B. PENELITIAN UTAMA
4. Elektroforesis Fraksi Protein Curd
a.
Pelarutan Protein
Proses pelarutan dilakukan pada sampel curd dan tepung kedelai menggunakan buffer
[Tris(hydroxymethyl)aminomethane] pH 8.4 yang mengandung 0.0β M –mercaptoethanol. Prinsip dari proses pelarutan protein adalah mereduksi ikatan-ikatan protein yang terbentuk, dimana – mercaptoethanol memiliki peran sebagai reducing agent yang dapat memutuskan ikatan disulfida protein sehingga protein dapat terekstrak dari matriks pangan (Corredig 2006).
Proses pelarutan dilakukan melalui tiga tahapan, kemudian hasil pelarutan protein dianalisis kadar proteinnya dengan metode Bradford (1979). Selanjutnya sampel (curd dan tepung kedelai) dianalisis kadar total proteinnya dengan metode mikro Kjeldahl (AOAC 1995). Sehingga berdasarkan hasil pengukuran kadar protein metode Bradford dan Kjeldahl, dapat dihitung besar persen recovery proses pelarutan protein. Data total protein (kjeldahl dan pelarutan), serta persen recovery pelarutan dapat dilihat pada Tabel 9.
Tabel 9. Hasil analisis protein curd
Sampel Total Protein
Kjeldahl * Total Protein Tereksrak * Recovery (%) Tepung Kedelai 39.85 13.38 33.56 60_0.4% 8.14 a 5.61ab 68.28b 60_0.8% 14.01 c 8.17 c 58.76ab 60_1.2% 13.17 bc 7.59 bc 58.23ab 80_0.4% 10.95 abc 6.68 abc 60.66ab 80_0.8% 10.87 ab 6.17 abc 56.82ab 80_1.2% 10.24 ab 5.10 a 50.55a
Nilai rataan dengan superskrip yang berbeda dalam kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0.05)
* Diukur dalam satuan mg/100mg berat sampel
Proses pelarutan protein pada tepung kedelai menghasilkan persen recovery pelarutan yang paling rendah (33.56%), hal tersebut diduga disebabkan oleh masih terikatnya protein kedelai dalam
a b ab a c ab 0 2 4 6 8 10 12 0.4% 0.8% 1.2% Kek e ra sa n S u b yek ti f C u r d Konsentrasi GDL 60 C 80 C 63 C 83 C
42
matriksnya (saat dalam bentuk tepung) sehingga lebih sulit untuk dilarutkan. Perlakuan suhu awal koagulasi atau konsentrasi GDL tidak memberikan pengaruh yang signifikan terhadap kadar protein curd yang dihasilkan. Namun interaksi kedua variabel tersebut memberikan pengaruh yang cukup signifikan terhadap kadar protein curd.Peningkatan konsentrasi tidak menyebabkan peningkatan kadar protein curd secara signifikan kecuali pada suhu awal koagulasi 63 °C dimana terjadi peningkatan kadar protein curd saat peningkatan konsentrasi 0.4% menjadi 0.8%. Hal tersebut disebabkan oleh proses koagulasi pada konsentrasi 0.4% belum berlangsung sempurna sehingga tidak semua protein terkoagulasi. Pada perlakuan konsentrasi 0.8%, kadar protein curd meningkat yang disebabkan oleh proses koagulasi yang sudah berlangsung sempurna.
Pengaruh suhu awal koagulasi terhadap jumlah protein yang dapat diekstrak menunjukkan bahwa rata-rata total protein yang dapat diekstraksi pada suhu awal koagulasi 63 °C (7.12mg/100mg) lebih besar dibandingkan pada suhu awal koagulasi 83 °C (5.98 mg/100ml). Hal tersebut diduga bahwa dengan meningkatnya suhu awal koagulasi menyebabkan interaksi antar molekul protein curd menjadi semakin kuat sehingga lebih sulit untuk diekstrak. Secara umum pengaruh peningkatan konsentrasi GDL pun menyebabkan penurunan jumlah total protein yang dapat diekstrak. Seperti yang sebelumnya dibahas, diduga pula bahwa dengan peningkatan konsentrasi GDL akan menyebabkan interaksi protein curd semakin kuat sehingga protein yang mampu diekstrak pun akan menurun.
Berdasarkan data persen recovery pelarutan protein, dapat diketahui pula bahwa nilai persen recovery pelarutan menurun dengan peningkatan suhu awal koagulasi dan peningkatan konsentrasi GDL yang ditambahkan. Pola penurunan persen recovery pelarutan yang disebabkan oleh peningkatan suhu awal koagulasi dan konsentrasi GDL tersebut diduga pula disebabkan oleh interaksi protein curd yang semakin kuat. Besarnya nilai persen recovery pelarutan curd ini merupakan hal yang cukup penting dalam analisis selanjutnya. Semakin besar nilai persen recovery pelarutan, maka jumlah protein yang terdeteksi sebagai pita saat analisis elektroforesis akan semakin mewakili total protein di dalam curd.
b.
Analisis GEL Elektroforesis
Hasil pelarutan protein (tepung kedelai dan curd berbagai perlakuan) yang akan dianalisis elektroforesis terlebih dahulu dianalisis kadar proteinnya menggunakan metode Bradford. Hal tersebut bertujuan agar konsentrasi sampel tidak kurang dari batas deteksi pewarna yang digunakan (coomassie brilliant blue, batas deteksi 0.1 g) (Bolag dan Edelstein 1991). Selain itu, dengan mengetahui kadar protein masing- masing sampel, maka jumlah protein yang akan diinjeksikan ke dalam mini slab elektroforesis dapat dibuat sama. Jumlah protein yang disuntikkan yaitu sebanyak 2.5 µg.
Elektroforesis digunakan dalam penelitian ini karena memiliki peran sangat penting dalam pemisahan molekul-molekul biologi, khususnya protein. Selain tidak mempengaruhi struktur biopolimer, elektroforesis juga sangat sensitif terhadap perbedaan muatan dan berat molekul yang cukup kecil (Bachrudin 1999). Penggunaan SDS dan merkaptoetanol disertai dengan pemanasan akan memecah struktur tiga dimensi protein, terutama ikatan disulfida menjadi subunit-subunit polipeptida secara individual. SDS akan bereaksi dengan protein membentuk kompleks SDS-protein yang bermuatan negatif. Kemudian protein dialirkan dalam medium yang mengandung medan listrik sehingga senyawa protein yang bermuatan negatif akan bergerak ke arah elektroda yang polaritasnya berlawanan dengan muatan molekul protein. Prinsip inilah yang digunakan untuk memisahkan molekul-molekul dengan muatan berbeda. Menurut Pomeranz dan Meloan (1994), migrasi partikel bermuatan tersebut dapat terjadi akibat perbedaan muatan total, ukuran dan bentuk partikel
43
Marker, yang digunakan sebagai standar protein, dalam penelitian ini terdiri atas protein- protein dengan berat molekul kecil (Low Molecular Weight). Marker (Fermentas) tersebutmengandung tujuh jenis protein standar, yaitu -galactosidase (BM : 116 kDa), bovine serum albumin (BM : 66.2 kDa), ovalbumin (BM : 45 kDa), lactase dehidrogenase (BM : 35 kDa), REase BSP 981
(BM μ β5 kDa), -Lactoglobulin (BM : 18.4 kDa), dan lysozime (BM : 14.4 kDa).
Gel hasil elektroforesis SDS-PAGE tersebut di dokumentasikan dalam bentuk gambar dengan menggunakan Gel-Doc (Bio-rad). Hasil dokumentasi gel menggunakan GEL-DOC dapat dilihat pada Gambar 27.
Gambar 27. Profil SDS-PAGE totsl protein curd dengan GEL-DOC
1 : GDL 0.4% - 63 °C; 2 : GDL 0.8% - 63 °C; 3 : GDL 1.2% - 63 °C; 4 : GDL 0.4% - 83 °C; 5 : GDL 0.8% - 83 °C; 6 : GDL 1.2% - 83 °C; M : marker protein; T : tepung kedelai
Pengaruh konsentrasi GDL dan suhu awal koagulasi terhadap profil protein berdasarkan SDS- PAGE ternyata menunjukkan pita protein dengan pola yang relatif sama. Pita protein yang muncul untuk hasil pelarutan curd semua perlakuan (6 perlakuan) menunjukkan pola yang relatif sama pula seperti pita protein pada hasil pelarutan tepung kedelai. Pita protein tersebut diduga terdiri dari α‟, α, yang merupakan subunit 7S ( -konglisinin) dan pita golongan Asam (A1, A2 ,A3, A4, A5) dan Basa
(B1,B2,B3,B4) yang merupakan subunit 11S (Glisinin). Pendugaan tersebut berdasarkan data publikasi
gel SDS-PAGE protein kedelai oleh Mujoo et al. (2003) (Gambar 2.)
Analisis selanjutnya yaitu penentuan berat molekul masing-masing pita protein. Penentuan berat molekul pita protein dihitung berdasarkan kurva standar marker, yang diperoleh melalui hubungan antara mobilitas elektroforetik (Rf) dengan nilai logaritma berat molekul (Log BM) protein marker (Lampiran 22.) Data penentuan berat molekul dari masing-masing pita protein dapat dilihat pada Tabel 10.
Tabel 10. menunjukkan berat molekul yang hampir sama antara sampel curd dan tepung kedelai. Berat molekul masing-masing subunit yaitu α΄ (76.71-83.70 kDa), subunit α (67.λβ-73.98 kDa), (55.54-55.87 kDa), kelompok asam (A1,A2,A3 dan A4) (22.82-39.53kDa), A5 (12.04-12.41
kDa) dan kelompok basa (16.41-19.79 kDa).
α α΄ A3 Asam (A1,A2,A4) Basa A5 1 2 3 4 5 6 M
44
Tabel 10. Nilai berat molekul pita protein sampel tepung kedelaidan semua sampel curd
Protein BM ( kDa )
Tepung Kedelai Curd GDL
α΄ 83.70 82.92 76.71 77.70 α 73.57 73.98 67.94 67.92 55.54 55.87 A3 44.58 44.48 Asam (A1,A2,A4) 39.32 39.53 34.30 34.69 22.85 22.82 Basa 19.79 19.62 16.54 16.41 A5 12.41 12.04
Hasil GEL-DOC tersebut kemudian dianalisis densitas pita proteinnya dengan menggunakan ImageJ 1.42q (software dari Wayne Rasband, National Institute of Health, USA (http://rsb.info.nih.gov/ij). Pengukuran densitas terhadap pita protein tersebut bertujuan untuk mengetahui persentase dari masing-masing pita tersebut. Dimana diduga bahwa terdapat perbedaan persentase pita protein pada masing- masing sampel yang disebabkan oleh perbedaan konsentrasi GDL dan suhu awal koagulasi. Data hasil analisis densitas pita protein dapat dilihat pada Tabel 11.
Tabel 11. Persentase fraksi protein SDS-PAGE
Sampel
Protein (%)
α΄ and α Asam Basa A5
(A3, A1, A2, A4)
Tepung Kedelai 20.33 11.33 39.03 25.38 3.93 63 °C_0.4% 29.15d 7.56b 36.39a 24.40c 2.50b 63 °C_0.8% 23.36b 8.87c 38.90bc 26.37d 2.50b 63 °C_1.2% 28.70d 7.44b 40.00c 22.10a 1.76a 83 °C_0.4% 24.49c 6.06a 38.23b 28.88e 2.34ab 83 °C_0.8% 24.87c 6.20a 41.62d 24.49c 2.82b 83 °C_1.2% 22.28a 9.31c 42.75d 23.20b 2.46b
Nilai rataan dengan superskrip yang berbeda dalam kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0.05)
Perhitungan persentase subunit merupakan perbandingan luas area masing-masing pita dibagi dengan luas area seluruh pita, sehingga jumlah total seluruh pita adalah 100% (Lampiran 26b.). Berdasarkan uji statistika ANOVA (Lampiran 27) menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan terhadap subunit-subunit protein 7S maupun 11S pada curd semua perlakuan. Perbedaan persentase pada masing-masing subunit protein tersebut merupakan sebuah kombinasi yang mungkin mempengaruhi profil parameter tekstur curd yang terbentuk.
45
Pada perhitungan proporsi subunit 11S dan 7S dalam curd, dilakukan pengelompokkan subunit berdasarkan kedekatan pita protein dalam gel elektroforesis dan bertujuan untuk mempermudah analisis perhitungan densitas pita protein. Pengelompokan subuit tersebut dibagi menjadi limakelompok, yaitu subunit α‟ dan α, , kelompok asam (A3, A1, A2, dan A4), kelompok basa, dan A5.
Subunit α‟ dan α merupakan penyusun protein 7S ( -konglisinin). Menurut Mujo et al. (2003), subunit α‟ memiliki berat molekul sekitar 72 kDa, sedangkan α memiliki berat molekul sekitar 68 kDa. Berdasarkan analisis ragam (Lampiran 27a.), suhu awal koagulasi, konsentrasi GDL dan interaksi keduanya memberikan pengaruh yang signifikan terhadap proporsi subunit α‟ dan α. Pengaruh suhu awal koagulasi menunjukkan bahwa proporsi subunit α΄ and α pada curd yang dikoagulasi pada suhu awal 63 °C (27.07%) lebih tinggi dibandingkan curd yang dikoagulasi pada suhu awal 83 °C (23.88%). Pengaruh konsentrasi GDL menunjukkan bahwa proporsi subunit α‟ dan α tertinggi diperoleh saat penambahan GDL 0.4% dan yang terendah saat penambahan GDL 0.8%. Interaksi antara suhu koagulasi dan konsentrasi GDL pun memberikan pengaruh yang signifikan
dengan proporsi subunit α‟ dan α tertinggi saat perlakuan 63 °C_0.4% (29.15%) dan yang terendah saat perlakuan 83 °C_1.2% (22.28%).
Selain α‟ dan α, -konglisinin (7S) juga tersusun atas polipeptida yang memiliki berat molekul sekitar 52 kDa (Mujo et al. 2003). Analisis ragam (Lampiran 27b.) menunjukkan bahwa suhu awal koagulasi, konsentrasi GDL dan interaksi keduanya memberikan pengaruh yang signifikan terhadap proporsi subunit dalam curd. Curd yang dikoagulasi pada suhu awal 63 °C memiliki
proporsi subunit (7.λ6%) yang lebih tinggi dibandingkan dengan curd yang dikoagulasi pada suhu awal 83 °C (7.19%). Uji Duncan terhadap konsentrasi GDL menunjukkan bahwa proporsi subunit tertinggi diperoleh saat penambahan GDL 1.2% dan terendah saat penambahan GDL 0.4%. Interaksi antara suhu awal koagulasi dan konsentrasi GDL menunjukkan pengaruh yang signifikan dengan
proporsi subunit tertinggi saat perlakuan 83 °C_1.2% (7.56%) dan yang terendah saat perlakuan 83 °C_0.4% (6.06%).
Subunit kelompok Asam (A3, A1, A2, dan A4) yang menjadi penyusun protein 11S merupakan
subunit yang terbesar dibandingkan subunit lainnya. Analisis ragam (Lampiran 27c.) menunjukkan bahwa suhu awal koagulasi dan kosentrasi GDL memberikan pengaruh yang signifikan terhadap proporsi subunit asam dalam curd. Pengaruh suhu awal koagulasi menunjukkan bahwa curd yang di koagulasi pada suhu awal 63 °C memiliki proporsi subunit asam yang lebih rendah dibandingkan curd yang dikoagulasi pada suhu awal 83 °C. Uji Duncan terhadap konsentrasi GDL dengan proporsi suubunit asam tertinggi diperoleh saat penambahan konsentrasi GDL 1.2% dan yang terendah saat penambahan GDL 0.4%.
Selain subunit asam, protein 11S juga di susun oleh subunit basa. Berdasarkan analisis ragam (Lampiran 27d.), suhu awal koagulasi, konsentrasi GDL dan interaksi keduanya memberikan pengaruh yang signifikan terhadap proporsi subunit basa dalam curd. Suhu awal koagulasi 63 °C, cenderung menghasilkan curd dengan proporsi subunit basa yang lebih rendah dibandingkan dengan curd yang dikoagulasi pada suhu awal 83 °C. Pengaruh konsentrasi GDL terhadap proporsi subunit basa menunjukkan bahwa proporsi subunit basa tertinggi diperoleh saat penambahan GDL 0.4% dan yang terendah pada saat penambahan GDL 1.2%. Interaksi suhu awal koagulasi dan konsentrasi GDL pun memberikan pengaruh yang signifikan, dengan proporsi subunit basa tertinggi pada perlakuan 83 °C_0.4% (28.88%) dan yang terendah pada perlakuan 63 °C_1.2% (22.09%).
Subunit A5 merupakan polipeptida penyusun protein 11S yang termasuk kelompok asam.
Analisis ragam (Lampiran 27e.) menunjukkan bahwa semua perlakuan tidak memberikan pengaruh yang signifikan terhadap proporsi subunit A5.
46
Banyak penelitian telah dilakukan terhadap pembuatan curd yang berasal dari bahan baku protein kedelai 11S dan 7S hasil pengisolasian. Telah dilaporkan pula bahwa curd yang dihasilkan dari protein 11S maupun 7S memberikan perbedaan karakteristik tekstur yang dihasilkan. Berbagai rasio antara subunit 11S /7S telah diujikan dan dikorelasikan terhadap parameter tekstur curd yang terbentuk. Dimana rasio 11S/7S yang lebih besar dilaporkan menyebabkan peningkatan kekerasan curd yang terbentuk (Mujoo et al. 2003). Namun pada pembuatan curd yang berasal dari protein kedelai alami, merupakan sebuah sistem kompleks yang merupakan interaksi banyak material, seperti protein, lemak, karbohidrat dan sebagainya. Oleh karena itu diduga terdapat pola yang berbeda mengenai rasio 11S/7S pada curd berbahan dasar protein kedelai alami dan curd berbahan dasar protein isolasi (11S dan 7S). Data persentase subunit 11S, 7S dan rasio 11S/7S seluruh perlakuan dapat dilihat pada Tabel 12.Tabel 12. Persentase protein 11S, 7S, dan rasio 11S/7S SDS-PAGE Sampel Protein (%) Hardness (kg F) 7S 11S 11S/7S 63 °C_0.4% 36.71c 63.29a 1.72 a 1.59a 63 °C_0.8% 32,23bc 67,77b 2,10 b 2.26c 63 °C_1.2% 36.14c 63.86a 1.77 a 1.99b 83 °C_0.4% 30.55a 69.45c 2.27 c 1.49a 83 °C_0.8% 31.07a 68.93c 2.22 c 3.05d 83 °C_1.2% 31.59ab 68.41bc 2.17 bc 1.93b
Nilai rataan dengan superskrip yang berbeda dalam kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0.05)
Hasil analisis densitas pita protein menunjukkan bahwa sebagian besar protein globulin penyusun curd didominasi oleh glisinin (11S), yang merupakan hasil penjumlahan polipeptida kelompok asam (A3, A1, A2, dan A4), kelompok basa dan A5, yaitu sekitar 64.97% untuk curd yang
dikoagulasikan pada suhu awal 63 oC dan sekitar 68.93% untuk curd yang dikoagulasikan pada suhu awal 83 oC. Sedangkan kandungan -konglisinin (7S) hanya sekitar 35.03% untuk curd yang dikoagulasikan pada suhu awal 63 oC dan sekitar 31.07 % untuk curd yang dikoagulasikan pada suhu awal 83 oC.
Berdasarkan pengujian statistika mengenai korelasi antara rasio 11S/7S terhadap kekerasan curd GDL (Lampiran 28), diketahui bahwa jika pengujian dilakukan hanya menggunakan data suhu awal koagulasi 63 °C dan tiga konsentrasi GDL, tingkat korelasi antara kekerasan dan rasio 11S/7S sebesar 0.749. Hal tersebut menandakan bahwa adanya korelasi positif yang cukup besar antara peningkatan rasio 11S/7S pada curd dengan peningkatan kekerasannya. Pengujian dengan menggunakan data suhu awal koagulasi 83 °C dan tiga konsentrasi GDL menunjukkan korelasi yang berlainan yaitu sebesar -0.156. Nilai korelasi yang kecil menunjukkan tidak adanya korelasi antara rasio 11S/7S terhadap kekerasan curd. Tidak adanya korelasi yang signifikan pula terjadi jika semua data digabungkan, hasil pengujian menunjukkan koefisien korelasi sebesar 0.297.
Pola korelasi rasio protein 11S/7S yang dipengaruhi oleh perlakuan suhu awal koagulasi diduga disebabkan oleh perbedaan kecepatan gelasi antara protein 11S dan 7S. Menurut Nagano et al. (1994a,b), protein 7S dapat membentuk gel pada suhu yang lebih rendah dibandingkan dengan protein 11S. Perlakuan suhu awal koagulasi 63 °C diduga menyebabkan protein 11S belum terkoagulasi sempurna, sehingga jumlah protein 11S yang terkoagulasi merupakan pengaruh dari pH. Oleh karena itu pada suhu awal koagulasi 63 °C, rasio protein 11S/7S berfluktuasi dan ternyata memiliki pola yang