TINJAUAN PUSTAKA
2.4 Fermentasi Vitamin C
Metode untuk mendapatkan vitamin C secara sintesis dengan urutan langkah yang diperlukan dengan bantuan mikroba. Perkembangan vitamin C dianggap penting sekali. Isolasi kristalin asam askorbat pada tahun 1928 dilakukan oleh Szent-Gyorgyi yang dilanjutkan dengan identifikasi vitamin C oleh Waugh dan King serta Svirbely dan Szent-Gyorgyi pada tahun 1932.
Vitamin C pertama kali diperoleh secara sintetis. Berbagai jenis sintetis vitamin C diklasifikasikan menjadi empat metoda yang terpenting.
Metoda pertama dimana secara industri meliputi konversi D-glukosa menjadi asam askorbat atau vitamin C. Langkah dari metoda tersebut meliputi oksidasi mikrobiologi dari gugus hidroksil kedua 2,3,4,6-diisopropylidene derivative menjadi gugus karbonil L-ascorbic acid (Vitamin C). Konfigurasi lanjutan yang penting adalah L-sorbose, suatu senyawa gula yang jarang ditemukan. L-Sorbose dihasilkan dalam skala besar dari D-glucitol (sorbitol) dengan pertumbuhan Acetobacter suboxydans. Penggunaan 15% larutan sorbitol, dihasilkan L-sorbose sebesar 93% setelah difermentasi selama 24 jam dari waktu inokulasi yang ditemukan oleh Wells, Stubbs, Lockwood, dan Roe.
Sorbitol ditemukan secara umum dalam skala besar dengan cara hidrogenasi katalitik dari D-glukosa. Laporan pertama tentang oksidasi D-sorbitol menjadi L- sorbosa oleh enzim yang dihasilkan oleh bakteri yang ditemukan Bertrand pada tahun 1896. Bakteri tersebut diidentifikasi dengan bakteri Acetobacter xylinum.
D-glucose D-glucitol (D-sorbitol) L-sorbose
2,3,4,6-diisopropylidene derivative
2,3,4,6-diisopropylidene-2-keto-L-gulonic acid
L-ascorbic acid (Vitamin C)
Untuk menyelesaikan sintetis tersebut, L-sorbosa diubah menjadi derivat 2,3,4,6- diisopropilidena. Gugus hidroksil pertama derivat tersebut dioksidasi oleh ion permanganat dalam larutan alkali menghasilkan asam 2,3,4,6-diisopropilidena-2-keto- L-gulonat berdasarkan Reichstein dan Grussner. Asam 2-keto-L-gulonat atau derivat diisopropilidena diubah menjadi asam L-askorbat dengan bermacam teknik untuk mendapatkan hasil sempurna (Robinson, 1976).
Pada tahun 1953 dibuat beberapa studi dimana proses fermentasi vitamin C dengan bantuan mikroorganisme hanya terjadi dalam 2 langkah. Hori dan Nakatani mengubah glukosa oleh Acetobacter suboxydans menjadi asam 5-keto-D-glukonat, yang selanjutnya oleh bantuan katalis enzim dirubah menjadi asam L-idonat. Fermentasi dengan Pseudomonas, Acetobacter, atau Aerobacter inversi senyawa akhir menjadi asam 2-keto-L-gulonat, yaitu suatu senyawa antara (intermediat) yang lazim dikenal menjadi asam L-askorbat (Hori, 1953).
Pada tahun 1990, Boudrant menyatakan bahwa dengan menggunakan metode Reichstein dan glukosa sebagai substrat, pembentukan asam askorbat dengan metode
fermentasi hanya berlangsung dengan 5 tahap reaksi sebagai berikut : reduksi glukosa menjadi sorbitol dengan menggunakan katalis nikel; oksidasi L-sorbitol menjadi L- sorbosa; hasil diaseton sorbosa atau 2,3:4,6-diisopropilidena-L-xylo-2-heksofuranosa setelah perlakuan dengan aseton dan asam sulfat; oksidasi 2,3,4,6-diisopropilidena-L- xylo-2-heksofuranosa menjadi asam 2-keto-L-gulonat dengan menggunakan katalis platinium; enolisasi dan laktonisasi internal asam 2-keto-L-gulonat menjadi asam L- askorbat.
Asam L-askorbat seperti jalur di bawah ini :
Pada zaman sekarang, ditemukan ada enam proses fermentasi bakteri untuk menghasilkan vitamin C. Semua proses tersebut memperlihatkan prekursor langsung dari asam L-askorbat, asam 2-keto-L-gulonat, dimana dinamakan asam 2-keto-L- idonat. Perbedaan keenam jalur ini ditandai dari senyawa intermediat yang terbentuk selama proses fermentasi.
Keenam jalur tersebut dapat dilihat sebagai berikut : 1.Jalur Sorbitol
2.Jalur asam L-idonat 3.Jalur asam L-gulonat
4.Jalur asam 2-keto-D-glukonat 5.Jalur asam 2,5-diketo-D-glukonat 6.Jalur asam 2-keto-L-gulonat
Diagram jalur biosintesis vitamin C oleh berbagai jenis mikroorganisme :
(Boudrant, 1990).
1. Jalur Sorbitol
Biosintesis ini dinyatakan pertama kali oleh Motizuki. Sorbitol ditransformasikan dengan cara fermentasi menjadi asam 2-keto-L-gulonat. Transformasi diperoleh dari beberapa genus Pseudomonas dan Acetobacter, tetapi jenis metabolisme ini belum dikenal secara umum.
Hasil transformasi dari sorbitol menjadi asam 2-keto-gulonat tidak melampaui 10%, walaupun hasil 70% dicatat dari Acetobacter cerenusote. Selain asam 2-keto-L- gulonat, produk lain juga terbentuk. Okazaki menyarankan jalur biosintesis sebagai berikut :
Sorbitol
L-sorbose
L-idose
L-idonic acid
2-keto-L-gulonic acid
2. Jalur asam L-idonat
Biosintesis menggunakan asam L-idonat sebagai zat antara adalah transformasi multistep. Metabolisme multistep dikenal adalah asam D-glukonat, asam 5-keto-D- glukonat, asam L-idonat, dan asam 2-keto-L-idonat.
Oksidasi pertama, transformasi D-glukosa menjadi asam D-glukonat, tidak dijelaskan secara terperinci.
3. Jalur asam L-gulonat
Jalur asam L-gulonat terdapat pada jalur L-idonat yang meliputi dua langkah (oksidasi asam D-glukonat dan reduksi asam 5-keto-D-glukonat). Tetapi reaksi ini berkembang menjadi asam L-gulonat, prekursor asam 2-keto-D-idonat. Oksidasi asam L-gulonat disampaikan oleh Kita. Menurut Kita, transformasi asam 5-keto-D-glukonat dapat dihasilkan dengan menggunakan Xanthomonas transluscens, dengan hasil 90% dan konsentrasi 100 g L-1, atau Xanthomonas trifolii (Erwinia lahyri).
4. Jalur asam 2-keto-D-glukonat Ada tiga langkah pada jalur ini : 1.Oksidasi asam D-glukonat
Kebanyakan akan mentransformasi D-glukosa menjadi asam D-glukonat dengan menggunakan jalur ini. Transformasi D-glukosa menjadi asam 2,5-diketo- gulonat yang diidentifikasikan oleh Katznelson dalam Acetobacter melanogenum
dan Pseudomonas albosesamae.
Dikenal bahwa Acetobacter suboxydans, untuk sintesis asam 5-keto-D-glukonat dari asam D-glukonat, dapat mensintesis asam 2-keto-D-glukonat.
Pada tahun 1982, Sonoyama menjelaskan kemampuan pertama kali Erwinia spp, untuk akumulasi asam D-glukonat dan asam 2-keto-D-glukonat.
2.Oksidasi asam 2-keto-D-glukonat
Oksidasi ini diselesaikan oleh Bacterium hoshigaki dan Bacterium glucunicum
dengan produk asam 2,5-D-diketo-D-glukonat. Juga dibiosintesis oleh
Acetobacter spp khususnya Acetobacter melanogenum. Ilustrasi biokonversi glukosa dengan asam D-glukonat dan asam 2-keto-D-glukonat sebagai zat antara. Proses transformasi langsung D-glukosa menjadi asam 2,5-diketo-D-glukonat menggunakan Acetobacter fragum atau Acetomonas albosesamae yang diumumkan secara luas.
3.Reduksi asam 2,5-diketo-D-glukonat
Pada tahun 1975, Sonoyama menjelaskan proses yang menghasilkan asam 2- keto-D-gulonat dari asam 2,5-diketo-D-glukonat, dapat dilakukan oleh genus
Brevibacterium, Arthrobacter, Micrococcus, Staphylococcus, Pseudomonas, dan
Bacillus. Dengan Brevibacterium ketosporum, hasilnya mencapai 15% ketika konsentrasi substrat 50 g L-1. Dengan mikroorganisme lain, hasilnya tidak lebih dari 1%. Penggunaan Corynebacterium sejak tahun 1976, pertama kali
menghasilkan hasil produk asam 2-keto-L-gulonat sekitar 10%. Pada masa kini, diperoleh hasil mendekati 80%. Proses lain juga dijelaskan dengan menggunakan
Citrobacter. Dapat dikatalisis hanya dengan transformasi asam 2,5-diketo-D- gulonat, dan permulaan digunakan Acetobacter cerenus. Dengan beberapa mikroorganisme, hasilnya sekitar 30%, dengan konsentrasi substrat 100 g L-1.
5.Jalur asam 2.5-diketo-D-glukonat
Proses produksi asam 2,5-diketo-D-glukonat pada langkah utama. Genus
Erwinia dijelaskan pada transformasi ini. Dijelaskan bahwa konsentrasi glukosa 200 g L-1
Proses fermentasi dengan menggunakan Acetobacter cerenus memberikan hasil sekitar 90%.
dan waktu fermentasi 20 jam yang memberikan hasil sekitar 75%.
6.Jalur asam 2-keto-L-gulonat
Jalur ini rupanya terjadi secara langsung, dan menghasilkan asam 2-keto-L- gulonat, prekursor langsung asam L-askorbat dari glukosa. Jalur ini kemungkinan terjadi dengan pengembangan yang baru.
Beberapa diantaranya :
1.Kultur tingkat kedua atau campuran 2.Seleksi mutan
3.Isolasi reduksi asam 2,5-diketo-D-glukonat pada Corynebacterium
4.Transfer gen reduksi asam 2,5-diketo-D-glukonat pada Corynebacterium dan
Erwinia (Boudrant, 1990).
Hancock menyatakan bahwa dengan menggunakan Saccharomyces cerevisiae
dan substrat L-galaktosa, L-galaktono-1,4-lakton dan L-gulono-1,4-lakton akan dihasilkan asam askorbat sedangkan bila menggunakan substrat D-glukosa, D- galaktosa atau D-manosa akan dihasilkan asam D-erithroaskorbat (Hancock, 2000).
Running menyatakan bahwa fermentasi aerobik dan pemilihan strain yang tepat akan dihasilkan asam askorbat ekstraseluler sebesar 76 mg/L. Dengan mutagen klasik dan metoda seleksi, kami menciptakan mutan Prototheca moriformis ATCC 75669 yang menghasilkan kuantitas asam askorbat terbesar daripada strain tipe alamiah (78,4 vs 21,9 mg AA/g sel) (Running, 2002).
Rewatkar menyatakan bahwa dengan menggunakan 5 gram sorbitol; 0,5 gram ekstrak yeast dan 2 gram agar yang dilarutkan dalam 100 mL H2
Salah satu aspek yang penting dari proses-proses fermentasi adalah cara pemanenan dan memurnikan hasil produk fermentasi atau bioproduk. Proses ini dikenal dengan proses hilir (Kroner, 1984).
O setelah difermentasi selama 7 hari oleh Acetobacter suboxydans akan diperoleh sebanyak 4,997 mg/L (6,2213%) asam askorbat. Dengan cara yang sama tetapi menggunakan bakteri
Pseudomonas aeruginosa akan dihasilkan 3,217 mg/L (4,0213%). Sedangkan bila digunakan Saccharomyces cerevisiae akan dihasilkan 1,882 mg/L (2,3525%) asam askorbat (Rewatkar, 2010).