Disusun untuk memenuhi Sebagian Syarat Memperoleh Derajat Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
Universitas Muhammadiyah Yogyakarta
Disusun Oleh : TRI HANDRIANTO
20120350044
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH YOGYAKARTA
i
SHIGELLA FLEXNERI
Disusun untuk memenuhi Sebagian Syarat Memperoleh Derajat Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
Universitas Muhammadiyah Yogyakarta
Disusun Oleh : TRI HANDRIANTO
20120350044
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH YOGYAKARTA
ii Nama : Tri Handrianto
NIM : 2012 035 0044
Program Studi : Farmasi
Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
Menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa Karya Tulis Ilmiah yang
saya tulis benar-benar merupakan hasil karya saya sendiri dan belum diajukan
dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi berasal
atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain
telah disebutkan dalam teks dan tercantumkan nama dalam Daftar Pustaka bagian
akhir Karya Tulis Ilmiah ini.
Apabila di kemudian hari terbukti atau dibuktikan Karya Tulis Ilmiah ini
hasil jiplakan, maka saya bersedia menerima sanksi atas perbuatan tersebut.
Yogyakarta, 21 Desember 2016
Yang membuat pernyataan
Tri Handrianto
iii
Dan hendaklah diantara kamu ada segolongan orang yang menyeru kepada
kebajikan, menyuruh berbuat kepada yang ma’ruf, dan mencegah dari yang
mungkar. Dan mereka itulah orang-orang yang beruntung.
(QS. Ali Imran 104)
Sebaik-baiknya manusia adalah yang berguna bagi orang lain. Pengabdian bukan
pengorbanan tapi kehormatan. Pengabdian adalah persembahan dari hati yang tak
pernah mati.
PERSEMBAHAN
Karya tulis ini penulis persembahkan untuk :
Kedua orangtuaku tercinta, Bapak Kasmo dan Ibu Sri Andari AMK.,S.Pd,;
Saudara ku Mas Prasetyo Utomo, S.E dan Mas Aris Prabowo, S.Sn;
Semua sahabat dan rekan seperjuangan menimba ilmu;
Guru-guru saya sejak Taman Kanak-kanak hingga Perguruan Tinggi;
iv
berjudul “Uji Aktivitas Anti Bakteri Minyak Atsiri Buah Kemukus (Piper cubeba L.f.) Secara In Vitro dan In Silico pada Bakteri Shigella flexneri”.
Meskipun banyak hambatan yang penulis alami dalam proses pengerjaannya, akhirnya karya tulis ilmiah ini dapat penulis selesaikan tepat pada waktunya.
Penyusunan Karya Tulis Ilmiah ini tidak terlepas dari bantuan berbagai pihak, maka dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terimakasih kepada :
1. Bapak dr. H. Ardi Pramono, Sp.An., M.Kes. selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Yogyakarta.
2. Ibu Sabtanti Harimurti, Ph.D., Apt selaku ketua Program Studi Farmasi Universitas Muhammadiyah Yogyakarta
3. Bapak Hari Widada, M.Sc., Apt. selaku dosen pembimbing yang telah membantu dan membimbing dalam mengerjakan Karya Tulis ini.
4. Bapak Rifki Febriansah, M.Sc., Apt dan Bapak Puguh Novi Arsito, M.Sc., Apt selaku dosen penguji 1 dan dosen penguji 2.
5. Bapak Kasmo dan Ibu Sri Andari Amk.,S.Pd selaku orang tua penulis. 6. Bapak dan Ibu Dosen Program Studi Farmasi Universitas
Muhammadiyah Yogyakarta.
7. Sahabat dan teman teman Gangster, SimSimi, dan Aspartic yang selalu memberikan dukungan motivasi serta masukan kepada penulis.
8. Mas Shosa, Mas Mala, Tamam, Nazila, dan Ajeng Inggit yang berkontribusi secara langsung dalam pelaksanaan penulisan.
v
Yogyakarta, Desember 2016 Penulis
viii
Gambar 3. Instrumen GC-MS ... 16
Gambar 4. Prinsip Dasar Molecular Docking ... 19
Gambar 5. Kerangka konsep ... 21
Gambar 6. Skema Cara Kerja ... 32
Gambar 7. Kromatogram Hasil Pemisahan Kromatografi Gas Sampel Minyak Atsiri Buah Kemukus………...36
Gambar 8. Struktur Kimia 5 senyawa dengan kelimpahan tertinggi ... 38
Gambar 9. Visualisasi sisi aktif protein DNA Gyrase sub-unit B (3TTZ)……44
ix
kemukus………. 36
x
Lampiran 2. Tabel Hasil Uji Aktivitas dan Grafik Diameter Zona Inhibisi 60 Lampiran 3. Kondisi GC-MS………..……….. 61 Lampiran 4. Kromatogram………..………... 62 Lampiran 5. Hasil MS Dugaan Senyawa Alpha Cubebene berdasarkan hasil
kelimpahan tertinggi…….………. 63
Lampiran 6. Hasil MS Dugaan Senyawa Copaene berdasarkan hasil
kelimpahan tertinggi…..………..………... 64 Lampiran 7. Hasil MS Dugaan Senyawa Germacrene D berdasarkan hasil
kelimpahan tertinggi ….……..……….………... 65 Lampiran 8. Hasil MS Dugaan Senyawa 1H-Cycloprop[e]azulene
berdasarkan hasil kelimpahan tertinggi……… 66 Lampiran 9. Hasil MS Dugaan Senyawa Spathulanol berdasarkan hasil
kelimpahan tertinggi……….………...……….. 67 Lampiran 10. Hasil Konformasi Terbaik Penambatan Molekul Tiap
Ligan..……... 68 Lampiran 11. Foto : Uji Kirby Bauer…………...……...………..………… 69
xiii By : Tri Handrianto
20120350044
ABSTRACT
Infectious diseases are still a major cause of morbidity and mortality, one of which is an infection of the digestive tract. Infections caused by bacteria known as bacillary dysentery. The most common cause of diarrhea is Shigella, especially Shigella flexneri
and Shigella dysenteriae. Cubeb plant (Piper cubeba L.) empirically used to treat colitis
and dysentery. This study aims to determine the content and the potential of the main compounds in the volatile oil cubeb fruit (Piper cubeba L.f.) against Shigella flexneri,
also recognizing the great affinity for DNA gyrase protein in bacteria Shigella flexneri
by in silico. This research was a laboratory experimental method by in vitro and in silico. Data analysis was performed with the classification test Inhibition Zone Diameter (DZI) according to Clinical and Laboratory Standards Institute, one way ANOVA, and Autodock test. From the analysis, Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS) based on the five highest peaks found in cubeb fruit are alpha cubebene, copaene, germacrene D, 1H-cycloprop[e]azulene and spatulanol. The
minimum inhibitory levels cubeb fruit essential oil (Piper cubeba L.f.) that required to
inhibit the bacteria Shigella flexneri is 10%. The average value DZI (Inhibition Zone
Diameter) obtained from each concentration of essential oils of cubeb fruit (Piper cubeba L.f.) that can inhibit the bacteria Shigella flexneri is at a concentration of 10%
was 8 mm; concentration of 20% is 8,5 mm; concentration of 40% is 9.5 mm; concentration of 80% is 11 mm. In silico result is 1H-cycloprop[e]azulene as dominant
Compounds in cubeb fruit have the highest affinity towards protein DNA gyrase in bacteria Shigella flexneri with a bond energy value -7,3 kcal / mol.
Keyword : Essential oil, Cubebe, Shigella flexneri, Antibacterial test, Molecular
1 A. Latar Belakang Penelitian
Ditengah munculnya new-emerging disease, penyakit infeksi tetap menjadi
masalah kesehatan masyarakat yang penting di seluruh belahan dunia. Penyakit
infeksi masih menjadi penyebab utama kesakitan dan kematian, salah satunya
adalah infeksi saluran pencernaan. Penyakit infeksi saluran pencernaan dapat
disebabkan oleh virus, bakteri dan protozoa. Infeksi yang disebabkan oleh bakteri
dikenal sebagai disentri basiler yang disebabkan oleh bakteri Shigella. Penyebab
diare yang tersering adalah Shigella, khususnya Shigella flexneri dan Shigella
dysenteriae (Zein, 2004). Data profil kesehatan Indonesia tahun 2010
menyebutkan bahwa jumlah kasus diare yang ditemukan sekitar 213.435 penderita
dengan jumlah 1.289 kematian, dan sekitar 70–80% dari jumlah tersebut terjadi
pada anak-anak terutama usia dibawah 5 tahun. Dari data tersebut dapat
diperkirakan bahwa selama 20–30 tahun ke depan diare dan beberapa penyakit
infeksi lainnya akan tetap menjadi perhatian sebagai penyebab masalah kesehatan
di dunia (Depkes, 2010)
Tanaman kemukus (Piper cubeba L.) merupakan salah satu tanaman yang
secara empirik digunakan untuk mengobati masuk angin, radang usus, disentri,
perut mulas, kencing nanah, radang selaput lendir, asma, ekspektoran dan
bronkhitis (Sudarsono et.al., 1996). Tanaman obat yang tergolong rempah-rempah
merupakan suatu anugerah bagi makhluk hidup dan merupakan salah satu tanda
kekuasaan Allah SWT. Hal tersebut dituangkan dalam firman Allah surat An-Nahl
(16) ayat 11 yang berbunyi :
Artinya :
“Dia menumbuhkan bagi kamu dengan air hujan itu tanam-tanaman; zaitun,
kurma, anggur dan segala macam buah-buahan. Sesungguhnya pada yang demikian
itu benar-benar ada tanda (kekuasaan Allah) bagi kaum yang berfikir”. (QS.
An-Nahl : 11)
Telah dilakukan uji anti bakteri senyawa kemukus dengan bakteri
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Shigella dysentriae, dan Candida albicans
dan diperoleh kesimpulan bahwa senyawa buah kemukus dapat menghambat
bakteri senyawa Shigella dysentriae pada konsentrasi 10% (Irianingsih, 2004).
Penelitian lain menyatakan kesetaraan dari minyak atsiri untuk larutan uji 3000 bpj,
4000 bpj, 5000 bpj, 6000 bpj, dan 7000 bpj terhadap pertumbuhan Escherichia coli
dengan pembanding k1oramfenikol secara berturut-turut adalah sebagai berikut:
12,1 bpj; 13,3 bpj; 14,1 bpj; 14,5 bpj; dan 14,7 bpj. (Murti, 2007).
Pada penelitian ini akan dilakukan analisis kandungan dan uji in silico
terhadap kandungan utama dalam minyak atsiri kemukus, sehingga diketahui
ikatan, maupun afinitas suatu ligan (obat) dengan reseptornya, maupun enzim
dengan substrat atau inhibitor-nya. Metode in silico juga dapat digunakan untuk
memprediksi apakah suatu senyawa memiliki aktivitas atau tidak, dan berguna
dalam pengembangan senyawa dengan aktifitas yang lebih baik. Dengan semakin
berkembangnya penggunaan obat tradisional maka perlu dilakukan penelitian lebih
lanjut terhadap efek khasiat obat tradisional (kemukus) yang diduga memiliki
khasiat yang menguntungkan bagi manusia.
B. Rumusan Masalah
1. Apakah kandungan senyawa utama dalam minyak atsiri buah kemukus (Piper
cubeba L.f.) berdasarkan analisis Gas Chromatography-Mass Spectrometry
(GC-MS)?
2. Berapa Kadar Hambat Minimum dan Diameter Zona Inhibisi masing masing
konsentrasi minyak atsiri buah kemukus (Piper cubeba L.f.) yang dapat
menghambat bakteri Shigella flexneri?
3. Berapakah skor afinitas senyawa penambatan molekul tertinggi dari 5 senyawa
utama minyak atsiri buah kemukus (Piper cubeba L.f.) terhadap protein DNA
gyrase pada bakteri Shigella flexneri secara in silico?
C. Keaslian penelitian
Penelitian yang telah dilakukan sebelumnya dilakukan oleh Irianingsih
(2004) dengan judul Uji Aktivitas Antimikroba Minyak Atsiri Buah Kemukus
(Piper cubeba L.f.) terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923, Shigella
(Piper cubeba L.f.) memiliki aktivitas antibakteri terhadap Sthaphylococcus aureus
ATCC 25923 dengan nilai KBM sebesar 0,156 % v/v, Shigella dysentriae dengan
nilai KBM sebesar 10% dan Candida albicans dengan nilai KBM sebesar 10% dan
5 komponen terbesar minyak atsiri buah kemukus antara lain kopaena (12,61%),
germakrena-d (15,9%), kariofilen (13,25%), delta kadinol (10,22%) dan ledol (8,76
%).
Penelitian yang lain dilakukan oleh Murti (2007) berjudul Antibakteri
Minyak Buah Kemukus (Piper cubeba L.f.) terhadap Escherichia coli dan
kesetaraannya dibandingkan kloramfenikol serta profil KLT minyak atsirinya.
Adapun kesetaraan dari minyak atsiri untuk larutan uji 3000 bpj, 4000 bpj, 5000
bpj, 6000 bpj, dan 7000 bpj terhadap pertumbuhan Escherichia coli dengan
pembanding k1oramfenikol secara berturut-turut adalah sebagai berikut: 12,1 bpj;
13,3 bpj; 14,1 bpj; 14,5 bpj; dan 14,7 bpj. Sedangkan pada penelitian ini dilakukan
analisis terhadap buah kemukus (Piper cubeba L.f.) sebagai antibakteri terhadap
bakteri Shigella flexneri.
D. Tujuan Penelitian
1. Mengetahui senyawa penyusun utama minyak atsiri buah kemukus secara Gas
Chromatography-Mass Spectrometry.
2. Mengetahui Kadar Hambat Minimum dan Diameter Zona Inhibisi
masing-masing konsentrasi minyak atsiri buah kemukus (Piper cubeba L.f) yang dapat
senyawa utama minyak atsiri buah kemukus (Piper cubeba L.f.) terhadap
protein DNA gyrase pada bakteri Shigella flexneri secara in silico.
E. Manfaat Penelitian
Hasil dari penelitian ini diharapkan mampu digunakan sebagai sumber
informasi dasar untuk penelitian berikutnya baik mengenai alternatif pengatasan
infeksi dengan herbal, maupun untuk studi formulasi lanjutan agar tanaman
kemukus yang memiliki aktivitas antibakteri tersedia dalam bentuk sediaan agar
6 A. Tinjauan Pustaka
1. Disentri a. Definisi
Disentri basiler (Shigellosis) adalah penyakit infeksi usus akut
yang secara umum disebabkan oleh Shigella flexneri 70,6 %, Shigella
sonnei 17,6 %, Shigella boydii 5,9 %, dan Shigella dysenteriae 5,9 %.
Anggota genus Shigella yang memiliki persentase tertinggi sebagai
penyebab disentri adalah Shigella flexneri (Santoso, et.al., 2004).
b. Epidemiologi
Diare merupakan salah satu masalah kesehatan yang masih
menjadi penyebab utama tingginya morbiditas dan mortalitas pada anak
di negara berkembang termasuk di Indonesia. Menurut WHO angka
kesakitan diare pada tahun 2010 yaitu sebanyak 411 penderita per 1.000
penduduk. Berdasarkan data profil kesehatan Indonesia tahun 2010
jumlah kasus diare yang ditemukan sekitar 213.435 penderita dengan
jumlah kematian 1.289, dan sekitar 70–80% dari jumlah tersebut terjadi
pada anak-anak terutama usia dibawah 5 tahun. Dari data tersebut dapat
diperkirakan bahwa selama 20–30 tahun ke depan diare dan beberapa
penyakit infeksi lainnya akan tetap menjadi perhatian sebagai penyebab
Dari data-data tersebut diatas tampak bahwa diare, baik yang
disebabkan oleh virus, bakteri dan protozoa masih merupakan masalah
kesehatan masyarakat utama yang perlu penanganan dan kajian dari
berbagai aspek.
c. Etiologi
Berdasarkan etiologinya, penyakit diare dapat disebabkan oleh
mikroorganisme seperti bakteri, virus dan protozoa. Mikroorganisme
penyebab diare terutama pada anak yang paling banyak ditemukan di
negara berkembang antara lain Escherichia coli enterotoksigenik,
Shigella, Campylobacter jejuni, dan Cryptosporidium (Juffrie et.al.,
2010).
d. Klasifikasi
Penyakit infeksi saluran pencernaan dapat disebabkan oleh bakteri
dan protozoa. Infeksi yang disebabkan oleh bakteri dikenal sebagai
disentri basiler yang disebabkan oleh bakteri Shigella, sedangkan
infeksi yang disebabkan oleh protozoa dikenal sebagai disentri amuba
(Ismail et.al., 1997).
Penyebab diare yang terpenting dan tersering adalah Shigella,
salah satunya Shigella flexneri. Entamoeba histolytica merupakan
penyebab disentri pada anak yang usianya di atas lima tahun dan jarang
e. Patologi
Shigellosis menyebar dengan cara transmisi fecal-oral. Cara
penularan lain meliputi konsumsi makanan yang terkontaminasi atau
air, kontak dengan benda mati yang terkontaminasi, dan kontak seksual.
Vektor seperti lalat dapat menyebarkan penyakit dengan fisik
mengangkut kotoran yang terinfeksi (Sureshbabu, 2016).
Sedikitnya 10 Shigella dysenteriae basil dapat menyebabkan
penyakit klinis, sedangkan 100-200 basil diperlukan untuk Shigella
sonnei atau infeksi Shigella flexneri. Virulen Shigella dapat menahan
pH rendah asam lambung. Masa inkubasi bervariasi dari 12 jam sampai
7 hari, tapi biasanya 2-4 hari; masa inkubasi berbanding terbalik dengan
beban bakteri. Penyakit ini menular selama orang yang terinfeksi
mengeluarkan organisme tersebut dalam tinja. pengeluaran bakteri
biasanya berhenti dalam waktu 4 minggu dari onset penyakit; jarang
dapat bertahan selama berbulan-bulan (Sureshbabu, 2016).
f. Pengobatan
Pada infeksi ringan umumnya dapat sembuh sendiri, penyakit akan
sembuh pada 4-7 hari. Minum lebih banyak cairan untuk
menghindarkan kehabisan cairan, jika pasien sudah pada tahap dehidrasi
maka dapat diatasi dengan rehidrasi oral. Pada pasien dengan diare berat
disertai dehidrasi dan pasien yang muntah berlebihan sehingga tidak
dapat dilakukan rehidrasi oral maka harus dilakukan rehidrasi intravena.
jika diare. Untuk infeksi berat Shigella dapat diobati dengan
menggunakan antibiotika termasuk ofloksasin, norfloksasin dan
siprofloksasin (Dipiro et.al.,2008).
2. Shigella Flexneri
Gambar 1. Shigella flexneri
(Sumber : CDC, 2013)
Kingdom : Bacteria
Phylum : Proteobacteria
Class : Gammaproteobacteria
Order : Enterobacteriales
Family : Enterobacteriaceae
Genus : Shigella
Species : Shigella flexneri
(Castellani & Chalmers, 1919)
Shigella flexneri merupakan bakteri gram negatif, nonmotile, dan
berbentuk batang. Shigella flexneri dapat menyebabkan Shigellosis (disentri
basiler) dengan cara menginvasi epitel usus besar. Bakteri Shigella flexneri
mampu menyerang dan memecah sel-sel epitel dan sel dendrit kemudian
3. Kemukus a. Morfologi
Kemukus (Piper cubeba L.) merupakan perdu merambat dengan
tinggi sampai 15 meter (Heyne, 1987). Berupa buah berbentuk hampir
bulat, bau khas, rasa agak pedas dan pahit, bergaris tengah lebih
umumnya kurang 5 mm, pada bagian pangkal terdapat tonjolan panjang
menyerupai tangkai, panjang tonjolan 5-10 mm, tebal kurang dari 1 mm,
kadang-kadang bagian pangkal di daerah tonjolan agak cekung.
Permukaan luar umumnya berkerut keras seperti anyaman jala,
kadang-kadang rata, warna cokelat tua atau cokelat kelabu sampai hitam,
permukaan dalam licin, berwarna cokelat muda. Kulit biji berwarna
cokelat tua, berkeriput. Inti biji terdiri dari perisperm, di bagian atas
terdapat endosperm yang kecil dengan embrio di dalamnya (Depkes,
2008).
b. Taksonomi
Kingdom :Plantae
Subkingdom : Tracheobionta
Super Divisi : Spermatophyta
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Dicotyledonae
Bangsa : Piperales
Suku : Piperaceae
Marga : Piper
Jenis : Piper cubeba L. (PLANTAMOR, 2012)
c. Kandungan Kimia
Pada buah yang telah dikeringkan mengandung lebih dari 10%
minyak atsiri yang terdiri dari senyawa-senyawa monoterpen (sabinene
50%, carene, α-thujane, 1,4-cineol dan 1,8-cineol) dan senyawa
senyawa seskuiterpen (copaene, α- dan β-cubebane, δ-cadinene,
coryophyllene, germacrene, cubebol). Meskipun senyawa-senyawa
monoterpen masih mendominasi, namun yang memberikan sumbangan
lebih besar pada karakteristik aromanya adalah senyawa seskuitepen.
Selain itu buah kemukus juga mengandung senyawa lignin yang terdiri
dari cubebin, hinokinin elusin, dihidroclusin, cubebinin yatein
cubebinolide, cadigerine, iso yatein (2R, 3R) -2-(3”,4”-
methylen-dioxybenzyl)-3-(3’,4’dimethoxybenzil)buyrolactone (Sudarsono et.al.,
Terpenoid secara garis besar adalah senyawa yang termasuk ke
dalam golongan hidrokarbon yang sering ditemukan pada tanaman obat.
Terpenoid merupakan metabolit sekunder pada tanaman yang memiliki
efek farmakologis seperti antivirus, antibakteri, antimalaria, antiradang,
penghambat sintesis kolesterol dan anti kanker (Nassar & Abdalrahim,
2011)
Sehubungan dengan kandungan zat-zatnya, buah kemukus banyak
dimanfaatkan untuk mengobati masuk angin, radang usus, disentri,
perut mulas, kencing nanah, raja singa, radang selaput lendir, asma,
serta ekspektoran dan bronkitis (Sudarsono et.al., 1996).
4. Antibakteri
Berdasarkan spektrum kerjanya, anti bakteri dapat digolongkan
sebagai antibakteri dengan spektrum luas yang efektif baik untuk bakteri
gram positif maupun bakteri gram negatif, contohnya tetrasiklin dan
kloramfenikol. Antibakteri dengan spektrum sempit, yang hanya efektif
untuk bakteri gram positif atau gram negatif saja seperti eritromisin,
klindamisin, kanamisin hanya bekerja pada bakteri gram-positif sedang
streptomisin, gentamisin, hanya bekerja pada bakteri gram-negatif.
Sedangkan berdasarkan mekanisme kerjanya, antibakteri dapat
digolongkan dalam 5 kelompok, yaitu:
a. Antibakteri yang mengganggu metabolisme sel bakteri
b. Antibakteri yang menghambat dinding sel bakteri
d. Antibakteri yang menghambat sintesis protein sel bakteri
e. Antibakteri yang menghambat sintesis asam nukleat sel bakteri
(Ganiswara, dkk., 1995)
Salah satu obat yang bisa digunakan sebagai antibiotik bakteri
Shigella adalah Ciprofloxacin. Ciprofloxacin merupakan antibiotik
spektrum luas (broad spectrum) golongan florokuinolon yang paling umum
digunakan (Mohanasundaram & Shantha, 2000) dengan mekanisme kerja
menghambat DNA gyrase (topoisomerase II) dan topoisomerase IV yang
terdapat dalam bakteri (Marians & Hiasa, 1997). Penghambatan terhadap
enzim yang terlibat dalam replikasi, rekombinasi dan reparasi DNA tersebut
mengakibatkan penghambatan terhadap pertumbuhan sel bakteri (Sarro,
2001).
Ciprofloxacin digunakan untuk pengobatan infeksi yang disebabkan
oleh bakteri Gram negatif seperti E. coli, Proteus mirabilis, Klibsiella sp,
Shigella sp., Enterobacter, Chlamydia sp, Salmonella sp, dan P. aeruginosa
serta bakteri gram positif tertentu. Mekanisme kerja dari antibiotik ini yaitu
dengan menghambat proses terbentuknya superkoil DNA yang berikatan
dengan enzim DNA gyrase sub unit A yaitu suatu enzim yang penting pada
replikasi dan perbaikan DNA. Resistensi bakteri terhadap antibiotik ini
dapat terjadi karena adanya mutasi gen yang mengkode polipeptida sub unit
A enzim DNA gyrase (Jawetz dkk., 2001). Menurut Cushnie and Lamb
(2005) senyawa flavonoid dapat berikatan dengan peptidoglikan pada
dapat menghambat proses biosintesis peptidoglikan dan menghambat DNA
gyrase. Alkaloid dapat merusak sintesis dinding sel sehingga dapat
menyebabkan sel menjadi lisis.
5. Destilasi
Destilasi didefinisikan sebagai sebuah proses dimana campuran dua
atau lebih zat liquid atau vapor dipisahkan menjadi komponen fraksi yang
murni, dengan pengaplikasian dari perpindahan massa dan panas (Komariah
et.al., 2009). Destilasi adalah suatu metode yang digunakan untuk
memurnikan cairan-cairan berdasarkan pada perbedaan titik didih. Jenis
jenis destilasi yang digunakan antara lain (Ketaren, 1987) :
a. Destilasi sederhana
Metode ini digunakan untuk memurnikan cairan-cairan yang tidak
terurai pada titik didihnya dari pengotor-pengotor nonvolatile atau
memisahkan cairan yang memiliki titik didih paling sedikit antara
70-80⁰C.
b. Destilasi terfraksi konstituen
Metode ini digunakan bila suatu campuran cairan yang berbeda
titik didih sekitar 30⁰ C atau lebih.
c. Destilasi vakum
Metode ini digunakan untuk memurnikan cairan-cairan organik
yang terurai pada atau dibawah titik didih normalnya atau cairan yang
memiliki titik didih sangat tinggi dimana sulit untuk dilakukan pada
d. Destilasi uap
Metode ini digunakan untuk memurnikan senyawa organik yang
volatile, tidak bercampur dengan air, mempunyai tekanan uap yang
tinggi pada 100⁰ C dan mengandung pengotor-pengotor non volatile.
6. Kromatografi Gas dan Spektrometri Massa
Kromatografi didefinisikan sebagai prosedur pemisahan zat terlarut
oleh suatu proses migrasi dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase,
salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dengan arah
tertentu dan di dalamnya zat-zat itu menunjukkan perbedaan mobilitas
disebabkan adanya perbedaan dalam adsorbsi, partisi, kelarutan, tekanan
uap, ukuran molekul atau kerapatan muatan ion (Depkes, 2008).
Teknik kromatografi umum menggunakan fase gerak gas pembawa
Helium. Gas Helium digunakan karena bersifat inert. Kolom yang
digunakan adalah kolom kapiler dan kolom paket. Kolom kapiler memiliki
panjang antara 10 hingga 120 meter dengan diameter internal 0,1 hingga 0,5
mm. Kolom paket memiliki panjang 1 hingga 5 meter dengan diameter
internal antara 2 hingga 4 mm (Crawford Scientific, 2015).
Proses pemisahan dalam GC diawali dengan sampel yang diinjeksikan
ke inlet kemudian diuapkan dan dibawa ke kolom oleh gas pembawa.
Senyawa akan dipisahkan berdasarkan karakteristik molekul dan interaksi
dengan fase diam. Senyawa yang tidak berinteraksi melewati kolom dengan
melewati kolom disebut retention time (Rt) yang digunakan untuk
membedakan satu senyawa dengan senyawa yang lain (Douglas, 2015).
Spektrometri massa merupakan teknik analisis yang didasarkan pada
perubahan komponen cuplikan menjadi ion-ion gas dan memisahkannya
berdasarkan perbandingan massa terhadap muatan (m/e). Komponen
instrumen MS antara lain ruang ionisasi, mass analyzer dan detector (JEOL,
2006).
Gambar 3. Ilustrasi skematis instrumen GC-MS (Crawford Scientific, 2015)
Senyawa dari GC menuju ke MS melalui ruang ionisasi. Ionisasi
terjadi apabila suatu molekul berbentuk gas disinari oleh suatu elektron
yang berenergi tinggi dalam sistem hampa, maka akan terjadi ionisasi. Ion
molekul terbentuk sedangkan ion yang tidak stabil pecah menjadi ion-ion
yang lebih kecil (Watson, 1994). Luaran yang dihasilkan berupa spektrum
yang ditunjukan dengan nilai massa fragmen (m/z). Semakin tinggi
spektrum menunjukan banyaknya fragmen yang terdeteksi. Spektrometri
massa dapat memberikan informasi kualitatif dan kuantitatif tentang
7. Uji Aktivitas Antibakteri
Uji aktivitas antibakteri digunakan untuk mengetahui kemampuan
antibakteri untuk menghambat pertumbuhan atau membunuh bakteri pada
konsentrasi tertentu. Uji ini bertujuan untuk menentukan aktivitas bakteri
tertentu terhadap terapi antibakteri pada organisme yang terinfeksi (FDA,
2009). Tes sensitivitas antibakteri diklasifikasikan menjadi:
a. Difusi
Metode difusi digunakan dengan cara menempatkan cakram kertas
filter yang mengandung sejumlah obat tertentu diatas permukaan
medium padat yang telah ditanam pada permukaan dengan organisme
uji. Setelah inkubasi, diameter zona inhibisi disekitar cakram diukur
sebagai ukuran inhibisi obat melawan organisme uji (Jawetz et.al.,
2001).
b. Dilusi
Metode dilusi digunakan dengan cara mengukur Minimum
Inhibitory Concentration (MIC) dan Minimum Bactericidal
Concentration (MBC) dengan membuat seri pengenceran agen
antimikroba pada medium cair yang ditambahkan dengan mikroba uji.
Larutan uji yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji
ditetapkan sebagai MIC, sedangkan larutan yang tetap terlihat jernih
setelah inkubasi ditetapkan sebagai MBC. Terdapat jenis dilusi yang
lain yaitu dilusi padat yang serupa dengan dilusi cair namun
8. Metode Kirby Bauer
Metode Kirby Bauer adalah metode yang digunakan untuk menguji
sensitivitas suatu senyawa antibakteri terhadap mikroorganisme patogen
aerob maupun anaerob penyebab penyakit. Metode ini dipublikasi oleh
W.Kirby dan A.Bauer dan kemudian dibakukan oleh WHO pada tahun 1961
(Hudzicki, 2009).
Tujuan dari uji kepekaan Kirby Bauer untuk menentukan sensitivitas
atau resistensi dari aerobik patogen dan bakteri anaerob fakultatif untuk
berbagai senyawa antimikroba. Hal ini dapat untuk membantu dokter dalam
memilih pilihan pengobatan untuk pasiennya. Organisme patogen ditanam
di agar dengan disk kertas diresapi penyaring antimikroba. Ada atau tidak
adanya pertumbuhan sekitar cakram adalah ukuran tidak langsung dari
kemampuan senyawa yang menghambat organisme itu (Hudzicki, 2009).
Penentuan resistensi bakteri terhadap antimikroba adalah bagian
penting dari manajemen infeksi pada pasien. Metode Kirby Bauer telah
dibakukan dan merupakan metode yang layak untuk laboratorium dengan
sumber daya minimal untuk memanfaatkan metode otomatis yang lebih
baru untuk pengujian dilusi. Cakram kertas yang memiliki diameter 6 mm
diresapi dengan konsentrasi senyawa antimikroba ditempatkan pada agar
piring, senyawa yang diserap ke dalam disk itu mulai berdifusi ke dalam
agar-agar sekitarnya. Tingkat difusi dari antimikroba melalui agar
tergantung pada difusi dan sifat kelarutan obat dalam agar juga tergantung
menyebar lebih lambat dibanding senyawa dengan berat molekul rendah
(Hudzicki, 2009).
9. Uji in Silico
a. Penambatan Molekuler
Penambatan molekuler adalah metode komputasi yang bertujuan
meniru peristiwa interaksi suatu molekul ligan dengan protein yang
menjadi tergetnya pada uji in-vitro (Motiejunas & Wade, 2006). Pada
umumnya tujuan utama penambatan molekuler juga digunakan untuk
mendapat nilai energi ikatan konformasi yang paling rendah dengan
afinitas yang paling tinggi. Pada dasarnya cara kerja dari beberapa
[image:32.595.170.517.427.517.2]aplikasi tersebut digambarkan pada Gambar 4.
Gambar 4. Prinsip dasar Molecular Docking
(Kroemer, 2007) R : Reseptor
A : Ligan yang cocok dengan reseptor
B : Ligan yang tidak cocok dengan reseptor
C : Ligan yang cocok dengan reseptor dalam konformasi yang lain
√ : Ikatan ligan cocok dengan reseptor
X : Ikatan ligan tidak cocok dengan reseptor
Ada beberapa aplikasi yang umum digunakan untuk melakukan
virtual screening dengan metode penambatan molekuler antara lain
dengan PLANTS (Protein Ligand Ant System), GOLD, MOE
(Molecular Operating Environment), MVD (Molegro Virtual Docking)
dan Autodock (Kroemer, 2007).
b. Autodock Vina
Autodock Vina merupakan aplikasi penambatan molekul protein
dan ligan. Autodock Vina memiliki kerja yang sama dengan aplikasi
Autodock Tool 4. Pada penerapannya Autodock Vina ini menggunakan
fungsi skor energi interaksi untuk memperkirakan afinitas protein dan
ligan, jenis ikatan yang mungkin terjadi, serta menentukan konformasi
paling baik. Skor penambatan ini diestimasikan sebagai binding energy
yang memiliki satuan Kkal/mol (Morris et.al., 2009). Percobaan
Autodock Vina digunakan untuk memprediksi dimana dan bagaimana
ligan yang dapat berikatan dengan protein yang paling baik. Sesuai
standar, melakukan percobaan ulang pada pasangan ligan dan protein
dapat menghasilkan berbagai model ikatan yang berbeda. (Jaghoori
et.al., 2016). Dalam hal akurasi penambatan molekul, nilai
root-mean-square-deviation(RMSD) kurang dari 2 Å secara umum digunakan dan
telah menjadi pertimbangan hasil penambatan molekul yang dikatakan
berhasil. Kriteria yang sama telah digunakan di penelitian molekul yang
lain seperti Glide, Surflex, GOLD dan FlexX. Ambang batas RSMD <2
B. Kerangka konsep
Gambar 5. Kerangka konsep
Penyakit infeksi saluran pencernaan dapat disebabkan oleh virus, bakteri
dan protozoa. Infeksi yang disebabkan oleh bakteri dikenal sebagai disentri
basiler yang disebabkan oleh bakteri Shigella. Penyebab diare yang tersering
adalah Shigella, khususnya Shigella flexneri dan Shigella dysenteriae (Zein,
2004). Beberapa jenis bakteri Shigella telah menjadi kebal terhadap antibiotik, Shigella flexneri
Disentri
Pengobatan
Antibiotik Herbal
Piper cubeba L.f.
GC-MS
Uji In Silico
Uji InVitro
Penambatan Molekul
Destilasi
seperti kotrimoksazol, ampisilin dan tetrasiklin (Bush & Perez, 2014), maka
diperlukan suatu terapi komplementer atau terapi anti bakteri lain untuk
mengatasi kasus resistensi tersebut. Penggunaan bahan alam misalnya
menggunakan kemukus dapat menjadi solusi untuk kasus ini.
C. Hipotesis
Dari penelitian ini, dirumuskan hipotesis sebagai berikut :
1. Minyak atsiri buah kemukus (Piper cubeba L.f.) mengandung senyawa
golongan terpenoid yang dapat digunakan sebagai antibakteri yang
dianalisis secara Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS).
2. Kadar Hambat Minimum konsentrasi minyak atsiri buah kemukus (Piper
cubeba L.f.) yang diperlukan untuk menghambat Shigella flexneri sebesar
10%.
3. Senyawa marker buah kemukus yaitu cubebene memiliki afinitas paling
baik terhadap protein DNA Gyrase pada bakteri Shigella flexneri secara in
23 A. Desain Penelitian
Desain penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah penelitian
eksperimental laboratoris dan penelitian eksploratif dengan metode in vitro dan
in silico.
B. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Teknologi Farmasi FKIK UMY,
Laboratorium Penelitian FKIK UMY, Central of Essential Oil Studies UII dan
Laboratorium Kimia Organik Fakultas MIPA UGM dari bulan Januari hingga
Juni 2016.
C. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel Penelitian
a. Analisis Kandungan Kimia Gas Chromatography-Mass Spectrometry
(GC-MS)
Variabel bebas : Minyak atsiri buah kemukus (Piper cubeba L.f.)
Variabel tergantung : Nilai waktu retensi (Rt) rasio muatan (m/z)
Variabel terkendali : Kondisi GC-MS
b. Uji Aktivitas Antibakteri
Variabel bebas` : Konsentrasi minyak atsiri buah kemukus
(Piper cubeba L.f.)
Variabel tergantung : Nilai DZI masing masing konsentrasi minyak
Variabel terkendali : Media pertumbuhan bakteri dan suhu.
c. Uji In Silico dengan Autodock Vina
Variabel bebas : Bentuk konformasi ikatan antara ligan dan
protein target
Variabel tergantung : Skor penambatan molekul
Variabel terkendali : Hardware, software, struktur ligan, dan protein
Target DNA gyrase
2. Definisi Operasional
a. Waktu retensi/ retention time (Rt) adalah waktu yang dibutuhkan oleh
senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor.
b. Kadar Hambat Minimum (KHM)/ Minimum Inhibitory Concentration
(MIC) adalah konsentrasi minimal antibakteri yang dapat menghambat
aktivitas bakteri.
c. Diameter Zona Inhibisi (DZI) adalah diameter yang berupa zona bening
yang menunjukan daya hambat suatu senyawa anti bakteri terhadap
bakteri yang diuji dalam satuan milimeter (mm).
d. Skor penambatan adalah nilai ikatan energi suatu senyawa terhadap
proteinnya yang semakin minimum nilainya dianggap semakin baik dan
memiliki afinitas yang lebih tinggi yang dinyatakan dengan satuan
D. Instrumen Penelitian 1. Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan meliputi bejana, blender Phillips®seri
2071,sarung tangan Sensi Gloves® (Handscoon Non Steril), masker Sensi
Mask®,pinset Baku®, mikropipet Socorex® skala 10-100µl, pipet ukur
Pyrex®, pipet tetes Pyrex®, timbangan analitik Metller Toledo Scale brite®,
gelas beker Pyrex®, dan gelas ukur Pyrex®, alat GC-MS QP2010S
Shimadzu®,seperangkat Personal Computer (PC) dengan sistem operasi
adalah Linux Ubuntu 12.04 LTS 64-bit, prosessor Pentium(R) Dual-Core
CPU E6600 @ 3.06 GHz, memory 2048 MB RAM. Aplikasi yang
digunakan adalah Libre Office Calc 4.0, DS Visualizer, Autodock Tools,
Open Babel dan Marvin Sketch. Kapas lidi, ose steril yang berasal dari Lab
Mikrobiologi FKIK UMY.
2. Bahan Penelitian
Kemukus (Piper cubeba L.f.) diperoleh dari pedagang tanaman herbal
di Desa Mayungan, Kecamatan Banguntapan, Kabupaten Bantul, Daerah
Istimewa Yogyakarta, Aquades yang dibeli dari toko Brata Chem, NaCL
fisiologis, BHI yang berasal dari Lab Mikrobiologi FKIK UMY,
ciprofloxacin iv Dexa medica®, Protein DNA gyrase yang diunduh dari
E. Cara Kerja
1. Determinasi Tanaman
Determinasi buah kemukus (Piper cubeba L.f.) dilakukan di
laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi UGM.
2. Penyiapan Bahan
Buah kemukus (Piper cubeba L.f.) sebanyak 500 gram yang sudah
bersih dan kering dihaluskan dengan blender hingga halus merata, setelah
halus dimasukan dalam wadah tertutup rapat.
3. Penyulingan buah kemukus
Pembuatan ekstrak dilakukan dengan metode destilasi rebus. Serbuk
halus buah kemukus sebanyak 500 gram dan aquades sebanyak 2500 ml
dimasukkan kedalam panci destilasi. Kemudian dipanaskan menggunakan
kompor hingga didapatkan destilat yang ditampung dalam gelas ukur.
Selanjutnya minyak atsiri yang berwarna bening kekuningan dipisahkan
dengan air menggunakan pipet tetes dan dimasukan dalam wadah.
4. Analisis Kandungan Kimia Metode GC-MS
Analisis ini dilakukan untuk mendeteksi keberadaan
senyawa-senyawa dalam ekstrak buah kemukus (Piper cubeba L,f.) dapat digunakan
sebagai antibakteri. Pemisahan senyawa dengan GC menggunakan kolom
AGILENTJ % W DB-1 dengan panjang 30 meter. Fase gerak menggunakan
gas pembawa helium dengan kecepatan 0,54 ml/menit. Sistem pemanasan
diatur dari suhu 50 hingga 260⁰C dengan peningkatan sebesar 5⁰C setiap
Hasilnya akan diamati melalui spektra yang diamati berdasarkan berat
molekul dan waktu retensi senyawa yang diinginkan.
5. Uji In Silico dengan Autodock Vina
a. Instalasi Aplikasi Autodock dan Aplikasi Pendukung
Autodock Vina merupakan aplikasi untuk melakukan proses
penambatan molekul. DS Visualizer untuk preparasi protein uji dan
ligan asli, Marvin Sketch untuk preparasi ligan atau senyawa ligan yang
akan diuji. AutoDockTools untuk melakukan penambatan molekuler
agar dapat dieksekusi oleh aplikasi Autodock Vina untuk mengukur nilai
RMSD dan Open Babel untuk mengkonversi hasil PDBQT menjadi
PDB sehingga dapat divisiualisasikan menggunakan DS Visualizer.
b. Penyiapan Protein Target dan Ligan Uji
Protein yang akan digunakan sebagai reseptor uji diunduh dari situs
resmi protein data bank (www.rscb.org) dalam format “.pdb”. Berkas
protein/reseptor yang digunakan adalah DNA gyrase dengan kode
protein 3TTZ. Setelah mendapatkan protein target dilakukan preparasi
melakukan DS Visualizer dengan memastikan ligan bebas dari molekul
air. Reseptor disimpan dalam format PDB. Hal tersebut juga dilakukan
pada ligan asli sebagai ligan uji.
c. Konversi Protein dan Ligan dalam Format PDBQT
Untuk menjalankan fungsi aplikasi Autodock Vina, berkas reseptor
target dan ligan uji harus dikonversi terlebih dahulu menggunakan
yang sudah dipreparasi ditambahkan atom hidrogen dan disimpan dalam
bentuk PDBQT dengan menggunakan menggunakan tahapan preparasi
Grid Parameter File.
d. Preparasi Grid Parameter File
Proses ini merupakan proses lanjutan dari langkah sebelumnya. Aplikasi
Autodock Tools yang masih terbuka kemudian dipilih bagian Grid dan
dipilih ligan melalui fungsi Set Map Types dan dilanjutkan penyiapan
Grid Box. Grid Box merupakan penentuan area untuk simulasi
penambatan. Kemudian hasil output disimpan dalam bentuk PDBQT.
e. Penambatan Molekuler dengan Autodock Vina
Sebelum menjalankan fungsi penambatan molekuler berkas
reseptor.pdbqt dan ligan.pdbqt berada pada folder yang sama.
Kemudian menu RUN dibuka dan klik CMD dan menunggu prosesnya
selesai. Pada folder Vina akan muncul beberapa konformasi hasil
penambatan.
f. Visualisasi Penambatan Molekul
Hasil penambatan molekul divisualisasikan menggunakan DS
Visualizer. Sebelum visualisasi berkas hasil penambatan dengan format
PDBQT dirubah menjadi berkas PDB menggunakan aplikasi Open
Babel. Setelah didapatkan berkas PDB, berkas reseptor.pdb
menggunakan DS Visualizer dan dipilih hasil penambatan dan
dimasukan ligan hasil penambatan molekul dan melihat visualisasi
mengidentifikasi dengan lebih mudah background diganti warna putih
dan dicantumkan label residu asam amino tempat hasil penambatan
berikatan.
g. Validasi Molecular Docking
Validasi molecular docking bertujuan untuk menentukan apakah protein
yang digunakan untuk molecular docking dapat digunakan atau tidak.
Validasi molecular docking ini dilakukan dengan cara menentukan nilai
RSMD. Nilai validitas RSMD yang dipersyaratkan adalah <2.00 Å.
6. Uji Aktivitas Antibakteri
a. Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang akan digunakan terlebih dahulu disterilisasi, seperti
alat-alat gelas disterilisasi menggunakan oven dengan suhu 170° C
selama 2 jam. Ose dan pinset disterilkan menggunakan bunsen. Media
nutrien agar disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121° C selama 15
menit dan aquades disterilkan dengan penangas hingga mendidih selama
15 menit. Sampel yang telah dibuat variasi konsentrasi, semua alat, dan
bahan kecuali suspensi bakteri sebelum pengujian dilakukan sterilisasi
menggunakan sinar UV selama 30 menit.
b. Pembuatan kontrol positif
Kontrol positif yang digunakan adalah larutan Ciprofloxacin 0,2% yang
dibuat dengan cara diambil 25 uL larutan Ciprofloxacin injeksi
ditambahkan Aqua Pro Injection hingga 10 ml.
c. Pembuatan kontrol negatif
Kontrol negatif yang digunakan adalah n-heksana.
d. Pembuatan larutan uji
Konsentrasi minyak atsiri buah kemukus dibuat larutan induk dengan
100% dengan melakukan n-heksana. Selanjutnya dibuat variasi
konsentrasi 10%, 20%, 40%, 80% dengan cara membuat 0,5 ml; 1 ml;
2 ml; 4 ml minyak atsiri buah kemukus ditambahkan pelarut n-heksana
hingga volume 5 ml.
e. Pembuatan media agar
Mac Conkey Agar 20,6 gram dimasukan ke dalam 2 erlenmeyer 250 mL.
Ditambahkan air suling masing-masing sebanyak 200 mL. Dipanaskan
diatas pemanas sampai larut sempurna kemudian ditutup dengan bundle.
Disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 °C selama 15 menit,
dituangkan ke dalam plate, dimasukan dalam almari pendingin dan siap
f. Preparasi Bakteri
Bakteri Shigella flexneri diambil dan dimasukan ke dalam larutan NaCl
fisiologis dan diinkubasi selama 2-4 jam pada suhu 37°C. Setelah itu
larutan supensi bakteri diambil sebanyak 1 ml dan ditambahkan dengan
menggunakan nutrient BHI dengan perbandingan BHI dibanding
suspensi bakteri (9:1) sambil dihomogenkan.
g. Uji Kadar Hambat Antibakteri
Suspensi bakteri yang terbentuk kemudian diusap secara merata pada
cawan petri yang telah berisi media nutrien agar menggunakan kapas
lidi steril. Cakram kertas direndam dengan larutan uji sesuai dengan
masing-masing konsentrasi. Cakram kertas yang berisi masing-masing
konsentrasi minyak atsiri kemukus, kontrol positif, kontrol negatif
kemudian ditempelkan pada permukaan media agar. Perlakuan ini
dilakukan replikasi. Selanjutnya diinkubasi pada 37°C selama 24 jam.
Hasilnya dapat dilihat dengan terbentuknya diameter hambatan secara
radial (DZI) di sekitar cakram kertas dan diukur diameternya dengan
satuan milimeter (mm). Selanjutnya dibandingkan diameter hambat
F. Skema Langkah Kerja
Gambar 6. Skema Cara Kerja 80%
10%
20%
40%
Kontrol Positif
Kontrol Negatif
Ciprofloxacin
n-heksana Minyak Atsiri Buah
Kemukus
Analisis GC-MS
Uji in silico
DNA gyrase Uji in Vitro
Metode Kirby Bauer
G. Analisis Data
1. Analisis Kandungan Kimia Metode GC-MS
Analisis kandungan senyawa buah kemukus (Piper cubeba L.f.) dilakukan
dengan cara melihat sprektra dan mengamati waktu retensi setiap senyawa
yang timbul dalam bentuk puncak-puncak (peak) kemudian dibandingkan
dengan standar yang bersumber pada WILEY 229 dan NIST 62.
2. Hasil Uji Penambatan Molekul
Hasil akhir yang akan diperoleh dari uji in silico adalah skor penambatan
molekul pada masing-masing variabel. Dari data penelitian ini dianalisis
perbandingan antara skor penambatan masing-masing senyawa uji dengan
senyawa pembanding dan perbandingan hasil visualisasi dalam bentuk 3D
dengan menggunakan aplikasi VMD (Visual Molecular Dynamics).
3. Analisis Uji Aktivitas Antibakteri
Data yang diperoleh pada pengujian ini adalah nilai DZI pada
masing-masing konsentrasi. Perbedaan data penelitian antara masing-masing-masing-masing
konsentrasi minyak atsiri kemukus dan antibiotik standar Ciprofloxacin
dilakukan analisis parametrik dengan uji one way ANOVA menggunakan
34 A. Determinasi Tanaman
Hasil determinasi sampel tanaman yang dilakukan di Laboratorium
Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada yang menyatakan
bahwa sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah benar Piper cubeba
L.f. yang ditunjukan pada lampiran 1.
B. Pengumpulan dan Penyiapan Bahan
Buah kemukus yang akan dianalisis berasal dari pedagang tanaman herbal
di Desa Mayungan, Kecamatan Banguntapan, Kabupaten Bantul, Daerah
Istimewa Yogyakarta. Buah kemukus dicuci hingga bersih dari kotoran yang
menempel kemudian dihaluskan dan ditimbang. Serbuk buah kemukus
digunakan agar memudahkan penyarian dan memperluas kontak antara bahan
dengan air.
C. Hasil Destilasi Minyak Atsiri
Metode yang digunakan untuk mendapatkan minyak atsiri yaitu metode
destilasi rebus. Metode ini dipilih karena minyak atsiri yang dihasilkan tidak
berhubungan langsung dengan udara luar sehingga tidak mudah menguap dan
volume minyak atsiri yang dihasilkan dapat langsung diketahui jumlahnya
karena dilengkapi dengan skala. Minyak atsiri yang diperoleh berupa cairan
Pada pelaksanaan destilasi minyak atsiri ini perlu diperhatikan ukuran
bahan tanaman yang seragam dan ruang antara bahan yang cukup agar air dapat
berpenetrasi. Penyebaran harus merata dalam ketel sehingga penyari dapat
menembus bahan secara merata dan menyeluruh. Buah kemukus yang
digunakan dalam penelitian ini adalah buah kemukus yang dikeringkan dengan
cara dijemur dibawah sinar matahari dan ditutup kain hitam.
Minyak atsiri yang didapatkan dari proses destilasi adalah 35 ml dari 500
gram bahan baku serbuk minyak atsiri. Minyak atsiri tersebut kemudian
dianalisis menggunakan GC-MS dan dilarutkan dengan n-heksana dalam
pembuatan konsentrasi minyak atsiri dalam uji aktivitas antibakteri pada
Shigella flexneri.
D. Hasil Analisis GC-MS
GC-MS dapat memberikan data kualitatif dan kuantitatif senyawa yang
menjadi komponen minyak atsiri karena AUC yang ditunjukan pada
kromatogram berbanding lurus dengan konsentrasi masing masing komponen
yang terdapat pada sampel. Analisis kromatografi gas akan mendapat
kemungkinan jumlah komponen minyak atsiri dan kadar masing-masing.
Sedangkan untuk menentukan jenis komponen minyak atsiri tersebut dilakukan
analisis dengan MS selanjutnya diidentifikasi dengan spektra yang berasal dari
NIST dan WILEY.
Analisis dengan GC-MS dilakukan dengan menginjeksi 1 μL larutan ke
dalam tempat injeksi. Uap cuplikan ini kemudian dibawa oleh gas pembawa
minyak atsiri sehingga dapat dideteksi oleh detektor dan dihasilkan suatu
kromatogram. Identifikasi komponen-komponen senyawa kimia dalam minyak
atsiri buah kemukus menggunakan alat GC-MS. Lingkaran merah pada gambar
7 menunjukkan 5 senyawa dengan kelimpahan tertinggi dalam minyak atsiri
[image:49.595.114.546.256.428.2]buah kemukus.
Gambar 7. Kromatogram Hasil Pemisahan Kromatografi Gas Sampel Minyak Atsiri Buah Kemukus
Tabel 1. Senyawa dengan kelimpahan tertinggi pada kromatogram GC-MS minyak atsiri buah kemukus
No . Senyaw a Wakt u retens i Puncak (%AUC)
SI BM Perkiraan Senyawa Acuan
1 I 25,380 10 (12,32)
96 204 alpha-cubebene NIST 62
2 II 26,203 11 (26,32)
96 204 copaene NIST 62
3 III 27,082 12 (13,08)
95 204 germacrene-D WILEY 229
4 IV 18,383 18 (4,16) 97 204
1H-cycloprop[e]azulene
NIST 12
[image:49.595.108.546.522.733.2]Identifikasi komponen-komponen senyawa kimia dalam minyak atsiri buah
kemukus menggunakan alat GC-MS-QP2010S SHIMADZU menghasilkan 30
puncak kromatogram yang dapat dilihat pada gambar 7. Dari 30 puncak yang
muncul dipilih 5 puncak yang merupakan puncak utama (lingkaran merah) yaitu
nomor 10, 11, 12, 18, dan 23 yang masing-masing diperkirakan mengandung
alpha-cubebene, copaene, germacrene-D, 1H-cycloprop[e]azulene, dan spathulanol.
Analisis kandungan minyak atsiri buah kemukus pada penelitian ini dilakukan
dengan analisis spektra massa yang didasarkan pada ”base peak” (puncak dasar)
dan Similarity Index (SI) dengan perbandingan spektra dari NIST 62 dan Wiley
299.LIB. Base peak merupakan puncak yang paling besar limpahannya dalam
spektrum dan diberi harga 100%. Jika nilai SI mendekati 100% maka senyawa yang
terdeteksi memiliki tingkat kemiripan dengan data pembanding. Peak nomor 18
dipilih dikarenakan peak nomor 20 yang lebih tinggi sama dengan peak 12 yang
diduga mengandung germacrene D.
Dari tabel 1 dapat diketahui bahwa minyak atsiri buah kemukus terdiri dari
golongan seskuiterpen yaitu alpha cubebene, copaene, germacrene D,
1H-cycloprop[e]azulene dan spatulanol. Struktur senyawa penyusun minyak atsiri
Gambar 8. Prediksi struktur kimia 5 senyawa dengan kelimpahan tertinggi menurut hasil GC-MS
Secara kimia, minyak atsiri buah kemukus terdiri dari senyawa golongan
monoterpen dan seskuiterpen berupa isoprena C10 dan C15 dengan titik didih yang
berbeda (titik didih monoterpen 140-180°C, titik didih seskuiterpen >200°C)
(Padmawinata, 1987).
Senyawa pada puncak dasar 10 dengan waktu retensi 25,380 menit dan SI
= 96 mirip dengan senyawa alpha-cubebene dengan rumus molekul C15H24. Spektra
massa ligan I dan spektra massa senyawa alpha-cubebene dapat dilihat pada
lampiran 5. Berdasarkan analisis data GC-MS, ligan I memiliki indeks kemiripan /
Similarity Index (SI) (SI) = 96 dengan alpha-cubebene, sehingga ligan I dapat 1H
cycloprop[e]azulene
alpha-cubebene copaene
germacrene D
dikatakan sebagai alpha-cubebene, yang merupakan senyawa golongan
seskuiterpen.
Senyawa pada puncak dasar 11 dengan waktu retensi 26,203 menit dan
SI=96 mirip dengan senyawa copaene dengan rumus molekul C15H24. Spektra
massa ligan II dan spektra massa senyawa copaene dapat dilihat pada lampiran 5.
Berdasarkan analisis data GC-MS, ligan II memiliki indeks kemiripan /Similarity
Index (SI) = 96 dengan copaene, sehingga ligan II dapat dikatakan sebagai copaene,
yang merupakan senyawa golongan seskuiterpen.
Senyawa pada puncak dasar 12 dengan waktu retensi 27,082 menit dan
SI=95 mirip dengan senyawa germacrene-D dengan rumus molekul C15H24.
Spektra massa ligan III dan spektra massa senyawa germacrene-D dapat dilihat
pada lampiran 5. Berdasarkan analisis data GC-MS, ligan III memiliki indeks
kemiripan (SI) = 95 dengan germacrene-D, sehingga ligan III dapat dikatakan
sebagai germacrene-D, yang merupakan senyawa golongan seskuiterpen.
Senyawa pada puncak dasar 18 dengan waktu retensi 18,383 menit dan
SI=97 mirip dengan senyawa 1H-cycloprop[e]azulene dengan rumus molekul
C15H24. Spektra massa senyawa 1H-cycloprop[e]azulene dapat dilihat pada gambar
12. Berdasarkan analisis data GC-MS, ligan IV memiliki indeks kemiripan (SI) =
97 dengan 1H-cycloprop[e]azulene, sehingga ligan IV dapat dikatakan sebagai
1H-cycloprop[e]azulene, yang merupakan senyawa golongan seskuiterpen.
Senyawa pada puncak dasar 23 dengan waktu retensi 7,92 menit dan SI=83
mirip dengan senyawa spathulanol dengan rumus molekul C15H24O. Spektra massa
GC-MS, ligan V memiliki indeks kemiripan (SI) = 83 dengan spathulanol, sehingga,
ligan V dapat dikatakan sebagai spathulanol, yang merupakan senyawa golongan
seskuiterpen.
Hasil GC-MS menunjukan bahwa 5 komponen utama dari minyak atsiri
buah kemukus (Piper cubeba L.f.) yang dianalisis pada penelitian ini, berbeda
dengan 5 komponen utama dari minyak atsiri buah kemukus yang dianalisis oleh
penelitian-penelitian sebelumnya. Perbedaan hasil analisis GC-MS minyak atsiri
dapat disebabkan oleh beberapa faktor, antara lain: perbedaan tempat/daerah
pengambilan sampel, perlakuan pasca panen misal pengeringan dan penyimpanan,
serta kondisi operasional alat yang digunakan dalam mendeteksi komponen
tersebut khususnya kolom yang digunakan.
Komponen kimia dari minyak atsiri bervariasi tergantung daerah geografi,
umur tanaman, iklim lokal, musim dan kondisi eksperimen (Yuksel et.al., 2006;
Senthilkumar, 2009). Selain itu juga perlakuan panen dan pasca panen dapat
mempengaruhi komposisi minyak atsiri (Olonisakun et.al., 2006).
E. Hasil Analisis Uji Aktifitas Antibakteri
Metode yang digunakan dalam uji antibakteri minyak atsiri buah kemukus
adalah metode difusi. Metode difusi dilakukan dengan cakram kertas menggunakan
bakteri Shigella flexneri yang merupakan bakteri yang bersifat patogen pada
manusia. Uji antibakteri ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan minyak atsiri
buah kemukus dalam menghambat pertumbuhan bakteri dengan mengetahui Kadar
Hambat Minimal (KHM) suatu bakteri. Pengujian aktivitas antibakteri minyak
difusi ini dipilih karena pada metode ini pertumbuhan bakteri dapat teramati dengan
jelas, sehingga dapat memudahkan dalam pengamatan terhadap bakteri uji.
Diameter hambat pertumbuhan bakteri ini ditandai dengan zona bening disekitar
cakram kertas, sedangkan warna keruh pada agar menunjukan adanya pertumbuhan
bakteri. Pengujian antibakteri ini juga dilakukan pada kontrol negatif yang berupa
pelarut dari sampel yaitu n-heksana, dan juga kontrol positif Ciprofloxacin5 μg/ml.
Pemilihan n-heksana, dikarenakan n-heksana tidak mempunyai aktivitas antibakteri
dan bersifat nonpolar sama seperti minyak atsiri sehingga kedua senyawa tersebut
dapat saling larut sesuai prinsip “like dissolved like”. N-heksana telah digunakan
sebagai pelarut minyak atsiri umbi teki (Cyperus rotundus L.) (Solihah, 2008). Data
[image:54.595.71.541.446.600.2]aktivitas penghambatan minyak atsiri buah kemukus dapat dilihat pada tabel 2.
Tabel 2. Hasil Diameter Zona Inhibisi Masing-Masing Konsentrasi Minyak Atsiri
Zat Uji Diameter Zona Inhibisi (DZI) (mm)
Rata-Rata DZI
Minyak Atsiri
Konsentrasi Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3
80% 12 10 11 11
40% 10 10 9 9,5
20% 9 8 8 8,5
10% 8 8 8 8
Kontrol Positif Ciprofloxacin 42 40 39 40,3
Kontrol Negatif N-Heksana 0 0 0 0
Dari tabel 2 dapat dilihat bahwa semakin besar konsentrasi minyak atsiri
buah kemukus maka semakin besar juga diameter zona inhibisi dan semakin besar
aktivitas penghambatan pertumbuhan bakteri. Semakin besar konsentrasi zat yang
media sehingga mempermudah penetrasi zat dalam menghambat pertumbuhan
bakteri (Pelczar, 1986).
Menurut CLSI (Clinical and Laboratory Standart Institute) kekuatan
antibakteri dibagi menjadi 3 yaitu susceptible (dapat diterima) jika menghasilkan
diameter zona inhibisi lebih dari 21 mm, intermediate jika memiliki zona hambat
antara 16 mm - 20 mm dan katagori resisten jika diameter zona inhibisi kurang dari
15 mm. Berdasarkan pengkategorian tersebut dalam penilitian ini diperoleh hasil
pada konsentrasi 80% minyak atsiri buah kemukus yang merupakan konsentrasi
tertinggi dengan rata-rata DZI tertinggi yaitu 11 mm dan masuk kategori resisten.
Aktivitas kerja minyak atsiri dalam menghambat pertumbuhan antibakteri yaitu
dengan menghambat enzim topoisomerase II (DNA gyrase). Uji kontrol positif
menggunakan antibiotik Ciprofloxacin dimana Ciprofloxacin merupakan terapi lini
pertama untuk diare basiler.
Ciprofloxacin merupakan antibiotika bakteriosida yang bekerja dengan
menghambat enzim topoisomerase II (DNA gyrase). Pengujian aktivitas antibakteri
terhadap Ciprofloxacin dilakukan dengan konsentrasi 5 μg/ml. Dengan 3 kali
replikasi menunjukan diameter zona inhibisi sebesar 42 mm, 40 mm, dan 39 mm
didapatkan hasil rata-rata 40,3 mm.
Selanjutnya untuk melihat signifikansi diantara hasil rata-rata setiap konsentrasi
tersebut dilakukan uji normalitas data sebagai syarat pengujian. Dari hasil uji
normalitas diketahui bahwa data yang digunakan pada penelitian ini berdistribusi
value untuk konsentrasi yaitu 0,538 (p>0,05). Untuk mengetahui pengaruh antara
masing-masing konsentrasi terhadap nilai DZI dilakukan uji one way ANOVA,
diperoleh hasil nilai signifikansi 0,02 (p<0,05) yang berarti terdapat pengaruh yang
F. Hasil Analisis Uji Penambatan Molekul 1. Visualisasi Sisi Aktif DNA gyrase subunit B
Untuk mengetahui sisi aktif dari protein DNA gyrase subunit B maka
dilakukan visualisasi protein target secara tiga dimensi melalui aplikasi
[image:57.595.195.461.250.452.2]Discovery Studio Visualizer. Hasil visualisasi ditunjukan pada gambar 9.
Gambar 9. Visualisasi sisi aktif protein DNA gyrase
subunit B (3TTZ)
2. Visualisasi Ligan dengan Marvin Sketch
Ligan yang digunakan untuk sampel uji penambatan molekul adalah
senyawa-senyawa seskuiterpen yang memiliki aktivitas antibakteri yang
signifikan. Berdasarkan hasil uji aktivitas antibakteri diketahui pada
konsentrasi minyak atsiri mulai 10% hingga 80% pertumbuhan bakteri
Shigella flexneri. Pada Analisis GC-MS diketahui bahwa minyak atsiri buah
kemukus memiliki kandungan senyawa seskuiterpen seperti mengandung
alpha-cubebene, copaene, germacrene-D, 1H-cycloprop[e]azulene, dan
Tabel 3. Visualisasi ligan menggunakan Marvin Sketch
Nama Ligan Visualisasi
2-[(3S,4R)-4-{[(3,4-
dichloro-5-methyl-1H- pyrrol-2-
yl)carbonyl]amino}-3-fluoropiperidin-
1-yl]-1,3-thiazole-5-carboxylic acid
Ciprofloxacin
alpha cubebene
copaene
germacrene-D
spathulanol
3. Interaksi Ligan terhadap Protein Target Visualisasi
Hasil penambatanantara ligan dan protein target akan menghasilkan
9 konformasi yang berisi informasi energi dari masing-masing konformasi.
Hal yang perlu diperhatikan dalam analisis hasil docking adalah melalui
energi ikatan (binding energy). Konformasi terbaik dapat dilihat melalui
fungsi scoring yang ditunjukan dalam energi ikatan atau binding energy
(ΔG) yang memiliki satuan dalam Kkal/mol. Nilai energi ikatan
menggambarkan kekuatan ikatan yang terjadi antara ligan dan protein
target.
Energi ikatan memiliki hubungan dengan konstanta inhibisi. Semakin
kecil nilai konstanta inhibisi maka akan semakin kecil pula energi ikatan.
Dari hal itu diketahui bahwa semakin kecil energi ikatan antara konstanta
inhibisi, maka interaksi antara ligan dan enzim akan semakin disukai
(Prasetia, 2011). Hasil skor penambatan molekul setiap konformasi setiap
ligan terhadap protein target dapat dilihat pada lampiran 10. Sedangkan nilai
energi ikatan dan konstanta inhibisi terbaik serta interaksi antara
Tabel 4. Interaksi Ligan dengan Protein target
Ligan Energi Ikatan
(Kkal/mol)
Protein
1H-cycloprop[e]azulene
-7,3 ILE 86, ILE102, ILE175
Ciprofloxacin -7,1 ASP81, GLU58, PRO87, GLY85,
ARG84, ARG44, THR173
alpha-cubebene -6,7 LEU205
germacrene-D -6,7 ASN54, SER55, VAL79, GLU 58,
ASP54
Copaene -6,4 ILE86, ILE175
2-[(3S,4R)-4-{[(3,4- dichloro-5-methyl-1H- pyrrol-2- yl)carbonyl]amino}-3-fluoropiperidin- 1-yl]-1,3-thiazole-5-carboxylic acid
-6,2 ILE51, ILE 86, ILE 102, ILE175, SER55, ASN54
Spathulanol -6,2 ILE86, PRO87
Berdasarkan tabel 4 senyawa yang memiliki energi ikatan paling
tinggi adalah 1H-cycloprop[e]azulene dengan energi ikatan sebesar -7,3
Kkal/mol dan mengikat residu dari protein target yaitu Isoleusin 86 (ILE86),
Isoleusin 102(ILE102), Isoleusin 175 (ILE175). Residu ligan asli antara lain
Isoleusin 51 (ILE51), Isoleusin 86 (ILE 86), Isoleusin 102 (ILE102),
Isoleusin 175 (ILE175), Serin 55 (SER55), Asparginin 54 (ASN54) Residu
ligan Ciprofloxacin (kontrol positif) antara lain Aspartic acid ke 81
(ASP81), Glutamic Acid 58 (GLU58), Prolin 58 (PRO87), Glisin 85
(GLY85), Arginin 84 (ARG84), Arginin 144 (ARG144) dan Threonine 173
(a)
[image:61.595.109.502.82.500.2](c) (b)
Gambar 10. Hasil Visualisasi (a) Ligan Asli, (b) Ciprofloxacin dan
G. Pembahasan
Kemukus merupakan salah satu tanaman yang mengandung
terpenoid yang merupakan metabolit sekunder pada tanaman yang memiliki
efek farmakologis seperti antivirus, antibakteri, antimalaria, antiradang,
penghambat sintesis kolesterol dan anti kanker (Nassar & Abdalrahim,
2010). Metode Kirby Bauer digunakan untuk menentukan sensitifitas
bakteri terhadap antibakteri. Dalam penelitian ini digunakan media Mac
Conkey dan menggunakan BHI (brain heart infusion) sebagai nutrien.
Penggunaan Mac Conkey sebagai media dipilih karena media ini spesifik
untuk bakteri gram negatif. Dalam metode ini digunakan cakram kertas
untuk mengaplikasikan agen antibakteri. Cakram kertas yang telah
diaplikasikan dengan masing-masing sampel selanjutnya akan menyerap
masing-masing konsentrasi larutan uji. Pengujian aktivitas antibakteri
dilakukan dengan variasi konsentrasi bertujuan untuk mengetahui
perbedaan nilai DZI antar konsentrasi. Nilai DZI dapat diinterpretasikan
untuk mengetahui KHM konsentrasi minyak atsiri. KHM berfungsi untuk
mengetahui konsentrasi minimal minyak atsiri yang dapat menghambat
pertumbuhan Shigella flexneri. Konsentrasi yang digunakan adalah 10%,
20%, 40%, 80%.
Dalam penelitian aktivitas antibakteri ini digunakan kontrol positif
Ciprofloxacin dan kontrol negatif n-heksana. Kontrol positif digunakan
sebagai pembanding aktivitas antibakteri dengan antibiotik yang digunakan
pelarut memiliki efek antibakteri atau tidak. Penggunaan Ciprofloxacin
sebagai kontrol positif disamping karena merupakan terapi lini pertama
pada pengobatan diare basiler juga dikarenakan ciprofloxacin dan anti
bakteri minyak atsiri buah kemukus memiliki kesamaan mekanisme yaitu
menghambat pertumbuhan DNA.
Hasil penelitian membuktikan bahwa masing-masing konsentrasi
mulai dari konsentrasi 10% memiliki aktivitas antibakteri. Menurut CLSI
menunjukan antibiotik Ciproflo
