BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.2. Hasil uji BSLT
Larutan induk dari ekstrak kental metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl yang telah dibuat terlebih dahulu kemudian diencerkan menjadi menjadi 5 konsentrasi, yaitu 1000 ppm, 250 ppm, 100 ppm, 50 ppm, dan 25 ppm yang akan digunakan untuk uji orientasi konsentrasi terlebih dahulu. Selain itu dibuat pula kontrol negatif berupa air laut dan larva udang tanpa penambahan ekstrak. Hal ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh air laut maupun faktor lain terhadap kematian larva. Sehingga dapat dipastikan bahwa kematian larva hanyalah akibat dari penambahan ekstrak yang dilakukan.
Setelah dilakukan uji orientasi konsentrasi untuk mendapatkan persentase kematian larva pada rentang 10 %-90 % maka didapatkan konsentrasi uji yaitu 1000 ppm, 250 ppm, 100 ppm, 50 ppm, dan 25 ppm.
Percobaan ini dilakukan dengan 3 kali replikasi/pengulangan (triplo) dengan tujuan agar mendapat data yang lebih baik dan lebih akurat. Larva yang telah berumur 36-48 jam dimasukkan ke dalam well plate masing-masing 10 ekor larva yang ditambahkan 1 ml air laut. Kemudian memasukkan masing-masing konsentrasi uji sebanyak 1 ml ke dalam well plate. Setelah 24 jam pasca penambahan ekstrak, dilakukan pengamatan kematian larva.
Hasil kematian larva Artemia salina Leach pada setiap sumur dibandingkan satu sama lain termasuk pada sumur kontrol negatif. Berikut ini adalah hasil penelitian dari uji konsentrasi ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl terhadap larva Artemia salina Leach.
Tabel 4.2 Pengaruh berbagai konsentrasi ekstrak metanol buah Phaleria
macrocarpa (Scheff) Boerl terhadap larva Artemia salina Leach.
Sumur ke
Angka Kematian Larva Artemia salina Leach
Kontrol negatif Konsentrasi ekstrak pada tabung uji (ppm)
12,5 25 50 125 500 1 1 2 4 4 9 0 2 1 2 3 7 8 0 3 1 2 4 7 10 0 Total Kematian 3 6 11 18 27 0 Rata-Rata kematian 0,10 ± 0 0,20 ± 0 0,36 ± 0,5774 0,60 ± 1,7321 0,90 ± 1,1547 0,00 ± 0 Persentase Kematian (%) 10 20 36 60 90 0
Total larva yang digunakan pada percobaan ini dengan 3 kali percobaan sebanyak 30 ekor. Sehingga total larva yang digunakan pada seluruh percobaan adalah 180 ekor. Total kematian diperolah dengan menjumlah kematian karva pada setiap konsentrasi. Rata–rata kematian diperoleh dari total kematian dibagi total larva yang digunakan tiap konsentrasi. Persentase kematian didapatkan dengan mengalikan rata–rata kematian dengan 100.
Dari data pada tabel 4.1 menunjukkan bahwa adanya hubungan antara konsentrasi ekstrak dengan total kematian larva.
Gambar 4.1 Grafik Persentase mortalitas larva Artemia salina Leach pada uji toksisitas ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl
Berdasarkan grafik di atas maka menunjukkan bahwa jumlah kematian larva pada konsentrasi 12,5 ppm adalah 10 % sedangkan pada konsentrasi 25 ppm sebanyak 20 %, hal ini menunjukkan peningkatan kematian larva sebesar 10 %. Lalu pada konsentrasi 50 ppm, total kematian larva yaitu 36 %. Jika dibandingkan dengan total kematian larva pada konsentrasi 125 ppm, maka akan terlihat peningkatan angka kematian sebesar 24 %. Lalu pada konsentrasi 500 ppm angka kematiannya juga meningkat jika dibandingkan dengan konsentrasi 125 ppm yaitu sebesar 30 %. Sehingga bisa disimpulkan bahwa peningkatan konsentrasi yang semakin tinggi akan meningkatkan kematian larva.
Penggunaan larva Artemia salina Leach pada uji BSLT ini karena larva ini memiliki kesamaan dengan mamalia. Seperti memiliki DNA-dependent RNA
Sedangkan telur Artemia salina Leach yang digunakan pada percobaan yaitu larva yang berusia 36-48 jam. Hal ini disebabkan karena setelah berumur 24 larva akan memasuki fase instar I dimana pada tahap ini larva belum bisa makan karena mulut dan saluran pencernaannya belum terbentuk secara sempurna.
Lalu setelah 12-24 jam setelah menetas instar I akan bermetamorfosis menjadi instar II, dimana instar II sudah memiliki mulut dan sistem pencernaannya telah sempurna.24,25 Sehingga ekstrak yang ada di lingkungan larva masuk ke dalam tubuh larva dan menyebabkan kematian larva. Lalu pada saat larva menjadi instar III atau lebih dari 48 jam, tubuhnya akan bermetamorfosis lebih lanjut dan meningkatkan ketahanan tubuh larva. Oleh karena itu, pada penelitian ini digunakan larva yang berumur 36–48 jam.
Pada buah mahkota dewa mengandung beberapa senyawa metabolit sekunder seperti alkaloid, terpenoid, polifenol, saponin, tanin, resin dan flavonoid. Senyawa–senyawa inilah yang menyebabkan kematian pada larva.
Mekanisme kematian pada larva disebabkan oleh adanya alkaloid, terpenoid dan glikosid yang berperan sebagai stomach poisoning (racun perut). Proses ini menyebabkan larva mengalami gangguan pada saluran cernanya. Selain itu, senyawa ini juga menghambat reseptor rasa yang berada di permukaan mulut larva sehingga larva tidak bisa mendeteksi makanan dan akhirnya mati karena kelaparan.31,32
Berdasarkan kriteria standar larva dikatakan mati apabila larva tidak bergerak selama 10 detik observasi.33 Observasi kematian larva dilakukan setelah 24 jam pemberian ekstrak. Namun untuk memastikan bahwa larva benar-benar telah mati maka dilakukan pewarnaan larva menggunakan trypan blue. Dimana larva yang mati akan menyerap warna biru sehingga larva akan terlihat berwarna biru ketika dilihat dengan menggunakan mikroskop.34
4.3 Penetapan LC50
Tabel 4.3 Perhitungan LC50 dengan menggunakan Metode probit.
m = ∑ (X) ∑ (Y) –n ∑(XY) = 2,3786 (∑ (X))2 - n ∑ (X2)
b = ∑ (X) ∑ (XY) - ∑ (X2) ∑ (Y) = 0,5542 (∑ (X))2 - n ∑ (X2)
Nilai di atas dimasukkan ke dalam persamaan garis lurus y = mX + b, dimana nilai y merupakan nilai probit 50 % dari persentase kematian lalu X merupakan log konsentrasi serta antilog X merupakan LC50.
Konsentrasi Log Persentase Probit (Y) X2 Y2 XY Konsentrasi (X) Kematian 12.5 1.09 10 3.72 1.19 13.83 4,05 25 1.39 20 4.17 1,39 17.39 5,79 50 1.69 36 4.64 2.87 21.53 7,84 125 2.09 60 5.25 4.37 27.56 10,97 500 2.69 90 6.28 7.24 39.44 16,89 Jumlah 8,95 24.06 17,06 119,75 45,54
Gambar 4.2 Grafik Analisis Regresi Linier Konsentrasi Ekstrak Metanol Buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl
Analisis Probit Y = mX + b Y = 1,596x + 1,953 5 = 1,596x + 1,953 1,596x = 3,047 X = 3,047 / 1,596 = 1,909 LC50 = antilog X = 81,09 ppm
Hasil uji toksisitas ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl yang ditunjukkan oleh grafik di atas dapat disimpulkan bahwa semakin tinggi konsentrasi suatu ekstrak maka akan semakin tinggi tingkat kematian larva.
Perhitungan LC50 dengan menggunakan Microsoft Office Excel didapatkan persamaan garis lurus Y = 1,596x + 1,953, lalu dimasukkan angka 5 pada nilai Y sehingga didapatkan LC50 81,09 ppm. Perhitungan melalui kedua metode ini
menghasilkan LC50 yang sama–sama termasuk ke dalam kategori toksik. LC50
yang dikatakan toksik adalah dengan nilai kurang dari 1000 ppm.
Sedangkan dari penelitian Vivi L, dkk pada tahun 2006 disebutkan bahwa LC50 dari ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl adalah 2,46
ppm. Hal penelitian tersebut sangat berbeda jauh dengan hasil yang didapatkan pada penelitian ini. Hal ini dikarenakan metode ekstrak yang dilakukan pada penelitian tersebut merupakan ekstraksi bertingkat. Sehingga ekstrak yang didapatkan merupakan ekstrak yang lebih banyak mengandung zat aktif dari buah
Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl baik jumlah maupun senyawa-senyawanya.1
Sehingga dari analisis data dan perhitungan nilai LC50 menunjukkan bahwa
ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl memiliki potensi toksik dan dapat digunakan sebagai anti-kanker.
Potensi antikanker tersebut diduga karena buah mahkota dewa memiliki berbagai macam kandungan senyawa- senyawa metabolit sekunder yang bersifat toksik. Salah satu senyawa yang terkandung di dalam buah mahkota dewa adalah flavonoid. Berdasarkan beberapa teori, flavonoid memiliki beberapa efek pada sel kanker yaitu : 35,36,37,38
1. Sebagai antioksidan, flavonoid dapat menimbulkan terjadinya fragmentasi DNA yang disebabkan oleh adanya oksigen reaktif seperti radikal hidroksil sehingga mengaktifkan jalur apoptosis sel.
2. Flavonoid juga menghambat transduksi sinyal ke inti melalui inhibisi protein kinase sehingga menghambat proliferasi sel kanker.
3. Menghambat pertumbuhan suatu keganasan dengan menginhibisi reseptor tirosin kinase. Reseptor ini merupakan reseptor yang berperan dalam meningkatkan pertumbuhan keganasan.
4. Meningkatkan sensitivitas agen kemoterapi dan menurunkan angka resistensi agen kemoterapi.
Selain karena adanya kandungan flavonoid yang diduga sebagai senyawa toksik yang dikandung oleh buah mahkota dewa, senyawa–senyawa lain juga berperan potensinya sebagai antikanker. Oleh karena itu, dengan LC50 < 1000 ppm
buah mahkota dewa dikatakan sebagai obat yang memiliki potensi sebagai antikanker.21,1
Namun sebelum dijadikan sebagai obat antikanker, terlebih dahulu tanaman ini harus melewati beberapa tahap uji farmakologi yang telah ditentukan untuk membuktikan kualitas, keamanan dan efek samping yang ditimbulkan. Selain itu,
bahan baku yang digunakan harus memenuhi standar yang telah ditetapkan juga, sehingga menjamin keamanan saat digunakan oleh masyarakat. Hal inilah yang membuat setiap bahan alam yang akan dikembangkan menjadi obat selain melewati beberapa tahap uji farmakologi, harus melwati uji klinik juga.6,7,8
4.4 Keterbatasan Penelitian 4.4.1 Waktu
Pada penelitian ini, sebenarnya masih banyak yang harus dilakukan untuk mendapatkan hasil yang lebih baik. Tetapi karena keterbatasan waktu penelitian maka ada beberapa hal yang tidak dilakukan seperti penghitungan susut pengeringan, kadar abu dan kadar air ekstrak.
Lalu pada proses untuk memastikan kematian larva, yang pada umumnya menggunakan trypan blue tidak dilakukan pada penelitian ini. Hal ini disebabkan karena keterbatasan waktu dan tempat untuk mendapatkan trypan blue.34
Selain itu, pada awalnya penelitian ini akan dibandingkan dengan obat antikanker yaitu methotrexate. Namun setelah penelitian ini berjalan, tidak terdapat cukup waktu untuk mengerjakannya.
4.4.2 Jenis Pelarut Tunggal
Pelarut yang digunakan pada penelitian ini hanya satu yaitu metanol. Hal ini disebabkan karena metode ekstraksi yang digunakan adalah metode maserasi biasa, bukan dengan metode maserasi bertingkat. Metanol merupakan pelarut yang polar sehingga hanya akan menarik senyawa aktif yang larut dalam pelarut polar juga. Oleh karena itu, pada penelitian ini LC50 yang didapatkan berbeda
dengan penelitian sebelumnya.
Jika hanya dengan menggunakan satu jenis pelarut lalu menghasilkan LC50
yang masuk dalam kategori toksik (kurang dari 1000 ppm), maka hasil yang didapatkan dengan menggunakan beberapa jenis pelarut akan menghasilkan LC50
4.4.3 Konsentrasi ekstrak yang untuk dosis aman
Pada penelitian ini yang dilakukan adalah untuk menentukan nilai LC50 suatu
ekstrak. Untuk penentuan dosis aman tidak dilakukan pada penelitian ini karena keterbatasan waktu. Namun jika untuk mengetahui bahwa suatu ekstrak mempunyai aktivitas toksik maka bisa ditentukan dengan melihat LC50 yang lebih
39 5.1 Simpulan
1. Rendemen ekstrak dari ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl adalah 27,27 %.
2. Ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl memiliki aktivitas sitotoksik terhadap larva Artemia salina Leach LC50nya adalah 81,09 ppm
sehingga masuk dalam kategori toksik karena memiliki LC50 < 1000 ppm.
5.2 Saran
1. Untuk mendapatkan hasil hitungan kematian larva yang tepat, sebaiknya perhitungannya kematian larva dilakukan oleh 2 orang atau lebih.
2. Dilakukan penelitian dengan membandingkan ekstrak metanol buah Phaleria
macrocarpa (Scheff) Boerl dengan obat anti-kanker sebagai kontrol
positifnya.
3. Dilakukan penelitian dengan pengukuran susut pengeringan, kadar air, kadar abu serta penggunaan trypan blue dalam memastikan kematian larva.
40
DAFTAR PUSTAKA
1. Lisdawati V, Wiryowidagdo S dan Kardono LB. Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) dari berbagai fraksi ekstrak daging buah dan kulit biji makota dewa
(Phaleri macrocarpa). Bul.Penelitian Kesehatan Vol. 34 No. 3; 2006: 111-118.
2. Lisdawati V. Kajian terhadap prospek pengembangan bahan bioaktif buah mahkota dewa (P. macrocarpa) sebagai kandidat New Chemical Entity untuk pengobatan kanker (Sitostatika). Bul.Penelitian Kesehatan Vol. 37 No. 1; 2009: 23-32.
3. Pisutthanan S, et al. Brine Shrimp lethality activity of thai medicinal plant in the Family Maliaceae. Naresuan University Journal Vol.12 No.2; 2004: 13-18.
4. Meyer BN, et al. Brine shrimp: a convenient general bioassay for active plant constituent. Planta Medica; 1982.
5. Menkes RI. Farmakope Herbal Indonesia Edisi Pertama. Jakarta: Menkes; 2009.
6. Sukandar EY. Tren dan paradigma dunia farmasi. Industri-klinik-teknologi kesehatan. Bandung : Institut Teknologi Bandung; 2004.
7. Menkes RI. Pedoman Fitofarmaka. Jakarta: Menkes; 1992.
8. Yuningsih R. Pengobatan tradisional di unit pelayanan kesehatan. Info singkat kesejahteraan sosial Vol. IV No. 05/I/P3DI/Maret/2012; 2012: 9-12.
9. Widowati L. Kajian hasil penelitian mahkota dewa. Jurnal bahan alam Indonesia Vol. 4 No. 1; 2005: 223-227.
10. Hendra R, et al. Antioxidant, Anti-inflammatory and cytotoxicity of Phaleria
macrocarpa (Boerl.) Scheff fruit. BMC complementary & alternative medicine,
Vol. 11, No.110; 2011.
11. Meiyanti, et al. Efek hipoglikemik daging buah mahkota dewa (Phaleria
macrocarpa (Scheff.) Boerl.) terhadap kadar gula darah pada manusa sehat
setelah pembebanan glukosa. Universa medicina Vol. 25 No. 3; 2006: 114-120.
12. Rohyami Y. Penentuan Kandungan flavonoid dari ekstrak metanol daging buah mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl). [Skripsi]. Yogyakarta: Universitas Islam Indonesia; 2008
13. Dewanti T, Wulan SN dan Nur Indira. Aktivitas antioksidan dan antibakteri produk kering, instan dan effervescent dari buah mahkota dewa (Phaleria
macrocarpa (Scheff.) Boerl). Malang: Jurnal Teknologi Pertanian Vol. 6 No. 1
Universitas Brawijaya; 2005: 29-36.
14. Anonim. Parameter standar umum ekstrak tumbuhan obat. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, Direkorat Pengawasan Obat Tradisional; 2000: 3-6 dan 9-12.
15. Agoes, Goeswin. Teknologi bahan alam. Bandung: Penerbit ITB Press; 2007: 11- 14 dan 21-23.
16. Tiwari P, et al. Phytochemical screening and extraction: A review. Internationale Pharmaceutica Sciencia (IPS) Vol. 1. Jan-March 2011.
17. Amelia P. Isolasi, elusidasi struktur dan aktivitas antioksidan senyawa kimia dari daun Garcinia benthami Pierre. [Tesis]. Depok: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia; 2011.
18. Priyanto. Toksikologi: mekanisme, terapi antidotum, dan penilaian resiko. Lembaga Studi dan Konsultasi Farmakologi Indonesia (LESKONFI); 2009.
19. Harmita dan Radji M. Buku ajar analisis hayati Edisi 3. Jakarta : EGC; 2008.
20. Landis, Wayne G. Introduction to environmental toxicology molecular substuctures to ecological landscape. Fourth edition. USA: CRC Press; 2011: 52.
21. McLauughlin JL dan Rogers LL. The use of biological assays to evaluate botanicals. USA: Drug Information Journal Vol. 32; 1998: 512-524.
22. Widianti A dan Suhardjono. Uji toksisitas akut ekstrak etanol buah cabai rawit
(Capsicum frutescens) terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode Brine
shrimp lethality test (BST). Semarang : Universitas Diponegoro; 2010
23. Asem A, Pouyani NR dan Escalente PD LR. The genus Artemia Leach, 1819 (Crustaceae: Branchiopoda). True and false taxonomical descriptions. Iran : Lat. Am. J Aquat Res Vol. 38; 2010: 501-506.
24. Ramdhini, RN. Uji toksisitas terhadap Artemia salina Leach dan toksisitas akut komponen bioaktif Pandanu conoideus var. Conoideus Lam sebagai kandidat antikanker. [Skripsi]. Surakarta: Universitas Sebelas Maret; 2010.
25. Panjaitan, RB. Uji toksisitas akut ekstrak kulit batang pulasari (Alyxiae cortex) dengan metode brine shrimp lethality test (BST). [Skripsi]. Yogyakarta: Universitas Sanata Dharma; 2011.
26. Panggabean, MG. Teknik penetasan dan pemanenan Artemia salina Leach. Jakarta: Pusat Penelitian Ekologi Laut, Lembaga Oseanologi Nasional-LIPI. Oseana Vol IX No. 2; 1984: 57-65
27. Gajardo, Gonzola M dan Beardmore, John A. The brine shrimp Artemia : adapted to critical life conditions. Chile: Frotiers in Physiology; 2012.
28. Utomo, DP. Analisis matematis dan ekonomis penggunaan metanol dan etanol
pada kompor “HD”. Malang: Jurnal teknik industri, Vol 11 No 1; Februari 2011:
29. Anonim. Methanol. Europe: International Programme on Chemical Safety (IPCS)
and European Commission; 2012.
http://www.inchem.org/documents/icsc/icsc/eics0057.htm (Diunduh September 2014)
30. Amalia FR, et al. Pengaruh Glutathione terhadap kualitas semen kambing Boer
Post Thawing dalam pengencer yang mengandung Dimetylsulfoxie (DMSO).
Malang: Universitas Brawijaya; 2012.
31. Rita WS, Suirta IW, Sabikin A. Isolasi & Identifikasi Senyawa Yang Berpotensi Sebagai Antitumor Pada Daging Buah Pare (Momordica charantia L.). Jurusan Kimia FMIPA Universitas Udayana, Bukit Jimbaran. Jurnal Kimia Vol.2; 2008.
32. Nguyen HH, Widodo S. Momordica L. In: Medicinal and Poisinous Plant Research of South-East Asia 12. De Padua L. S. N. Bunyapraphatsana and R.H. M. J. Lemmens (eds.). Pudoc Scientific Publisher. Wageningen, the Netherland; 1999: 353-359.
33. Rolliana, ER. Uji toksisitas akut ekstrak etanol Daun Kamboja (Plumeria alba L) terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BST). [Skripsi]. Semarang: Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro; 2010.
34. Perry SW, et al. In Situ Trypan blue staining of monolayer cell cultures for permanent fixation and mounting. New York: University of Rochester Medical Center. BioTechniques Vol. 22 No.2; 1997.
35. Ogata S, et al. Apoptosis induced by the flavonoid from lemon fruit (citrus limon BURM. F.) and its metabolites in HL-60 cells. Japan: Biosci Biotechnol Vol 64 No 5; 2000: 1075-1078. PMID 10879486. Available from: http://www.ncbi.nlm
36. Vizcaino F, et al. The flavonoid quercetininduced apotosis and inhibits JNK activation in intimal vascular smooth muscle cells. London: Biochemical and Biophysical Research communications Vol 346 No 3; 4 Agustus 2006: 919-925. Available from: http://www.sciencedirect.com.
37. Ren W, et al. Tartary Buckwheat Flavonoid Activates caspase 3 And Induces Hl- 60 Cell apoptosis. China: Clin Pharmacol Vol 23 No 8; 2001: 427-432. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11838316.
38. Demeule M et al. Grean tea catechin as novel antitumor and antiangiogenic compounds. Canada: Curr. Med. Chem-Anti-Cancer Agent Vol 2 No 4; 2002: 441-463. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12678730.
45 LAMPIRAN
Lampiran 1
