1. Pengaruh suhu terhadap kinerja enzim
Pada percobaan selanjutnya adalah untuk mengetahui pengaruh suhu terhadap kinerja enzim. Dimana percobaan dilakukan dengan meletakkan suspensi amilum sebanyak 2 ml dan ditambah larutan saliva sebanyak 1 ml pada 4 buah tabung reaksi yang berbeda. Tabung 1 dimasukkan pada air es, tabung 2 dimasukkan pada penangas air bersuhu 370 - 400 C, tabung 3 dimasukkan pada penangas air mendidih, tabung 4 diletakkan pada suhu ruang. Selanjutnya, dbiarkan selama 15 menit. Kemudian masing-masing tabung tetesi dengan larutan IKI. Hasil yang diperoleh adalah sebagai berikut :
Tabung 1 ( air es) berwarna kuning (++)
Tabung 2 ( suhu 400C ) berwarna kuning (++++, paling kuning) Tabung 3 ( suhu 1000C ) berwarna kuning kehitaman
Tabung 4 ( suhu ruang ) berwarna kuning bening (+)
Enzim jika dipanaskan ± diatas suhu 400C akan mengalami denaturasi (kerusakan) karena gaya-gaya ikatan lemah penting yang terdapat didalam enzim akan rusak akibat meningkatnya getaran termal pada suhu yang tinggi. Enzim juga sangat sensitif terhadap suhu yang rendah. Enzim tidak akan bekerja pada suhu yang rendah karena gaya-gaya lemah pada sub unit tunggal enzim terganggu pada bentuk polimeriknya. (Biokimia ; Rex Montgomery). Suhu optimum enzim untuk bekerja secara optimal adalah berbeda-beda sesuai dengan jaringan penghasilnya. Namun kebanyakan enzim akan bekerja optimal pada suhu 370C-400C.
Hasil percobaan yang telah didapatkan mengalami kesalahan karena berdasar teori seharusnya pada suhu 1000C enzim akan mengalami denaturasi (kerusakan) akibat suhu termal yang terlalu tinggi, dan ketika diletakkan pada suhu ruang seharusnya ia bekerja namun tidak secara optimal karena masih terdapat suhu yang menggerakkan gaya gaya lemah penyusun enzim untuk bekerja. Ketika dimasukkan pada air es seharusnya ia tidak akan bekerja dengan penanda warna kuning jernih atau tidak terdapatnya lingkaran hitam karena suhu rendah mengakibatkan gaya-gaya lemah penyusun enzim untuk bekerja tidak akan aktif. Sedangkan
pada suhu 400C seharusnya suhu yang paling optimal bagi enzim amilase untuk bekeja. Kesalahan percobaan yang terjadi dikrenakan kurang lamanya proses pendinginan maupun proses pemanasan sehingga hasil uji tidak menunjukkan data yang akurat. Atau mungkin juga dikerenakan kurangnya ketelitian dari praktikan ketika mengamati perubahan warna yang terjadi pada larutan uji.
Percobaan selanjutnya adalah uji benedict. Dimana percobaan dilakukan dengan menambahkan masing-masing 15 tetes fehling A dan B yang telah dikocok hingga tercampur pada tabung reaksi yang berisikan suspensi amilum + saliva sebanyak 5 tetes. Setelah itu dipanaskan diatas lampu spirtus hingga mendidih atau selama 2 menit. Hasil percobaan diperoleh sebagai berikut :
Tabung 1 ( air es) berwarna biru (+++)
Tabung 2 ( suhu 400C ) berwarna biru (++++, paling biru) Tabung 3 ( suhu 1000C ) berwarna biru (++)
Tabung 4 ( suhu ruang ) berwarna biru (+)
Hasil percobaan yang kami lakukan mengalami kesalahan karena berdasar teori hasil pada uji dengan reagen benedict adalah kebalikan dari uji dengan reagen IKI. Dimana seharusnya pada suhu optimal (pada suhu 400C) ketika diuji dengan benedict menghasilkan warna yang lebih gelap yakni kecokelatan (++++) dan pada suhu ruang ketika larutan uji ditetesi reagen benedict akan berwarna lebih muda dari hasil uji pada suhu 400C (+++) atau biasanya berwarna hijau kekuningan. Sedangkan untuk yang berada pada air es seharusnya tidak mengalami perubahan warna (tetap biru) , hal ini dikarenakan enzim tidak aktif pada suhu tersebut. Begitu juga dengan suhu 1000C juga tidak akan mengalami perubahan warna, hal ini disebabkan pada suhu tersebut enzim mengalami denaturasi sehingga tidak bisa menghidrolisis amilum menjadi maltose dan glukosa. Hal ini berkaitan dengan uji dengan reagen IKI dimana pada kondisi ini ikatan pada amilum masih kuat atau belum terlepas sehingga kandungan maltosa (disakarida) yang terbentuk dari hidrolisis amilum masih banyak dan terbentuknya glukosa (monosakarida) gula pereduksi masih relatif sedikit yang ditunjukkan oleh uji benedict dengan berwarna biru. Dan ketika ikatan pada amilum mulai melemah atau mulai banyak yang terlepas, kandungan maltosa (disakarida) yang terbentuk dari hidrolisis amilum sudah semakin sedikit karena telah terpecah menjadi glukosa (monosakarida) gula pereduksi, yang ditunjukkan dengan uji benedict dengan warna
biru yang lebih tua daripada percobaan sebelumnya. Kesalahan yang terjadi ini dapat disebabkan karena kurang lamanya proses pendinginan maupun pemanasan sehingga hasil uji menunjukkan data yang kurang akurat dan dapat juga dikarenakan kurangnya ketelitian pada saat mengamati perubahan warna.
2. Pengaruh pH
Pada praktikum kali ini, dilakukan pengujian pengaruh pH terhadap kerja enzim amilase. Amilase yang digunakan pada praktikum ini yaitu larutan saliva. Pertama, 2 ml suspensi amilum 2 % dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 1 ml larutan saliva dan dikocok hingga tercampur. Selanjutnya, ditambah 8 tetes HCl 1 N dan dibiarkan selama 15 menit. Setelah menit ke 15, larutan tersebut diuji dengan reagen IKI. Dari pengujian tersebut terjadi perubahan warna pada larutan. Awalnya, larutan berwarna putih keruh berubah menjadi kuning dengan campuran warna hitam. Dalam pengujian ini digunakan HCl 1 N atau setara dengan HCl 1 M, sehingga larutan HCl tersebut memiliki pH 0
pH = - log [H+] pH = - log 1 pH = 0
Pada pH 0 diperoleh hasil positif pada uji IKI yakni terdapatnya campuran warna hitam pada larutan. Warna hitam yang terbentuk pada larutan menujukkan bahwa pada pH tersebut enzim amilase tidak aktif dan karbohidrat (amilum) tidak dapat terhidrolisis. Selanjutnya, dilakukan pengujian dengan benedict namun tidak dihasilkan perubahan warna yakni biru tua tetap menjadi biru tua, hal ini berarti larutan tersebut negatif terhadap uji benedict. Hal tersebut juga dikarenakan pada kondisi yang sangat asam enzim tidak aktif sehingga amilum tidak dapat dihirolisis menjadi glukosa (gula pereduksi) oleh enzim amilase. Enzim amilase saliva memiliki pH optimal pada pH 7, karena pada pH ini diperoleh aktivitas enzim yang tinggi (kecepatan reaksi enzimatik tinggi). Menurut Amerongen (1991) amilase yang terdapat dalam saliva adalah α-amilase liur yang mampu membuat polisakarida (pati) dan glikogen dihidrolisis menjadi maltosa dan oligosakarida lain dengan menyerang ikatan glikosodat α(1→ 4). Amilase liur akan segera terinaktivasi pada pH 4,0 atau kurang sehingga kerja pencernaan makanan dalam mulut akan terhenti apabila lingkungan lambung yang asam menembus partikel makanan.
Pada percobaan berikutnya, 2 ml suspensi amilum 2 % dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 1 ml larutan saliva dan dikocok hingga tercampur. Selanjutnya, ditambah 8 tetes NaOH 1 N dan dibiarkan selama 15 menit. Setelah menit ke 15, larutan tersebut diuji dengan reagen IKI. Dari pengujian tersebut terjadi perubahan warna pada larutan. Awalnya, larutan berwarna putih berubah menjadi kekuning-kuningan dengan campuran warna hitam. Dalam pengujian ini digunakan NaOH 1 N atau setara dengan NaOH 1 M, sehingga larutan NaOH tersebut memiliki pOH 14
pOH = - log [OH-] pOH = - log 1 pOH = 0
pH = 14 - pOH = 14 – 0
= 14 (basa kuat)
Pada pH 14 diperoleh hasil positif pada uji IKI yakni terdapatnya campuran warna hitam pada larutan. Warna hitam yang terbentuk pada larutan menujukkan bahwa pada pH tersebut enzim amilase mengalami denaturasi sehingga enzim amilase tidak dapat menghidrolisis amilum. Menurut pemaparan di atas enzim amylase yang terdapat dalam air liur (saliva) adalah enzim α-amilase. Berdasarkan penelitian AOAC (Association of Analytic Chemist) tahun 1995 kisaran pH optimum untuk enzim α-amilase adalah 4.8 - 8.5. (Suarni, 2007). Oleh sebab itu, pada pH 14 enzim tersebut tidak dapat bekerja karena terdenaturasi. Selanjutnya, dilakukan pengujian dengan benedict dihasilkan perubahan warna yakni biru tua menjadi biru semakin tua, hal ini berarti larutan tersebut negatif terhadap uji benedict. Hal tersebut juga dikarenakan pada kondisi yang sangat basa enzim mengalami denaturasi sehingga amilum tidak dapat dihirolisis oleh enzim amylase menjadi maltose dan glukosa.
Percobaan selanjutnya, 2 ml suspensi amilum 2 % dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 1 ml larutan saliva dan dikocok hingga tercampur. Selanjutnya, dibiarkan selama 15 menit. Setelah menit ke 15, larutan tersebut diuji dengan reagen IKI. Dari pengujian tersebut dihasilkan perubahan warna dari putih menjadi putih dengan campuran warna hitam. Hal ini menandakan uji positif. Seharusnya, larutan tersebut berubah warna menjadi kekuningan
dengan endapan warna hitam, karena enzim amilase mulai mengdidrolisis amilum menjadi disakarida (maltose) dan monosakarida (glukosa). Sedangkan saat diuji dengan benedict tidak terjadi perubahan warna, namun warna biru nya masih lebih tua saat pengujian dengan ditambah HCl 1 N. Berdasarkan literatur seharusnya larutan tersebut berubah warna menjadi biru kehijauan. Hal ini dikarenakan enzim bekerja pada pH netral yakni pH 7 tanpa pengaruh larutan asam maupun basa, sehingga enzim dapat menghidrolisis amilum menjadi disakarida (maltose) dan monosakarida (glukosa) dengan optimal. Kesalahan-kesalahan yang terjadi ini dapat dikarenakan faktor human error, seperti kurang teliti dalam mengamati perubahan warna dan kurang tepat dalam pemberian volum ekstrak enzim yang diperlukan.
3. Pengaruh Konsentrasi Enzim
Pada praktikum kali ini, dilakukan pengujian pengaruh konsentrasi enzim terhadap kerja enzim amilase. Amilase yang digunakan pada praktikum ini yaitu larutan saliva. Pada percobaan untuk mengetahui pengaruh konsentrasi enzim ini, praktikan membutuhkan 4 tabung reaksi yang diisi saliva dengan konsentrasi yang berbeda beda. Pada tabung 1 diisi 0,5 ml saliva, tabung 2 diisi 1 ml saliva, tabung 3 diisi 1,5 ml saliva dan tabung 4 diisi 2 ml saliva. Kemudian pada setiap tabung ditambah dengan 2 ml suspensi amilum 2%. Kemudian dikocok sampai tercampur dan didiamkan selama 15 menit. Setelah itu ditambahkan larutan benedict dan IKI yang akan menandakan perbedaan warna dari masing-masing perlakuan pada percobaan faktor yang mempengaruhi kerja enzim, larutan benedict merupakan indikator adanya kandungan glukosa sedangkan larutan IKI ini merupakan indikator adanya karbohidrat (amilum) dalam larutan.
Pada perlakuan yang pertama, tabung 1 dengan 0,5 ml saliva yang sudah ditambahkan amilum dan didiamkan selama 15 menit ketika ditetesi benedict terjadi perubahan warna menjadi biru muda dan ketika ditetesi dengan IKI terjadi warna kuning dengan adanya endapan warna orange sangat sedikit (+). Begitu juga pada tabung 2 ketika ditetesi benedict berubah menjadi warna biru dan ketika ditetesi dengan IKI menjadi warna kuning tua dengan adanya endapan warna orange yang banyak (+++). Tabung 3 ketika ditetesi dengan benedict menjadi warna biru tua dan ketika ditetesi dengan IKI menjadi warna kuning sangat muda dengan adanya endapan warna orange yang paling banyak (++++). Sedangkan pada tabung 4 ketika ditetesi dengan benedict menjadi biru sangat muda dan ketika ditetesi dengan IKI warnanya menjadi kuning muda dengan adanya endapan warna orange yang lebih banyak dari tabung 1 (++). Pada
pengujian dengan benedict seharusnya semakin banyak konsentrasi enzim maka perubahan warna yang terjadi akan semakin pekat pula disertai endapan yang lebih banyak, namun pada percobaan ini warna yang didapat adalah semakin muda dengan endapan yang lebih sedikit. Perubahan warna yang seharusnya semakin gelap dikarenakan semakin tinggi konsentrasi enzim maka kerja enzim akan meningkat dan amilum akan lebih banyak terhidrolisis oleh enzim menjadi maltose dan glukosa. Hal ini tentu menyebabkan kadar glukosa menjadi banyak sehingga menunjukkan uji positif terhadap benedict. Sedangkan ketika pengujian dengan IKI, hasil percobaan yang diperoleh sudah benar yakni semakin tinggi konsentrasi enzim maka kerja enzim juga akan meningkat dan amilum banyak yang terhidrolisis menjadi maltose dan glukosa , hal ini menyebabkan kadar amilum menurun sehingga menunjukkan uji negative terhadap IKI yakni semakin tinggi konsentrasi enzim warna larutan berubah menjadi semakin muda.
Jadi dapat disimpulkan bahwa konsentrasi enzim mempengaruhi kecepatan reaksi enzimatik. Pengaruh konsentrasi enzim ini yaitu pembentukan produk, dimana makin besar konsentrasi enzim makin banyak pula produk yang dihasilkan sehingga dapat dinyatakan bahwa laju reaksi berbanding lurus dengan konsentrasi enzim. Dengan kata lain, semakin besar volume atau konsentrasi enzim, semakin tinggi pula aktivitas enzim dalam memecah substrat yang dikatalisis. Semakin sedikit enzim yang berperan memecah amilum maka akan semakin banyak amilum yang tidak terhidrolisis. Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut:
Pati (amilum) + Enzim(amilase) → Disakarida (maltosa) → glukosa + glukosa
Kesalahan yang terjadi dalam percobaan ini dikarenakan oleh dalam ketidaktelitian dalam mencampurkan saliva dengan suspensi amilum dengan konsentrasi yang berbeda-beda dan kurangnya ketelitian pada pengamatan perubahan warna yang terjadi.
4. Pengaruh Konsentrasi Substrat
Pada praktikum kali ini, dilakukan pengujian pengaruh pH terhadap kerja enzim amilase. Amilase yang digunakan pada praktikum ini yaitu larutan saliva. Pertama, 1 ml suspensi amilum dimasukkan ke dalam tabung reaksi I, 2 ml amilum ke dalam tabung II, 3 ml amilum ke dalam tabung III, dan 4 ml ke dalam tabung IV, kemudian masing-masing ditambahkan 1 ml saliva dan
dikocok hingga tercampur. Larutan tersebut dibiarkan selama 15 menit. Setelah 15 menit, di uji dengan IKI. Larutan pada tabung I menghasilkan perubahan warna menjadi hijau kekuningan, larutan pada tabung II menjadi kuning tua, larutan pada tabung III menjadi hijau kehitaman, dan larutan pada tabung IV menjadi kuning kehitaman. Dan saat diuji dengan benedict semuanya tidak terjadi perubahan warna, larutan tetap berwarna biru tua. Menurut literatur, dari data uji IKI semakin tinggi konsentrasi substrat, warnanya menjadi semakin memudar atau lebih muda (uji negatif) dan muncul endapan berwarna hitam yang semakin sedikit. Begitu pula dengan uji benedict, seharusnya terjadi perubahan warna dari biru tua menjadi kehijauan atau hijau kekuningan dan semakin banyak konsentrasi substratnya, warna larutan seharusnya semakin gelap. Hal ini dikarenakan semakin tinggi konsentrasi substrat, kerja enzim juga semakin meningkat dan amilum yang terhidrolisis juga semakin banyak. Hal tersebut membuat konsentrasi glukosa menjadi lebih banyak, oleh karena itu warna hasil uji benedict akan semakin gelap seiring bertambahnya konsentrasi substrat. Sehingga, disimpulkan bahwa semakin rendah konsentrasi substrat enzim amilase maka waktu yang diperlukan untuk menghidrolisis amilum semakin lama pula, sehingga pada saat diuji dengan reagen IKI tetap menunjukkan reaksi positif. Seperti dijelaskan oleh Dahlia (2001) bahwa kecepatan reaksi dipengaruhi konsentrasi substrat yang berperan sebagai katalisator dalam reaksi tersebut. Banyaknya substrat ditransformasikan sesuai dengan tingginya konsentrasi enzim yang digunakan.
Hal tersebut diperkuat oleh Michaelis dan kawan-kawannya dalam Dahlia (2001) yang menyatakan bahwa reaksi yang dikatalis oleh enzim pada berbagai konsentrasi substrat mengalami 2 fase, yaitu: (1) jika konsentrasi substrat masih rendah, daerah yang aktif pada enzim tidak semuanya terikat dengan substrat dan (2) jika jumlah molekul substrat meningkat maka daerah yang aktif terikat seluruhnya oleh substrat, dan pada saat ini enzim telah bekerja dengan kapasitas penuh. Sehinggga dapat disimpulkan bahwa kadar atau konsentrasi substrat berpengaruh terhadap kecepatan reaksi atau aktivitas enzim tersebut. Kecepatan reaksi atau aktivitas enzim tersebut berbanding lurus dengan konsentrasi substratnya.