan oleh gugus fungsional (William dan Flemming, 2014).
Langkah-langkah umum untuk memeriksa spektrum inframerah menurut
Pavia, dkk (2001) adalah:
1. apakah terdapat gugus karbonil?
Gugus C=O memberikan puncak pada daerah 1660-1820 cm-1. Puncak ini
biasanya memiliki puncak yang lebar pada spektrum.
2. jika gugus C=O ada, periksalah gugus-gugus berikut:
a. Asam: memiliki serapan melebar pada 2500-3000 cm-1.
b. Amida: memiliki serapan medium di dekat 3500 cm-1. Kadang-kadang
puncak rangkap
c. Ester: memiliki serapan medium di daerah 1000-1300 cm-1.
d. Anhidrida: mempunyai dua serapan C=O di daerah 1810 dan 1760 cm-1.
e. Aldehida: mempunyai dua serapan lemah di dekat 2850-275- cm-1.
f. Keton: jika kelima kemungkinan di atas tidak ada.
3. jika gugus C=O tidak ada
a. Alkohol/fenol: memiliki gugus OH, puncak serapan melebar di daerah
b. Amina: memiliki gugus N-H, yaitu serapan medium di daerah 3500cm-1
c. Eter: memiliki gugus C-O (tidak ada -OH), yaitu serapan medium di daerah
1000-1300 cm-1.
4. Ikatan rangkap dua atau cincin aromatik
a. Ikatan C=C mempunyai serapan lemah di daerah 1650 cm-1.
b. Serapan medium sampai kuat pada daerah 1450-1650 cm-1 sering
menunjukkan adanya cincin aromatik.
5. Ikatan rangkap tiga
a. C N mempunyai serapan lemah di daerah 1650 cm-1.
b. C C mempunyai serapan tapi tajam di daerah 2150 cm-1.
6. Hidrokarbon
a. Kelima kemungkinan diatas tidak ada.
b. Serapan utama di daerah CH dekat 3000 cm-1.
c. Serapan lain di daerah 1375-1450 cm-1.
2.6.3 Spektrofotometri massa
Spektrofotometer massa merupakan perangkat untuk menghasilkan dan
menghitung berat ion suatu senyawa yang berat molekul dan informasi struktur
yang ingin diketahui. Semua spektrofotometri massa menggunakan tiga tahapan
dasar, yaitu molekul dibuat menjadi fase gas, lalu ditembakkan berkas elektron
dan menghasilkan ion bermuatan positif seperti kation M.+ kemudian ion-ion
dipisahkan berdasarkan rasio massa terhadap muatannya (m/z) (William dan
Fleming, 2014).
Salah satu sistem dari spektrofotometri massa yaitu Electrospray Mass
Spectrometry (ESI). Istilah electrospray adalah istilah yang diterapkan untuk
meninggalkan kapiler berupa kabut halus dan terdiri dari tetesan cairan bermuatan
tinggi, yang dapat ditentukan sebagai muatan positif atau negatif sesuai dengan
tegangan yang diterapkan pada pipa kapiler (William dan Fleming, 2014).
Keuntungan utama spektrofotometri massa yaitu metode ini lebih spesifik
dan sensitif untuk identifikasi senyawa yang tidak diketahui atau untuk
menetapkan keberadaan senyawa tertentu. Hal ini karena spektrofotometri massa
dapat memberikan informasi mengenai bobot molekul dan rumus molekul
berdasarkan pola fragmentasi. Puncak ion molekul penting dikenali karena
memberikan bobot molekul senyawa yang diperiksa (Silverstain, dkk., 1981).
Spektrofotometri Lc-Ms sistem ESI disebut juga dengan ionisasi lunak,
yang artinya menghasilkan ion molekul dengan sedikit fragmentasi. Hal ini dapat
menguntungkan dalam arti bahwa ion molekul (atau lebih tepatnya ion molekul
pseudo) selalu dapat diamati, namun informasi struktural yang didapat dari
spektrum massa sangat sedikit. Kerugian ini dapat diatasi dengan kopling tandem
BAB III
