Uji Aktifitas Enzim Selulase pada Substrat KUK, DUK, OGK dan CMC Gambar 7 memperlihatkan isolat TS2b yang umumnya mampu menghidrolisis substrat KUK, DUK, OGK dan CMC. Aktifitas enzim selulase tertinggi diperoleh pada substrat KUK yaitu sebesar 0.0179 U/mL dan aktifitas terendah diperoleh pada substrat DUK yaitu sebesar 0.0015 U/mL.
Gambar 7 Aktifitas enzim selulase isolat TS2b pada berbagai substrat
Gambar 8 Kadar gula pereduksi pada berbagai substrat
Enzim selulase mempunyai kemampuan menghidrolisis komponen dinding sel substrat KUK, DUK, OGK dan CMC, dibuktikan dengan adanya aktifitas enzim selulase dan dilepaskannya glukosa. Kadar glukosa yang dilepaskan sebanding dengan aktifitas enzim selulase yang dihasilkan (Gambar 7 dan 8). Seperti halnya aktifitas enzim selulase, kadar glukosa tertinggi juga diperoleh pada substrat KUK yaitu sebesar 0.9701 mg/L sedangkan terendah pada substrat DUK yaitu sebesar 0.0787 mg/L.
19 Substrat KUK, DUK dan OGK merupakan substrat selulosa yang tidak murni. Selain mengandung selulosa, substrat ini mengandung komponen serat lain seperti hemiselulosa dan lignin (Tabel 8). Aktifitas selulase TS2b lebih tinggi pada substrat KUK dibanding pada DUK, OGK dan CMC. Hal ini kemungkinan disebabkan adanya enzim hemiselulolitik yang mampu mendegradasi hemiselulosa menjadi glukosa pada enzim kasar yang diproduksi oleh TS2b. Ada hubungan yang erat antara enzim selulase dengan hemiselulase. Ada beberapa bakteri yang selain menghasilkan selulase, juga dapat menghasilkan hemiselulase. Seperti yang diungkapkan Han et al. (2003) bahwa bakteri Clostridium
cellulovorant saat ditumbuhkan pada substrat selulosa ternyata dapat
menghasilkan enzim hemiselulolitik (xylA). Diduga bakteri TS2b juga menghasilkan enzim hemiselulolitik.
Di antara substrat yang diuji, aktifitas enzim selulase tertinggi diperoleh pada substrat KUK. Hal ini bisa disebabkan karena lebih rendahnya kadar lignin yang terkandung dalam KUK dibanding DUK. Pada Tabel 8 dapat dilihat bahwa kandungan lignin KUK dan DUK berturut-turut sebesar 8.54 dan 19.23%. Diduga kandungan lignin ini mempengaruhi kerja enzim selulase.
Tabel 8 Kadar selulosa, hemiselulosa dan lignin pada KUK dan DUK
Substrat Selulosa (%) Hemiselulosa (%) Lignin (%)
KUK 9.05 10.46 8.54
DUK 22.85 0.04 19.23
Selulosa terbungkus dan terikat pada matrik amorf lignin dan hemiselulosa. Lignin membungkus dan mengikat selulosa secara fisik sehingga menghalangi enzim selulase bekerja secara maksimal pada substrat. Adanya lignin tersebut dapat menyebabkan rendahnya biodegradasi selulosa dan hemisellulosa (Soliman et al. 2013). Hasil serupa diperoleh pada penelitian Maranatha (2008) yang memperlihatkan bahwa aktifitas enzim selulase isolat C5-1 lebih tinggi pada substrat kulit pisang dibanding CMC. Begitu pula aktifitasnya lebih tinggi pada kulit pisang daripada tongkol jagung. Hal ini diduga disebabkan oleh kadar lignin pada kulit pisang lebih sedikit dibanding pada tongkol jagung.
Dihasilkannya aktifitas selulase dan gula pereduksi menunjukkan bahwa selulosa dalam substrat telah terhidrolisis dan dirubah menjadi glukosa. Dengan bekurangnya kadar selulosa diharapkan dapat meningkatkan kecernaan bahan tersebut sehingga pemanfaatannya dalam formulasi pakan ikan lebih dapat dioptimalkan. Ikan mempunyai keterbatasan dalam mencerna serat kasar dalam pakan karena jumlah enzim pencernaan yang diproduksi oleh ikan hanya bersumber dari saluran pencernaan dan dari mikroflora yang terdapat dalam usus yang jumlahnya terbatas (Andriani et al. 2012). Menurut Leeson & Zubair (2000), selulosa dapat mempengaruhi viskositas cairan usus yang berakibat terhadap penurunan kecepatan difusi substrat dan enzim pencernaan, sehingga menurunkan efisiensi penyerapan nutrien secara keseluruhan pada dinding usus, yang pada gilirannya akan berdampak langsung terhadap efisiensi pakan dan performa ternak.
Pemanfaatan KUK dan DUK sebagai bahan baku pakan belum banyak diinformasikan. Chhay et al. (2010) melaporkan bahwa pemanfaatan DUK sebagai pakan ikan baik dalam bentuk segar ataupun kering tidak memberikan
20
pengaruh yang berbeda terhadap pertambahan bobot dan panjang ikan nila (O. niloticus). Hal yang serupa yang ditemukan oleh Keong & Wee (1989) yang memperlihatkan bahwa tidak ada perbedaan antara pemanfaatan DUK secara segar ataupun kering terhadap pertumbuhan ikan nila tetapi semakin tinggi tingkat DUK dalam pakan cenderung menurunkan pertumbuhan dan efisiensi pakan. Bichi & Ahmad (2010) menunjukkan bahwa tingkat inklusi DUK terhadap maize meal sebesar 66.7% memberikan respon pertumbuhan terbaik pada ikan Clarias gariepinus. Penelitian Nnaji et al. (2010) memperlihatkan bahwa ikan nila (O.
niloticus) yang diberi pakan dengan DUK memberikan pertumbuhan, rasio
efiesiensi protein dan konversi pakan yang lebih baik dibanding pakan yang mengandung daun Gliricidia sepium dan Stylosanthes humilis. Menurut Azwar & Melati (2012), laju pertumbuhan spesifik ikan nila yang diberi pakan dengan menggunakan kulit ubi kayu terfermentasi hingga 16% tidak berbeda nyata dengan perlakuan kontrol (tanpa tepung kulit ubi kayu).
Uji Aktifitas Enzim Selulase Mikroba Terpilih (B. subtilis) pada Substrat Paling Cocok (KUK)
Dari hasil uji aktifitas selulase pada berbagai substrat, diketahui bahwa enzim selulase yang dihasilkan isolat TS2b efektif dalam menghidrolisis KUK, sehingga pada tahap ini dilihat lebih lanjut pengaruh enzim selulase terhadap kualitas nutrisi KUK. Hasil pengukuran parameter fraksi serat (NDF, ADF, Selulosa, hemiselulosa, dan lignin) KUK dengan pemberian dosis enzim selulase yang berbeda dapat dilihat pada Tabel 9.
Tabel 9 Kadar fraksi serat KUK pada berbagai dosis enzim selulase isolat TS2b Dosis
(%)
Kadar Fraksi Serat (%)a
NDF ADF Lignin Selulosa Hemiselulosa
0 39.75 ± 0.16a 24.19 ± 0.06a 8.74 ± 0.57a 14.85 ± 0.64a 15.57 ± 0.09a 25 33.28 ± 0.35b 23.96 ± 0.09ab 12.14 ± 0.03b 12.17 ± 0.04b 9.32 ± 0.45b 50 33.15 ± 0.43b 23.79 ± 0.13b 10.74 ± 0.38c 13.30 ± 0.10c 9.37 ± 0.56b aAngka-angka pada kolom yang sama yang dikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda
nyata pada taraf uji 5% (P>0.05)
Penggunaan berbagai dosis enzim selulase secara umum mengakibatkan penurunan kandungan komponen serat kecuali kandungan lignin. Berdasarkan hasil analisis sidik ragam, penambahan enzim selulase memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap penurunan kadar NDF dan ADF pada KUK dibandingkan kontrol (P<0.05). Kadar NDF tertinggi diperoleh pada perlakuan A (tanpa penambahan enzim) yaitu sebesar 39.75%, sedangkan kadar NDF terendah diperoleh pada perlakuan 50% yaitu sebesar 33.15%. Hal yang serupa terjadi pada kadar ADF pada KUK. Kadar ADF relatif tertinggi diperoleh pada perlakuan 0% yaitu sebesar 24.19% dan relatif terendah pada perlakuan 50% yaitu sebesar 23.79%. Berdasarkan hasil uji Duncan, penambahan enzim dengan dosis yang berbeda tidak memberikan pengaruh nyata terhadap kadar NDF dan ADF (P>0.05). Hasil yang sama diperoleh pada penelitian Hidayat et al. (2005) yang memperlihatkan adanya penurunan kandungan NDF dan ADF pada jerami padi yang diberi perlakuan enzim selulase komersial dan enzim selulase yang diisolasi
21 dari Tricoderma viride. Begitupun jagung yang diberi perlakuan dengan enzim selulase mempunyai kadar NDF yang lebih rendah dibandingkan dengan tanpa enzim selulase. Penelitian Alemawor et al. (2009) menunjukkan terjadinya penurunan kadar ADF dan NDF pada kulit coklat (cocoa pod husk) yang diberi enzim fibrolitik. Penurunan kadar NDF dan ADF disebabkan karena adanya pemutusan ikatan lignoselulosa (Akhmal 1994).
NDF merupakan komponen serat tanaman yang terdiri atas hemiselulosa, selulosa dan lignin yang tidak larut dari matrik dingding sel. Semakin tinggi kadar NDF dalam pakan maka terjadi kecenderungan penurunan komsumsi pakan. NDF dibutuhkan dalam pakan, jika kadar NDF terlalu rendah maka akan terjadi ganguan pencernaan seperti asidosis dan displasia abomasum. NDF biasanya banyak digunakan ahli gizi sebagai penanda keseimbangan pakan (Robinson et al.
1998).
ADF merupakan sub-fraksi dari NDF terdiri dari lignin dan selulosa. ADF merupakan bagian fraksi serat yang tidak larut dalam larutan detergen asam. ADF menentukan kecernaan beberapa hijauan, semakin tinggi kadar ADF maka semakin turun kualitas hijauan tersebut (Robinson et al. 1998). Menurut Van Soest et al. (1991) bahwa NDF dan ADF mempunyai korelasi yang negatif dengan kecernaan bahan pada hewan. Kemampuan hewan monogastrik dan ruminan sangat berbeda dalam mencerna serat kasar. Ruminan mempunyai kemampuan lebih baik dalam mencerna serat kasar karena mempunyai mikroorganisme dalam saluran pencernaannya yang bisa mencerna serat kasar. ADF mewakili selulosa dan lignin dingding sel tanaman. Analisis ADF dibutuhkan untuk evaluasi kualitas serat untuk pakan ternak ruminansia dan herbivora lain. Untuk ternak non ruminansia dengan kemampuan pemanfaatan serat yang kecil, hanya membutuhkan analisis NDF (Soeparjo 2004).
Hal yang sedikit berbeda diperoleh pada kandungan selulosa KUK. Antar perlakuan memberikan hasil yang berbeda nyata (P<0.05). Kandungan selulosa terendah diperoleh pada perlakuan dosis 25% dan berbeda nyata dengan perlakuan 0% (kontrol), dan 50%. Hasil yang sama yang serupa untuk kandungan hemiselulosa, perlakukan dosis 25% menghasilkan kandungan hemiselulosa terendah dan berbeda nyata dengan perlakuan 0% (kontrol) (P<0.05) tetapi tidak berbeda nyata dengan perlakuan 50% (P>0.05). Enzim selulase dapat digunakan sebagai biokatalis untuk mendegradasi pakan berserat yang kaya akan hemiselulosa dan selulosa (Lamid 2008). Hemiselulosa merupakan komponen serat pertama kali yang dipecah karena hemiselulosa dihubungkan oleh ikatan kovalen dengan lignin yang mengelilingi selulosa dan strukturnya lebih sederhana dibandingkan dengan selulosa dan lignin. Pada Tabel 8 dapat dilihat bahwa komponen serat yang paling banyak mengalami penurunan adalah hemiselulosa dibandingkan komponen serat lain. Hal ini disebabkan hemiselulosa mempunyai berat molekul yang lebih rendah dibandingkan dengan selulosa (Anindyawati 2010). Hemiselulosa relatif mudah dihidrolisis dengan asam menjadi monomer yang mengandung glukosa, mannosa, galaktosa, xilosa dan arabinosa (Perez et al. 2002). Setelah hidrolisis hemiselulosa dilanjutkan dengan pemecahan struktur selulosa menjadi struktur yang lebih sederhana (glukosa). Penurunan kadar selulosa dan hemiselulosa dengan penambahan enzim selulase menunjukkan bahwa telah terjadi pemecahan selulosa dan hemiselulosa dingding sel KUK sehingga KUK diharapkan lebih mudah dicerna.
22
Kandungan lignin KUK yang diberi perlakuan enzim lebih tinggi dibandingkan kontrol. Hal yang sama terjadi pada penelitian Hidayat et al. (2005) di mana kadar lignin jerami padi mengalami peningkatan setelah diberi perlakuan enzim selulase komersial. Hal ini terjadi karena diduga enzim selulase yang dihasilkan dari bakteri TS2b tidak mempunyai aktifitas lignase sehingga penambahan enzim ini tidak mampu menurunkan kadar lignin pada KUK Terdapat dua sistem kerja enzim ektraseluler yang dihasilkan oleh mikroba: 1) sistem hidrolitik, yaitu sistem kerja enzim ekstraseluler yang menghasilkan enzim hidrolase yang bekerja merombak selulosa dan hemiselulosa, dan 2) sistem oksidatif dan sekresi lignase ekstraseluler dengan cara depolimerisasi lignin (Perez et al. 2002). Enzim selulase yang dihasilkan bakteri TS2b diduga merupakan tife enzim ekstraseluler dengan sistem kerja hidrolitik yang hanya bisa bekerja merombak selulosa dan hemiselulosa tetapi tidak untuk lignin. Van Soest (2006) menyatakan bahwa hanya jamur pelapuk putih yang mampu mendegradasi lignin secara efektif. Jamur pelapuk putih memproduksi enzim lignolitik yang mampu bekerja mengoksidasi pelepasan unit fenilpropanoid, demetilasi, mengubah gugus aldehid menjadi gugus karboksil, dan membuka cincin aromatik sehingga sempurna merombak lignin menjadi C02 dan H2O. Jamur ini menghasilkan tiga kelas enzim ekstraseluler perombak lignin yaitu lakase pengoksidasi fenol, peroksidase lignin dan oksidase mangan (Soeparjo 2004).
Penelitian Hidayat et al. (2005) memperlihatkan bahwa penambahan enzim selulase dari Tricoderma viride menyebabkan penurunan kadar lignin jerami padi. Hal ini disebabkan enzim selulase dari T. viride diduga selain mempunyai aktifitas selulase juga mempunyai aktifitas lignase dan bisa memproduksi asam organik selama proses fermentasi sehingga mampu menurunkan kadar lignin. Asumsi ini didukung oleh pernyataan Peterson (1986) bahwa enzim yang dihasilkan oleh T. viride mampu mendepolimerisasi lignin. Monsier et al. (2005) dalam Harpiah (2010) menyatakan bahwa lignin membutuhkan enzim ektraseluler yang tidak spesifik karena lignin mempunyai struktur acak dengan berat molekul yang tinggi. Lignin biasanya terakumulasi selama proses degradasi lignoselulosa. Lignin dapat didegradasi oleh senyawa alkali (Hedjazia et al. 2009) dan radiasi ultra violet (Vähätalo et al. 1999). Lignin merupakan komplek polimer aromatik non-karbohidrat pada tanaman dan dapat berikatan secara kuat dengan polisakarida seperti selulosa dan hemiselulosa membentuk komplek lignoselulolitik. Tingginya kadar lignin dan selulosa kristalin merupakan penghalang utama dalam kerja dalam memotong ikatan non strach polysaccharida (NSPs) pada bahan baku pakan (Alemawor et al. 2009). Lignin merupakan struktur yang lebih tahan terhadap biodegradasi karena strukturnya yang komplek dan heterogen yang berikatan dengan selulosa dan hemiselulosa dalam jaringan tanaman. Kristalisasi selulosa dan pengerasan fibril selulosa oleh lignin membentuk suatu senyawa lignoselulosa yang keras. Komponen lignin merupakan komponen serat kasar yang paling rendah penurunannya dibanding selulosa dan hemiselulosa (Orth et al. 1993). Penambahan enzim selulase mempengaruhi kadar gula pereduksi. Kadar gula pereduksi tertinggi tertinggi diperoleh pada perlakuan dosis 50% yaitu sebesar 1.28mg/L dan terendah pada perlakuan 0% (kontrol) yaitu sebesar 0.80 mg/L (Gambar 9).
23
Gambar 9 Kadar gula preduksi pada KUK yang dihidrolisis enzim selulase isolat TS2b dengan dosis 0 (A), 25 (B) dan 50 % (C)
Peningkatan kadar gula pereduksi berkorelasi positif dengan penurunan kadar serat kasar secara umum (NDF dan ADF). Semakin tinggi penurunan serat kasar maka semakin tinggi pula kadar gula pereduksi yang dihasilkan. Hal ini menunjukkan bahwa serat kasar pada dasarnya berhasil didegradasi oleh enzim selulase menjadi bentuk yang lebih sederhana yaitu gula pereduksi. Selulosa di rubah menjadi rantai linear dan unit-unit disakarida (selobiosa) yang selanjutnya diubah menjadi glukosa (gula pereduksi) oleh enzim selulase (Moore-Landecker 1990). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa dosis optimum enzim selulase yang bisa menurunkan serat kasar dan meningkatkan kadar gula pereduksi tertinggi adalah perlakuan dosis 50%.
Hasil pengukuran protein terlarut KUK setelah dihidrolisis dengan berbagai dosis enzim selulase disajikan pada Gambar 10. Konsentrasi enzim selulase mempengaruhi kadar protein terlarut. Kadar protein terlarut tertinggi terdapat pada perlakuan dosis 50% yaitu sebesar 0.69 mg/mL, sedangkan yang terendah pada perlakuan 0% (kontrol) yaitu sebesar 0.40 mg/mL. Protein terlarut adalah jenis protein yang dapat dicerna oleh benih ikan (Tonheim et al. 2007). Peningkatan protein terlarut pada penelitian ini disebabkan telah terpecahnya dingding sel KUK oleh enzim selulase yang meyebabkan terlepasnya protein yang semula berikatan dengan dingding sel.
Gambar 10 Kadar protein terlarut KUK yang dihidrolisis enzim selulase dengan dosis 0 (A), 25 (B) dan 50% (C)
24
4 SIMPULAN
Dari hasil isolasi bakteri dari rumput laut Sargasum sp dan Turbinaria sp diperoleh 22 isolat dan tiga isolat di antaranya menghasilkan aktifitas enzim selulase yang tinggi yaitu isolat TS2b, SS4a dan SS4b. Hasil identifikasi secara biokimia dan molekuler gen 16S-rRNA diketahui bahwa ketiga isolat tersebut adalah B. subtilis, B. megaterium dan B. flexus dengan aktifitas enzim selulase tertinggi terdapat pada isolat TS2b (B. subtilis). Produksi enzim selulase maksimum oleh bakteri TS2b terjadi pada jam ke -78 setelah inkubasi. Daya hidrolisis enzim selulase tertinggi diperoleh pada substrat KUK dan daya hidrolisis terendah diperoleh pada substrat DUK. Dari hasil uji lebih lanjut dengan menggunakan beberapa dosis enzim selulase isolat TS2b terhadap substrat KUK diketahui bahwa dosis enzim selulase yang paling efektif meningkatkan mutu KUK secara umum adalah dosis 50% dengan besar penurunan fraksi serat NDF, selulosa, dan hemiselulosa berturut-turut sebesar 16.60, 10.44 dan 39.82%.