BOGOR
2011
ABSTRAK
NURIDA DESSALMA SYAHRANIA. Pengaruh Penambahan Serum dan atau DNase dalam Medium Disosiasi terhadap Jumlah dan Viabilitas Spermatogonia Ikan gurame (Osphronemous gouramy Lac.) Dibimbing oleh ITA DJUWITA dan
IRMA ANDRIANI
Disosiasi adalah langkah awal yang diperlukan untuk mendapatkan jumlah spermatogonia yang cukup sebagai sel donor untuk transplantasi. Teknik disosiasi dilakukan dengan metode mekanik dan enzimatik untuk mempercepat pemisahan sel dan jaringan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh penambahan serum dan atau DNase pada medium disosiasi terhadap jumlah dan viabilitas spermatogonia. Testes diambil dari ikan gurame yang berukuran 500 sampai 800 gram/ekor dengan bobot gonad 20 mg. Disosiasi dilakukan menggunakan empat medium yang berbeda yaitu menggunakan PBS yang mengandung: (1) tripsin 0.5% (2) tripsin 0.5% + serum 5%, (3) tripsin 0.5% + DNase 10 IU/µL, dan (4) tripsin 0.5% + serum 5% + DNase 10 IU/µL, dengan volume total 500 µ l. Jumlah spermatogonia dihitung setiap jam selama lima jam disosiasi dengan menggunakan hemositometer, dan viabilitas sel diidentifikasi menggunakan pewarna Trypan Blue (TB). Data kuantitatif yang diperoleh dianalisis menggunakan metode analisis General Linier Model (GLM) dan uji lanjut Duncan’s jika terdapat perbedaan nyata. Penambahan serum dalam medium disosiasi tidak menunjukkan pengaruh yang nyata terhadap jumlah rata-rata spermatogonia, namun meningkatkan secara nyata persentase viabilitas spermatogonia. Penambahan DNase maupun kombinasi serum dan DNase mampu menghasilkan rata-rata jumlah spermatogonia dan persentase viabilitas spermatogonia paling tinggi selama disosiasi, dengan jumlah spermatogonia hidup yang meningkat secara nyata setelah disosiasi selama tiga jam untuk penambahan DNase dan dua jam untuk kombinasi serum dan DNase.
ABSTRACT
NURIDA DESSALMA SYAHRANIA. The Influence of Serum and or DNase in Dissociation Medium on the Number and Viability of Giant Gouramy (Osphronemus gouramy Lac.) Spermatogonia. Under direction of ITA
DJUWITA and IRMA ANDRIANI
ABSTRACT
Dissociation is the first step to obtain a sufficient number of spermatogonia as donor cells for transplantation. Dissociation techniques is perfomed by mechanical and enzymatic methods to accelerate the separation of cells and tissue. This study was aimed to determine the effect of serum and or DNase in the dissociation medium on the number and viability of spermatogonia. Testes were taken from giant gouramy (500-800 gram body of weight) with gonad weight 20 mg. Dissociation was performed using four different media that were PBS containing: (1) 0.5% trypsin, (2) 0.5% trypsin+5% serum, (3) 0.5% trypsin+10 IU/µL DNase, and (4) 0.5% trypsin+5% serum+10 IU/µL DNase, with total volume of 500 µL. The number of spermatogonia was calculated every hour during five hours dissociation using hemocytometer, and the percentage of viability were calculated based on Trypan Blue stainning method. Quantitive datas were analyzed using General Linier Model analysis (GLM) and continued by Duncan’s test if there was a significant difference. The addition of serum in the dissociation medium did not significantly affect on the number of spermatogonia, but significantly increased the viability percentage of spermatogonia. The addition of DNase or combination of serum and DNase could produce the highest number and percentage viability of spermatogonia, the number of viable spermatogonia significantly increased after three hours of DNase addition and two hours for the combination of serum and DNase.
RINGKASAN
NURIDA DESSALMA SYAHRANIA. Pengaruh Penambahan Serum dan atau DNase dalam Medium Disosiasi terhadap Jumlah dan Viabilitas Spermatogonia Ikan gurame (Osphronemous gouramy Lac.) Dibimbing oleh ITA DJUWITA dan
IRMA ANDRIANI.
Ikan gurame (Osphronemus gouramy Lac) merupakan salah satu jenis ikan air tawar yang banyak dipilih para petani untuk dipelihara dan dijual karena bernilai ekonomis tinggi. Ikan ini sangat peka terhadap suhu rendah dan memiliki organ pernapasan tambahan sehingga dapat mengambil oksigen dari luar air. Ikan gurame mempunyai kekurangan, pertumbuhannya tidak secepat ikan air tawar lainnya, seperti ikan mas dan ikan lele sehingga membutuhkan waktu dua sampai tiga tahun untuk matang gonad.
Diperlukan teknologi yang bisa mempercepat pematangan gonad pada ikan gurame. Salah satunya melalui pendekatan teknologi rekayasa gamet dengan teknologi transplantasi sel germinal. Teknologi transplantasi sel germinal jantan mampu memberikan peluang besar bagi peningkatan produksi gamet terutama bagi hewan-hewan yang mengalami masalah dalam reproduksinya.
Penggunaan sel germinal jantan (spermatogonia) didasari oleh beberapa faktor di antaranya, jumlah sel germinal spermatogonia lebih banyak dan ditemukan pada setiap fase perkembangan testes. Langkah awal dari pengembangan teknologi transplantasi dan penentu keberhasilan transplantasi sel germinal adalah ketersediaan spermatogonia tunggal. Teknik untuk mendapatkan jumlah spermatogonia tunggal dalam jumlah layak sebagai sel donor untuk transplantasi adalah disosiasi.
Teknik disosiasi dilakukan secara mekanik dan enzimatik untuk mempercepat pemisahan sel dari jaringan. Disosiasi mekanik dilakukan dengan mencacah jaringan sehalus mungkin, namun meminimalkan kerusakan. Teknik selanjutnya secara enzimatik dengan menggunakan enzim-enzim seperti tripsin, kolagenase, dan DNase.
Kombinasi selain menggunakan tripsin dan DNase, ke dalam medium disosiasi dapat ditambahkan serum guna memberikan zat nutrisi yang dibutuhkan oleh sel selama proses disosiasi berlangsung. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh penambahan serum dan atau DNase dalam medium disosiasi terhadap jumlah dan viabilitas spermatogonia.
Medium disosiasi yang digunakan mencakup empat jenis medium yakni, Phosphate Buffered Saline (PBS) yang mengandung: (1) tripsin 0.5% (2) tripsin 0.5% + serum 5%, (3) tripsin 0.5% + DNase 10 IU/µL, dan (4) tripsin 0.5% + serum 5% + DNase 10 IU/µL, dengan total volume 500 µL.
Parameter yang diamati mencakup jumlah dan viabilitas spermatogonia. Viabilitas spermatogonia diidentifikasi menggunakan pewarna Trypan Blue (TB) 0.4%. Data kuantitatif yang diperoleh dianalisis dengan GLM dan uji lanjut Duncan jika terdapat perbedaan nyata (P<0.05).
Hasil penelitian menunjukkan jumlah spermatogonia yang meningkat, namun viabilitas spermatogonia menurun seiiring lamanya disosiasi. Penambahan serum dalam medium disosiasi tidak menunjukkan pengaruh yang nyata terhadap jumlah rata-rata spermatogonia dan spermatogonia hidup, tetapi mampu
meningkatkan persentase viabilitas spermatogonia, sedangkan penambahan DNase maupun kombinasi serum dan DNase mampu menghasilkan rata-rata jumlah spermatogonia dan persentase viabilitas spermatogonia yang lebih tinggi selama disosiasi, dengan jumlah spermatogonia hidup yang meningkat secara nyata seiiring lamanya disosiasi selama tiga jam untuk penambahan DNase dan dua jam untuk kombinasi serum dan DNase. Oleh karena itu, waktu optimum disosiasi untuk medium yang dikombinasikan dengan serum dan DNase selama dua jam, sedangkan pada medium yang hanya ditambahkan dengan DNase selama tiga jam.
Enzim proteolitik seperti tripsin mampu memisahkan ikatan-ikatan dan menghasilkan suspensi sel tunggal dan membantu pemisahan sel dari jaringan. Penambahan DNase mampu mencegah terjadinya penggumpalan kembali sel-sel dan mampu mengurangi viskositas suspensi sel. Adanya pengaruh interaksi jumlah dan viabilitas spermatogonia antara medium dan waktu inkubasi pada pengujian faktorial, menunjukkan bahwa kedua faktor tersebut saling mempengaruhi terhadap jumlah dan viabilitas spermatogonia.