Untuk mengetahui sisi aktif dari protein DNA gyrase subunit B maka
dilakukan visualisasi protein target secara tiga dimensi melalui aplikasi
Discovery Studio Visualizer. Hasil visualisasi ditunjukan pada gambar 9.
Gambar 9. Visualisasi sisi aktif protein DNA gyrase
subunit B (3TTZ) 2. Visualisasi Ligan dengan Marvin Sketch
Ligan yang digunakan untuk sampel uji penambatan molekul adalah senyawa-senyawa seskuiterpen yang memiliki aktivitas antibakteri yang signifikan. Berdasarkan hasil uji aktivitas antibakteri diketahui pada konsentrasi minyak atsiri mulai 10% hingga 80% pertumbuhan bakteri
Shigella flexneri. Pada Analisis GC-MS diketahui bahwa minyak atsiri buah
kemukus memiliki kandungan senyawa seskuiterpen seperti mengandung
alpha-cubebene, copaene, germacrene-D, 1H-cycloprop[e]azulene, dan spathulanol. Dalam uji ini sebagai pembanding digunakan Ciprofloxacin.
Tabel 3. Visualisasi ligan menggunakan Marvin Sketch
Nama Ligan Visualisasi
2-[(3S,4R)-4-{[(3,4- dichloro-5-methyl- 1H- pyrrol-2- yl)carbonyl]amino}- 3-fluoropiperidin- 1-yl]-1,3-thiazole-5- carboxylic acid Ciprofloxacin alpha cubebene copaene germacrene-D 1H- cycloprop[e]azulene
spathulanol
3. Interaksi Ligan terhadap Protein Target Visualisasi
Hasil penambatanantara ligan dan protein target akan menghasilkan 9 konformasi yang berisi informasi energi dari masing-masing konformasi. Hal yang perlu diperhatikan dalam analisis hasil docking adalah melalui
energi ikatan (binding energy). Konformasi terbaik dapat dilihat melalui
fungsi scoring yang ditunjukan dalam energi ikatan atau binding energy (ΔG) yang memiliki satuan dalam Kkal/mol. Nilai energi ikatan menggambarkan kekuatan ikatan yang terjadi antara ligan dan protein target.
Energi ikatan memiliki hubungan dengan konstanta inhibisi. Semakin kecil nilai konstanta inhibisi maka akan semakin kecil pula energi ikatan. Dari hal itu diketahui bahwa semakin kecil energi ikatan antara konstanta inhibisi, maka interaksi antara ligan dan enzim akan semakin disukai (Prasetia, 2011). Hasil skor penambatan molekul setiap konformasi setiap ligan terhadap protein target dapat dilihat pada lampiran 10. Sedangkan nilai energi ikatan dan konstanta inhibisi terbaik serta interaksi antara masing- masing ligan dengan protein target dapat dilihat pada tabel 4.
Tabel 4. Interaksi Ligan dengan Protein target
Ligan Energi Ikatan
(Kkal/mol)
Protein
1H-
cycloprop[e]azulene
-7,3 ILE 86, ILE102, ILE175
Ciprofloxacin -7,1 ASP81, GLU58, PRO87, GLY85,
ARG84, ARG44, THR173
alpha-cubebene -6,7 LEU205
germacrene-D -6,7 ASN54, SER55, VAL79, GLU 58,
ASP54
Copaene -6,4 ILE86, ILE175
2-[(3S,4R)-4-{[(3,4- dichloro-5-methyl- 1H- pyrrol-2- yl)carbonyl]amino}- 3-fluoropiperidin- 1-yl]-1,3-thiazole-5- carboxylic acid
-6,2 ILE51, ILE 86, ILE 102, ILE175, SER55, ASN54
Spathulanol -6,2 ILE86, PRO87
Berdasarkan tabel 4 senyawa yang memiliki energi ikatan paling tinggi adalah 1H-cycloprop[e]azulene dengan energi ikatan sebesar -7,3
Kkal/mol dan mengikat residu dari protein target yaitu Isoleusin 86 (ILE86), Isoleusin 102(ILE102), Isoleusin 175 (ILE175). Residu ligan asli antara lain Isoleusin 51 (ILE51), Isoleusin 86 (ILE 86), Isoleusin 102 (ILE102), Isoleusin 175 (ILE175), Serin 55 (SER55), Asparginin 54 (ASN54) Residu ligan Ciprofloxacin (kontrol positif) antara lain Aspartic acid ke 81
(ASP81), Glutamic Acid 58 (GLU58), Prolin 58 (PRO87), Glisin 85 (GLY85), Arginin 84 (ARG84), Arginin 144 (ARG144) dan Threonine 173 (THR173). Hasil Visualisasi ditunjukan pada Gambar 10.
(a)
(c) (b)
Gambar 10. Hasil Visualisasi (a) Ligan Asli, (b) Ciprofloxacin dan
G. Pembahasan
Kemukus merupakan salah satu tanaman yang mengandung terpenoid yang merupakan metabolit sekunder pada tanaman yang memiliki efek farmakologis seperti antivirus, antibakteri, antimalaria, antiradang, penghambat sintesis kolesterol dan anti kanker (Nassar & Abdalrahim, 2010). Metode Kirby Bauer digunakan untuk menentukan sensitifitas
bakteri terhadap antibakteri. Dalam penelitian ini digunakan media Mac Conkey dan menggunakan BHI (brain heart infusion) sebagai nutrien.
Penggunaan Mac Conkey sebagai media dipilih karena media ini spesifik untuk bakteri gram negatif. Dalam metode ini digunakan cakram kertas untuk mengaplikasikan agen antibakteri. Cakram kertas yang telah diaplikasikan dengan masing-masing sampel selanjutnya akan menyerap masing-masing konsentrasi larutan uji. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan variasi konsentrasi bertujuan untuk mengetahui perbedaan nilai DZI antar konsentrasi. Nilai DZI dapat diinterpretasikan untuk mengetahui KHM konsentrasi minyak atsiri. KHM berfungsi untuk mengetahui konsentrasi minimal minyak atsiri yang dapat menghambat pertumbuhan Shigella flexneri. Konsentrasi yang digunakan adalah 10%,
20%, 40%, 80%.
Dalam penelitian aktivitas antibakteri ini digunakan kontrol positif
Ciprofloxacin dan kontrol negatif n-heksana. Kontrol positif digunakan
sebagai pembanding aktivitas antibakteri dengan antibiotik yang digunakan masyarakat. Sedangkan kontrol negatif berfungsi untuk mengetahui apakah
pelarut memiliki efek antibakteri atau tidak. Penggunaan Ciprofloxacin
sebagai kontrol positif disamping karena merupakan terapi lini pertama pada pengobatan diare basiler juga dikarenakan ciprofloxacin dan anti
bakteri minyak atsiri buah kemukus memiliki kesamaan mekanisme yaitu menghambat pertumbuhan DNA.
Hasil penelitian membuktikan bahwa masing-masing konsentrasi mulai dari konsentrasi 10% memiliki aktivitas antibakteri. Menurut CLSI menunjukan antibiotik Ciprofloxacin senstitif terhadap bakteri keluarga Enterobacteriaceae apabila memiliki DZI >21 mm. Berdasarkan data yang
didapat diketahui Ciprofloxacin masih sensitif terhadap bakteri Shigella flexnery. Nilai DZI masing-masing konsentrasi masuk kategori resisten
karena memiliki DZI<15mm berdasarkan hal tersebut diketahui bahwa kekuatan penghambatan masing-masing konsentrasi masih lebih rendah dari Ciprofloxacin yang merupakan kontrol positif.
Uji identifikasi dilakukan secera GC-MS analisis GC digunakan kolom AGILENTJ%W DB-1 yang merupakan kolom yang bersifat nonpolar. Fase diam nonpolar digunakan karena sampel yang digunakan adalah minyak atsiri yang bersifat nonpolar. Berdasarkan hasil identifikasi GC-MS ini minyak atsiri buah kemukus mengandung 5 senyawa tertinggi yaitu alpha-cubebene, copaene, germacrene-D, 1H-cycloprop[e]azulene,
dan spathulanol yang merupakan senyawa terpenoid. Mekanisme
molekuler senyawa tersebut diteliti dengan uji in silico menggunakan molecular docking. Aplikasi yang digunakan dalam pengujian in silico
adalah Autodock Vina. Protein yang digunakan adalah DNA gyrase. Ligan
yang digunakan dalam uji adalah alpha-cubebene, copaene, germacrene-D, 1H-cycloprop[e]azulene, dan spathulanol. Berdasarkan uji tersebut
senyawa yang diuji memiliki afinitas terhadap protein target. Senyawa 1H- cycloprop[e]azulene dalam minyak atsiri buah kemukus memiliki afinitas
terbaik dan memiliki aktifitas yang sama dengan antibiotik Ciprofloxacin
yaitu menghambat protein DNA gyrase.Dalam minyak atsiri buah kemukus Piper cubeba L.f., senyawa 1H-cycloprop[e]azulen merupakan salah satu
dari 5 senyawa dengan kelimpahan tertinggi dan juga merupakan senyawa yang paling potensial memiliki aktifitas penghambatan terhadap bakteri
Shigella flexneri dengan nilai energi ikatan -7,3 Kkal/mol. Hal ini
dikarenakan senyawa tersebut memiliki energi ikatan paling tinggi dan memiliki residu yang sama dengan ligan asli yaitu Isoleusin 86 (ILE86), Isoleusin 102 (ILE102), Isoleusin 175 (ILE175).
52 A. Kesimpulan
1. Senyawa penyusun utama minyak atsiri buah kemukus berdasarkan 5 puncak tertinggi Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS) yaitu alpha cubebene, copaene, germacrene D, 1H-cycloprop[e]azulene dan spatulanol.
2. Kadar Hambat Minimum minyak atsiri buah kemukus (Piper cubeba L.f.)
yang diperlukan untuk menghambat bakteri Shigella flexneri adalah 10%.
Nilai rata-rata DZI (Diameter Zona Inhibisi) yang diperoleh dari masing- masing konsentrasi minyak atsiri buah kemukus (Piper cubeba L.f.) yang
dapat menghambat bakteri Shigella flexneri adalah pada konsentrasi 10%
adalah 8 mm; konsentrasi 20% adalah 8,5 mm; konsentrasi 40% adalah 9,5 mm; konsentrasi 80% adalah 11 mm.
3. Senyawa dominan buah kemukus 1H-cycloprop[e]azulene memiliki
afinitas paling tinggi terhadap protein DNA gyrase pada bakteri Shigella flexneri secara in silico dengan nilai energi ikatan -7,3 kkal /mol.
B. Saran
1. Diperlukan penelitian yang lebih mendalam hingga tahap isolasi sehingga diperoleh isolat yang dapat spesifik menghambat bakteri Shigella flexneri.
2. Diperlukan uji aktivitas antibakteri minyak atsiri buah kemukus terhadap bakteri lain seperti pada jenis bakteri gram positif atau gram negatif lainnya.
54
http://www.merckmanuals.com/professional/infectious-disease/gram- negative_bacilli/shigellosis.html
Castellani, A., Chalmers, A.J. (1919). Manual of Tropical Medicine, 3rd ed.
Williams, Wood and Co., New York. P.937.
CDC. (2011). Shigellosis. Diakses 9 Mei, 2016, from
http://www.cdc.gov/ncezid/dfwed/PDFs/Shigella-Overview-508.pdf Chusin & Lamb, 2005, Antimicrobial activity of flavonoids, International Journal
of Antimicrobial Agents, (26): 343–356.
Crawford Scientific. (2015). Fundamental GC-MS Introduction. CHROMacademy , e-learning for the analytical chemistry community. Diakses 30 Juni 2015. http://www.chromacademy.com/resolver-
november2010_understanding_gcms_part_1.html
Departemen Kesehatan RI. (2008). Farmakope Herbal Indonesia. Edisi 1. Jakarta
Departemen Kesehatan RI. (2008). Pusat Penyuluhan Kesehatan Masyarakat.
Depkes :Jakarta.
Depkes. Laporan riset kesehatan dasar 2010. (2010). Jakarta: Badan Penelitian dan
Pengembangan Kesehatan Kementrian Kesehatan Republik Indonesia.. Dipiro, J.T., Talbert, R.L., Yee, G.C., Matzke, G.R., Wells, B.G., Posey, L.M.
(2008). Pharmacotherapy : A Pathophysiologic Approach. 17th Ed. Mc
Graw Hill p.2038
Douglas, F. (2015). GC/MS analysis. Scientific Testimony, an online journal Ditjen POM. (2000). Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Cetakan
Pertama. Depkes RI. Jakarta.
Erickson Jon A., Mehran Jalaie, Daniel H. Robertson, Richard A. Lewis, dan Michal Vieth. (2004). Lessons in Molecular Recognition: The Effects of Ligand and Protein Flexibility on Molecular Docking Accuracy. J. Med.
FDA, (2009). Updating Labeling for Susceptibility Test Information in Systemic Antibacterial Drug Products and Antimicrobial Susceptibility Testing Devices. Rockville
Ganiswara, Sulistia G. (1995). Farmakologi dan Terapi edisi 4. Jakarta: Gaya Baru
p.586.
Harborne, J.B., (1987). Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis
Tumbuhan. Penerbit ITB Bandung. Bandung p.5
Heyne, K. (1987). Tumbuhan Berguna Indonesia. Jilid 2. Badan Litbang
Kehutanan, penerjemah. Jakarta: Yayasan Sarana Wana Jaya. Terjemahan dari: De Nuttige Planten van Indonesie.
Hudzicki, J. (2009). Kirby Bauer Disk Diffusion Susceptibility Test, [Protocol].
American Society of Microbiology.
Ismail, D., Sutrisno, R., Manginah, P., Retnohastuti. (1997). Pengertian sikap dan Perilaku Masyarakat terhadap Diare. Kumpulan Naskah PITV, BKGAI
(Badan Koordinasi Gastro Internologi Anak Indonesia).
Irianingsih, E. (2004). Uji Aktivitas Antimikroba Minyak Atsiri Buah Kemukus (Piper cubeba, L.f.) terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923, Shigella dysentriae, dan Candida albicans secara in vitro serta pemeriksaan
kandungannya dengan GC-MS. [Skripsi].
Jaghoori M.M., Bleijlevens B., Olabarriaga S.D. 1001 Ways to run AutoDock Vina for virtual screening. J Comput Aided Mol Des (2016) 30:238
Japan Electron Optics Laboratory (JEOL). (2006). Mass Spectrometers: a short explanation fot the absolute novice USA
Juffrie, M., Soenarto S.S.Y, Oswary H, Arief S, Rosalina I, Mulyani N.S. (2010).
Gastroenterohepatologi. Jakarta: Badan Penerbit IDAI., p. 87.
Jawetz, E., Joseph, M., Edward, A., A., Geo, F., B., Janet, S., B., dan Nicholas L., O. (2001). Mikrobiologi Kedokteran. Edisi I. Penerjemah: Mudihardi, E.,
Kuntaman, Waito, E., B., Mertamiasih, M., Harsono, S., Alimsardjono, L. Jakarta: Penerbit Salemba Medika. p. 235.
Ketaren. (1987). Minyak Atsiri, UI Press, terjemahan: Guenther. E., 1947. Essential Oils, Vol 1, John Willey and Sons, New York, p.21- 25, 90, 132 – 134, 244- 245.
Komariah, L., N., Ramdja,A,F., Leonard,Nicky., (2009). Tinjauan Teoritis Perancangan Kolom Destilasi Untuk Pra-Rencana Pabrik Skala Industri,
Jurnal Teknik Kimia, 4:(16),. Palembang
Kroemer, R.T., (2007). Structur-Based Drug Design: Docking and Scoring. Current Protein and Peptide Science; p. 8, 312-328.
Lucchini, S, Liu H, Jin Q, Hinton JCD, Yu J, (2005). Transcriptional Adaptation of Shigella flexneri during Infection of Macrophages and Epithelial Cells: Insights into the Strategies of a Cytosolic Bacterial Pathogen. Infection and Immunity. 73(1); p. 88-102.
Marians, K.J., Hiasa,H. (1997). Mechanism of Quinolone ActionA Drug-Induced Structural Perturbation Of The DNA Precedes Strand Clavage By Topoisomerase IV. 272(14).
Mohanasundaram, J. and S. Mohanasundaram. (2001). Effect of duration of treatment on ciprofloxacin induced arthropathy in young rats. Indian
Journal of Pharmacology. p.100-103.
Morris, G., Huey R., Lindstrom W. (2009) AutoDock4 and AutoDockTools4: automated docking with selective receptor flexibility. J Comput Chem 30(16):2785–2791
Motiejunas, D., Wade R., (2006). Structural, Energetics, and Dinamic Aspects of Ligand-Reseptor Interactions.
Murti, Y. C. 2007. Antibakteri Minyak Buah Kemukus (Piper cubeba L.f.) terhadap Escherichia coli dan kesetaraannya dibandingkan kloramfenikol serta profil
KLT minyak atsirinya. [Skripsi]. p.iv
Nassar, Z., Abdalrahim, Amin M.S. 2010. The Parmalogical Properties of terpenoid from Sandoricum Koetjape. Journal Medcentral. p.1-11
Nelson, Waldo E., (2000). Ilmu Kesehatan Anak Vol.2 Edisi 15 : Shigellosis, Jakarta : EGC p.30.
Olonisakun, A., Oladimeji, M, O., Lajide, L. (2006). Chemical Composition And Antibacterial Activity of Stem Distilled Oil of Ashanti Pepper (Piper guineense) fruits (Berries). Electronic Journal of Eksperimental, Agricultural, and Food Chemistry.5(5). p.1531-1535
Padmawinata, K., dan Sudiro, I., (1987). Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, ITB, Bandung Terjemahan:
Phytochemical Methods, Harbone, J.B., 1973, Chapman and Hall 1 td, London.
Pelczar, M,J., Chan. E. C. S, Pelczer, M. F., Penerjemah: Hadioetomo, R, S. (1986).
Dasar-dasar Mikrobiologi,Jilid I. Penerbit Universitas Indonesia. Jakarta
PLANTAMOR. (2012). Kemukus Piper cubeba L.f. Diakses 21 Mei, 2015, dari
http://www.plantamor.com/index.php?plant=1009
Prasetia, T. (2011). Simulasi Dinamika Molekul Kompleks Histone Deacetylase (HDAC) Kelas II Homo Sapiens dengan Suberoylanilide Hidroczamid Acid (SAHA) dan Turunannya sebagai Inhibitor Kanker Serviks. [Skripsi],
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia, Depok.
Pratiwi, S.T., (2008). Mikrobiologi Farmasi.Yogyakarta . Erlangga Medical Series
p.190
Rizvi, S.M.D., Shakil,S., I, (2004). Persepsi Masyarakat Terhadap Penyakit Shigella (Disentri) di Jakarta Utara. Media Litbang kesehatan. XIV(3): 1.
Sarro, A.D. and G.D. Sarro. (2001). Adverse Reactions to Fluoroquinolones. An
Overview on Mechanism Aspects. Haneef, M. (2013). A Simple Click by Click Protocil to perform Docking : Autodock 4.2 Made Easy
Santoso S.S, Gotama IBI, Waluyo. (2004). Current Medicinal Chemistry. 8 : 371-
384.
Sastroamidjojo, H. (1991). Kromatografi Edisi Kedua, 40-82, Penerbit Liberty,
Yogyakarta
Senthilkumar, A. dan Venketesalu, V, (2009). Phytochemical analysis and antibacterial activity of the essential oil of Clausena anisata L.
willd.Hook.F ex. Benth. International Journal of integrative Biology Vol 5
No 2.
Soewondo ES. (2002). Penatalaksanaan diare akut akibat infeksi (Infectious Diarrhoea). Dalam : Suharto, Hadi U, Nasronudin, editor. Seri Penyakit
Tropik Infeksi Perkembangan Terkini Dalam Pengelolaan Beberapa penyakit Tropik Infeksi. Surabaya : Airlangga University Press, 34 – 40. Solihah, A. (2008). Isolasi Uji Aktivitas Antibakteri Minyak Atsiri Umbi Teki
(Cyperus rotundus L.) dari Daerah Kertasura Sukoharjo. [Skripsi] FMIPA
UNS.
Sudarsono,Pudjoarinto,A., Gunawan,.,Wahyuono,S., Donatus,I.A., Dradjad,M., Wibowo,S S., Ngatidjan, (1996). Tumbuhan Obat Hasil Penelitian,Sifat- Sifat dan Penggunaannya, Pusat Penelitian Obat Tradisional, Universitas
Gadjah Mada Yogyakarta
Sureshbabu, J. (2016). Shigella Infection. Diakses tanggal 8 Juli 2016 http://emedicine.medscape.com/article/968773-overview#a5
Tjitrosoepomo, G. (1994). Taksonomi Tumbuhan Obat-Obatan. Cetakan I. Gajah Mada university Press. Yogyakarta
Watson, David G. (1994). Analisis Farmasi. Jakarta: Penerbit EGC p.223.
Yuksel, Ucan, Uckun Sait., Kartal Murat., Altun, M.L., Aslan, S., Sayar, E., Ceyhan, T. (2006). GC-MS Analysis and Antibacterial Activity of Cultivated Satureja cunneifolia Ten. Essential Oil.Turkey Journal Chemistry 30,p.153-
259.
Zein,Umar. (2004). Diare Akut Disebabkan Bakteri. Diakses tanggal 26 Oktober
Lampiran 2. Tabel Hasil Uji Aktivitas dan Grafik Diameter Zona Inhibisi