HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Aktivitas Degradasi AHL
Bacillus cereus INT1c dan Bacillus thuringiensis SGT3g dikonfirmasi memiliki aktivitas degradasi AHL pada Chromobacterium violaceum sebagai bioindikatornya. Aktivitas degradasi AHL ditandai dengan zona tidak berwarna ungu di sekitar kertas cakram pada kultur C. violaceum (Gambar 4). Aktivitas degradasi AHL oleh kedua isolat bakteri tersebut menghasilkan indeks degradasi AHL sebesar 0.23 untuk INT1c dan 0.12 untuk SGT3g (Tabel 1).
Gambar 4 Konfirmasi aktivitas degradasi AHL kultur C. violaceum oleh (a) kontrol negatif media LB, (b) isolat B. cereus INT1c, dan (c) isolat B. thuringiensis SGT3g
Tabel 1 Penghambatan produksi violacein C. violaceum oleh B. cereus INT1c dan B. thuringiensis SGT3g
Kode isolate Diameter zona degradasi AHL
(mm) Indeks degradasi AHL
INT1c 16 0.23
SGT3g 14.5 0.12
Kurva Pertumbuhan Bakteri
Pengukuran kekeruhan kultur B. cereus INT1c dan B. thuringiensis SGT3g selama inkubasi menunjukkan pertumbuhan yang cepat pada 6 jam pertama. Kedua kultur bakteri menunjukkan fase pertumbuhan eksponensial sampai umur 6 jam inkubasi selanjutnya mengalami fase pertumbuhan stasioner sampai umur 28 jam inkubasi (Gambar 5). Fase lag tidak teramati pada kedua kultur. Sepanjang pertumbuhan kedua bakteri, nilai log dari jumlah sel kultur bakteri B. cereus INT1c dan B. thuringiensis SGT3g tidak jauh berbeda atau beriringan (Gambar 5).
13
Gambar 5 Kurva pertumbuhan kultur B. cereus INT1c dan B. thuringiensis SGT3g pada media LB
Aktivitas Penghambatan Patogenitas Bakteri Fitopatogen
Penghambatan QS fitopatogen pada tanaman tembakau diamati dari warna dan luas jaringan daun yang terkena nekrotik pada titik-titik inokulasi. Hasil pengamatan menunjukkan daun pada tanaman kontrol negatif tidak mengalami gejala nekrotik, sedangkan daun pada tanaman kontrol positif menunjukkan adanya gejala nekrotik. Tanaman yang telah disemprot dengan supernatan B. cereus INT1c dan B. thuringiensis SGT3g menunjukkan intensitas yang lebih ringan dibandingkan kontrol positifnya (Tabel 2).
Tabel 2 Kondisi daun tembakau yang tidak diinokulasi (kontrol negatif) dan yang diinokulasi patogen (INT1c, SGT3g, kontrol positif) 1 minggu setelah inokulasi
Isolat Kontrol Negatif INT1c SGT3g Kontrol Positif
X. oryzae pv. oryzae P. syringae pv. glycinea
Luas nekrotik terkecil pada perlakuan penghambatan X. oryzae pv. oryzae ditunjukkan oleh B. cereus INT1c dengan luas sebesar 0.1 cm2 (Tabel 3) dan persentase penghambatan 85.6% serta persentase gejala nekrotik 0.04% (Tabel 4).
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 0 5 10 15 20 25 30 35 Log d ar i ju m lah se l Waktu (jam) INT1c SGT3g
Sementara itu, penghambatan P. syringae pv. glycinea terbesar ditunjukkan oleh B. thuringiensis SGT3g dengan luas nekrotik pada daun sebesar 0.1 cm2 dan persentase penghambatan 90.5% serta persentase gejala nekrotik 0.05% (Tabel 3). Berdasarkan hasil, isolat B. cereus INT1c berpotensi untuk diujikan secara in vivo ke tanaman padi untuk menghambat patogenitas X. oryzae pv. oryzae dan isolat B. thuringiensis SGT3g berpotensi untuk diujikan secara in vivo ke tanaman kedelai untuk menghambat P. syringae pv. glycinea.
Tabel 3 Intensitas nekrotik berdasarkan luas dan warna/ keadaan jaringan pada daun tembakau pada pengamatan 1 minggu setelah inokulasi
Perlakuan Luas Nekrotik (cm2) Warna Jaringan Intensitas Nekrotik PGN (%) PPN (%) Kontrol Positif
P. syringae pv. glycinea 1.4 Coklat ++++ 0.5 - X. oryzae pv. oryzae 0.8 Coklat ++++ 0.3 - INT1c
P. syringae pv. glycinea 0.2 Kuning ++ 0.08 85.2 X. oryzae pv. oryzae 0.1 Kekuningan + 0.04 85.6 SGT3g
P. syringae pv. glycinea 0.1 Kekuningan + 0.05 90.5 X. oryzae pv. oryzae 0.2 Kuning ++ 0.07 73.5
Keterangan : ++++ = berat ++ = ringan +++ = sedang + = sangat ringan
PGN=Persentase Gejala Nekrotik, PPN=Persentase Penghambatan Nekrotik
Gambar 6 Persentase luas jaringan nekrotik daun tembakau pada pengamatan 1 minggu setelah inokulasi fitopatogen (Psg) Pseudomonas syringae pv. glycinea dan (Xoo) Xanthomonas oryzae pv. oryzae
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
Kontrol Positif INT1c SGT3g
P er sent a se G ej a la Nek ro sis ( %) Psg Xoo
15
Penghambatan Patogenitas P. syringae pv. glycinea In Vivo pada Daun Kedelai
Pengujian secara in vivo penghambatan patogenitas P. syringae pv. glycinea oleh B. thuringiensis SGT3g pada tanaman kedelai menunjukkan aktivitas penghambatan yang tidak jauh berbeda (Gambar 7). Persentase penghambatan nekrotik oleh B. thuringiensis SGT3g terhadap P. syringae pv. glycinea sebesar 96% dengan persentase gejala penyakit sebesar 0.1% ditunjukkan pada varietas Anjasmara sedangkan pada varietas Wilis menunjukkan persentase penghambatan nekrotik oleh B. thuringiensis SGT3g terhadap P. syringae pv. glycinea sebesar 95.4% dan dengan persentase gejala penyakit sebesar 0.2% (Tabel 4). Berdasarkan hasil dapat diketahui bahwa penghambatan patogenitas P. syringae pv. glycinea oleh B. thuringiensis SGT3g pada varietas Anjasmara dan Wilis tidak berbeda jauh.
Gambar 7 Kondisi daun kedelai varietas Anjasmara dan Wilis pada pengamatan 2 minggu setelah inokulasi P. syringae pv. glycinea
Tabel 4 Intensitas nekrotik, persentase gejala nekrotik (PGN), persentase penghambatan nekrotik (PPN) berdasarkan luas nekrotik serta warna/ keadaan jaringan daun kedelai pada pengamatan 2 minggu setelah inokulasi
Perlakuan Luas Nekrosis (cm2) Warna Jaringan Intensitas Nekrosis PGN (%) PPN (%) Anjasmara
Kontrol Positif 0.6 Coklat +++ 3.3 -
SGT3g 0.03 Kekuningan + 0.1 96
Wilis
Kontrol Positif 0.6 Coklat +++ 3.8 -
SGT3g 0.03 Kekuningan + 0.2 95.4
Keterangan : ++++ = berat ++ = ringan +++ = sedang + = sangat ringan
Penghambatan Patogenitas X. oryzae pv. oryzae In Vivo pada Daun Padi
Pengujian secara in vivo penghambatan patogenitas X. oryzae pv. oryzae oleh B. cereus INT1c pada tanaman padi menunjukkan adanya aktivitas penghambatan yang dapat dilihat pada gejala nekrotik tanaman padi kontrol positif lebih panjang daripada tanaman padi dengan perlakuan penyemprotan B. cereus INT1c (Gambar 8). Persentase penghambatan nekrotik terbesar oleh B. cereus INT1c terhadap X. oryzae pv. oryzae ditunjukkan pada varietas IRBB7 sebesar 93.6% dengan persentase gejala penyakit sebesar 1.5 % sedangkan persentase penghambatan nekrotik terkecil ditunjukkan pada varietas Kencana Bali sebesar 69.7% dan dengan persentase gejala penyakit sebesar 17.6% (Tabel 5). Berdasarkan hasil dapat diketahui bahwa penghambatan patogenitas X. oryzae pv. oryzae oleh B. cereus INT1c terbesar adalah pada varietas IRBB7 kemudian IRBB5 dan yang terkecil adalah Kencana Bali.
Gambar 8 Kondisi daun padi varietas Kencana Bali (a), IRBB5 (b), dan IRBB7 (c) pada pengamatan 2 minggu setelah inokulasi kultur X. oryzae pv. oryzae
17
Tabel 5 Intensitas nekrotik, persentase gejala nekrotik (PGN), persentase penghambatan nekrotik (PPN) berdasarkan panjang nekrotik serta warna/ keadaan jaringan daun padi pada pengamatan 2 minggu setelah inokulasi Perlakuan Panjang Nekrosis (cm) Warna Jaringan Intensitas Nekrosis PGN (%) PPN (%) IRBB7
Kontrol Positif 7. 4 Coklat Kering +++ 24.2
INT1c 0.5 Kekuningan + 1.5 93.7
IRBB5
Kontrol Positif 12.1 Coklat Kering +++ 54.7
INT1c 1.3 Kekuningan + 5.8 89.5
Kencana Bali
Kontrol Positif 21.3 Coklat Kering ++++ 58
INT1c 6.4 Kekuningan ++ 17.6 69.7
Keterangan : ++++ = berat ++ = ringan +++ = sedang + = sangat ringan
PGN=Persentase Gejala Nekrotik, PPN=Persentase Penghambatan Nekrotik
Pembahasan
Afiah (2011) melaporkan bahwa Bacillus cereus INT1c dan Bacillus thuringiensis SGT3g terbukti positif memiliki kemampuan untuk mendegradasi AHL. Salah satu bioindikator untuk menyeleksi adanya aktivitas degradasi AHL pada isolat B. cereus INT1c dan B. thuringiensis SGT3g ialah dengan menggunakan Chromobacterium violaceum. C. violaceum merupakan bakteri Gram negatif yang melakukan quorum sensing dengan menggunakan senyawa AHL untuk menghasilkan pigmen berwarna ungu (violacein) (McClean et al. 1997). Zona tidak berwarna ungu di sekitar kertas cakram menunjukkan adanya aktivitas degradasi AHL.
Isolat B. cereus INT1c dan B. thuringiensis SGT3g terbukti memiliki aktivitas degradasi AHL dengan indeks degradasi sebesar 0.23 untuk isolat B. cereus INT1c dan 0.12 untuk isolat B. thuringiensis SGT3g. Difusi AHL-laktonase yang terkandung dalam supernatan kultur B. cereus INT1c dan B. thuringiensis SGT3g dari kertas cakram ke media di sekitarnya menyebabkan degradasi senyawa AHL tersebut, sehingga C. violaceum yang tumbuh di sekitar paper disc tidak dapat berkomunikasi yang menyebabkan pigmen violacein tidak dapat diproduksi. AHL-laktonase secara spesifik menghidrolisis cincin lakton pada molekul AHL (Wang et al. 2004). Enzim ini stabil pada suhu 28-50ºC dan pH 6-9 (Sakr et al. 2013).
Hasil dari penelitian ini selaras dengan penelitian Dong et al. (2002) yang melaporkan bahwa B. thuingiensis dan B. cereus memiliki aktivitas AHL-laktonase. Lee et al. (2002) juga memaparkan bahwa ada aktivitas degradasi AHL oleh B. thuringiensis yang disandikan oleh gen aiiA. Cao et al. (2012) juga
memaparkan bahwa B. thuringiensis menunjukkan aktivitas degradasi AHL yg tinggi. Sementara itu, penelitian Medina-Martinez et al. (2011) mendapatkan hasil bahwa B. cereus berkompeten dalam mendegradasi AHL.
Anzhou et al. (2013) memaparkan bahwa produksi AHL-laktonase oleh Bacillus sp. merupakan salah satu bentuk strategi bertahan hidup dalam lingkungan stres karena fluktuasi kondisi fisik dan ketersediaan nutrisi yang terbatas. Bacillus sp. menggunakan aktivitas anti-QS agar mendapatkan lebih banyak nutrisi, melalui penggangguan sinyal AHL sebagai bentuk kompetisi dengan bakteri lain atau degradasi molekul AHL sebagai sumber energi.
Sepanjang pertumbuhan kedua isolat bakteri, nilai log dari jumlah sel kultur isolat bakteri B. cereus INT1c dan B. thuringiensis SGT3g tidak jauh berbeda atau beriringan (Gambar 5). Namun fase lag pada kurva pertumbuhan kedua isolat tidak teramati. Hal ini mengindikasikan bahwa kedua isolat bakteri tersebut mampu beradaptasi dengan cepat. Fase lag merupakan fase adaptasi bakteri yang ditandai dengan tidak ada pertambahan nyata pada populasi sel, namun sel mengalami pertambahan massa dan komposisi kimiawi serta peningkatan aktivitas metabolisme (Dias 2003). Hal ini menunjukkan bahwa tingkat pertumbuhan B. cereus INT1c dan B. thuringensis SGT3g tidak jauh berbeda.
Bakteri Bacillus sp. merupakan bakteri Gram positif yang mampu membentuk endospora pada kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan sehingga dapat bertahan hidup. Kemampuan dalam membentuk endospora menjadikan Bacillus sp. banyak digunakan dalam industri secara komersil karena dapat bertahan lama dan beradaptasi dengan formula dan bahan-bahan kimia yang diaplikasikan dalam tanah pertanian (Bai et al. 2003). Bakteri ini tergolong dalam bakteri aerob dan anaerob fakultatif (Holt et al. 1994). Bakteri Bacillus sp. mempunyai kemampuan sebagai biokontrol penyakit tanaman (Zuraidah 2011).
Pengujian aktivitas penghambatan patogenitas bakteri fitopatogen Pseudomonas syringae pv. glycinea dan Xanthomonas oryzae pv. oryzae oleh isolat bakteri B. cereus INT1c dan B. thuringensis SGT3g menggunakan tanaman uji tembakau. Tanaman tembakau digunakan untuk menyeleksis isolat mana yang dapat menghambat patogenitas bakteri fitopatogen P. syringae pv. glycinea dan X. oryzae pv. oryzae paling baik. Tanaman tembakau memiliki reaksi hipersensitivitas sehingga reaksi pengujian lebih cepat muncul dibandingkan dengan tanaman lain (Widyawati 2008). Menurut Zhu et al. (2000) isolat yang menghasilkan reaksi hipersensitif (HR) positif akan muncul gejala nekrotik. Reaksi hipersensitif merupakan proses kematian sel yang cepat dan terlokalisasi. Proses kematian sel disebabkan oleh agregasi sitoplasma, penghentian aliran sitoplasma, hilangnya permeabilitas membran sel, meningkatnya respirasi, akumulasi dan oksidasi senyawa fenol dan pembentukan fitoaleksin. Reaksi ini muncul pada tanaman yang terinfeksi saat pengenalan patogen yang merupakan usaha untuk menghambat pertumbuhan patogen. Nekrosis ialah munculnya bercak gelap dan berubah menjadi kuning kecoklatan yang menandakan terjadi kematian jaringan tanaman akibat terinfeksi patogen setelah inokulasi selama 48 jam. Tingkat keparahan penyakit bertambah seiring pemanjangan waktu pengamatan (Widyawati 2008).
19
Luas nekrotik terkecil pada perlakuan penghambatan X. oryzae pv. oryzae ditunjukkan oleh isolat B. cereus INT1c dengan persentase penghambatan terbesar dan persentase gejala nekrotik terkecil. Sementara itu, pada perlakuan penghambatan P. syringae pv. glycinea, luas nekrotik terkecil ditunjukkan oleh isolat B. thuringiensis SGT3g dengan persentase penghambatan terbesar dan persentase gejala nekrotik terkecil. Hasil ini sejalan dengan penelitian Rukayadi dan Hwang (2009) yang memaparkan bahwa anti quorum sensing dapat menekan patogenitas bakteri patogen seperti X. oryzae dan P. syringae. Hasil pengujian aktivitas penghambatan patogenitas bakteri fitopatogen menunjukkan bahwa isolat B. cereus INT1c berpotensi untuk diujikan secara in vivo ke tanaman padi untuk menghambat patogenitas X. oryzae pv. oryzae dan isolat B. thuringiensis SGT3g berpotensi untuk diujikan secara in vivo ke tanaman kedelai untuk menghambat P. syringae pv. glycinea.
Pseudomonas syringae pv. glycynea merupakan bakteri Gram negatif patogen pada tanaman kedelai. P. syringae pv. glycinea menyebabkan penyakit leaf blight (busuk daun). Penyakit leaf blight merupakan penyakit yang menyerang struktur daun tanaman yang ditandai dengan adanya bercak coklat pada daun, bahkan dapat menyebabkan layu atau mati (Findy 2009). Pengujian aktivitas penghambatan yang dilakukan pada tanaman tembakau menunjukkan bahwa isolat bakteri B. thuringiensis SGT3g kompeten dalam menghambat patogenitas P. syringae pv. glycinea. Pengujian penghambatan patogenitas P. syringae pv. glycinea oleh B. thuringiensis SGT3g dilanjutkan secara in vivo pada tanaman kedelai. Dua varietas tanaman uji kedelai digunakan yaitu Anjasmara dan Wilis. Penggunaan dua varietas tanaman kedelai dimaksudkan untuk mengetahui aktivitas penghambatan patogenitas pada varietas yang rentan dan tahan terhadap penyakit busuk daun yang disebabkan oleh P. syringae pv. glycinea. Pengujian secara in vivo penghambatan patogenitas P. syringae pv. glycinea oleh B. thuringiensis SGT3g pada tanaman kedelai menunjukkan aktivitas penghambatan yang tidak jauh berbeda. Hasil pengujian penghambatan aktivitas fitopatogen pada varietas Anjasmara dan Wilis memiliki persentase penghambatan yang hampir sama yang menunjukkan bahwa isolat B. thuringiensis SGT3g dapat menghambat P. syringae pv. glycinea dengan baik pada kedua varietas. Hasil ini berbeda dengan laporan dari Balitkabi (2008) yang memaparkan bahwa varietas Anjasmara merupakan varietas kedelai yang tahan terhadap penyakit busuk daun dan hawar daun sedangkan varietas Wilis lebih rentan terhadap penyakit tersebut. Hal ini dapat disebabkan oleh suhu ruang simpan (Purwanti 2004), kelembapan dan radiasi sinar ultraviolet (Alexieva et al. 2001) yang dapat mempengaruhi kemampuan bakteri fitopatogen dalam menginfeksi tanaman inang. Herlina dan Silitonga (2011) juga memaparkan bahwa virulensi bakteri patogen dapat dipengaruhi oleh suhu dan kecukupan kelembapan udara di lingkungan sekitar bakteri. Suhu dan kelembapan berpengaruh terhadap kemampuan bakteri dalam menempel dan berpenetrasi masuk ke dalam jaringan tanaman.
Xanthomonas oryzae pv. oryzae merupakan bakteri fitopatogen Gram negatif yang dapat menyebabkan penyakit hawar daun pada tanaman padi. Gejala penyakit hawar daun diawali dengan timbulnya bercak abu-abu kekuningan pada tepi daun. Gejala akan meluas sampai seluruh daun menjadi kering (Goto 1998). Secara alami penyakit hawar daun dapat ditularkan dengan bantuan angin,
gesekan antara daun yang terinfeksi hawar daun dengan daun yang sehat, percikan air hujan, dan aliran irigasi dari satu lahan ke lahan yang lainnya. Bakteri X. oryzae pv. oryzae dapat menginfeksi melalui luka yang diakibatkan oleh serangga, atau pada saat bibit padi akan ditanam biasanya bagian ujung daun digunting (Velusamy et al. 2006). Bakteri ini mampu menginfeksi tanaman padi melalui luka akibat pengguntingan kemudian bergerak dan bermultiplikasi menuju xilem. Akumulasi di dalam jaringan pembuluh menyebabkan terhambatnya pengangkutan air dan unsur hara yang diperlukan oleh tanaman, sehingga tanaman menjadi kering dan mati (Roos dan Hattingh 1987). Lubang-lubang alami pada daun seperti hidatoda juga dapat menjadi jalan masuknya X. oryzae pv. oryzae ke dalam tanaman padi (Mew et al. 1984). Namun, infeksi patogen melalui luka lebih mudah dibandingkan melalui hidatoda (Gnanamanickam et al. 1999).
Pengujian aktivitas penghambatan yang dilakukan pada tanaman tembakau menunjukkan bahwa isolat bakteri B. cereus INT1c kompeten dalam menghambat patogenitas X. oryzae pv. oryzae. Pengujian penghambatan patogenitas X. oryzae pv. oryzae oleh B. cereus INT1c dilanjutkan secara in vivo pada tanaman padi. Tiga varietas tanaman uji padi digunakan yaitu IRBB5, IRBB7, dan Kencana Bali. Penggunaan tiga varietas tanaman padi dimaksudkan untuk mengetahui aktivitas penghambatan patogenitas pada varietas yang rentan, sedang dan tahan terhadap penyakit hawar daun yang disebabkan oleh X. oryzae pv. oryzae. Aktivitas penghambatan ditunjukkan dengan gejala nekrotik tanaman padi kontrol positif lebih panjang daripada tanaman padi dengan perlakuan penyemprotan B. cereus INT1c (Gambar 5). Berdasarkan hasil dapat diketahui bahwa penghambatan patogenitas X. oryzae pv. oryzae oleh B. cereus INT1c terbesar adalah pada varietas IRBB7 kemudian IRBB5 dan yang terkecil adalah Kencana Bali. Dapat dilihat bahwa varietas IRBB7 merupakan varietas paling tahan, IRBB5 merupakan varietas sedang dan Kencana Bali merupakan varietas rentan. Hasil selaras dengan penelitian Tasliah et al. (2013) yang melaporkan bahwa varietas IRBB7 merupakan varietas yang lebih tahan terhadap X. oryzae pv. oryzae dibandingkan IRBB5 sedangkan Kencana Bali merupakan varietas yang paling rentan terhadap X. oryzae pv. oryzae. Herlina dan Silitonga (2011) juga memaparkan bahwa varietas IRBB7 memiliki resistensi yang lebih besar daripada varietas Kencana Bali terhadap penyakit hawar daun, sehingga varietas IRBB7 dimasukkan ke dalam varietas tahan dan varietas Kencana Bali dimasukkan dalam varietas rentan terhadap patogenitas X. oryzae pv. oryzae.
Persentase penghambatan gejala nekrotik yang besar oleh isolat B. cereus INT1c dan B. thuringiensis SGT3g membuktikan bahwa kedua isolat bakteri tersebut berpotensi untuk dikembangkan sebagai agens biokontrol bakteri fitopatogen X. oryzae pv. oryzae dan P. syringae pv. glycynea berdasarkan penghambatan quorum sensing. Berdasarkan uji in vivo pada tanaman kedelai dan padi dapat dilihat bahwa penghambatan gejala nekrosis pada tanaman dapat dipengaruhi oleh jenis varietas tanaman inang, kemampuan bakteri fitopatogen dalam menginfeksi tanaman inang, serta faktor lingkungan seperti intensitas cahaya matahari, suhu ruang simpan serta tingkat kelembapan. Strategi biokontrol berdasarkan mekanisme anti-QS berpotensi sebagai salah satu metode alami untuk mengendalikan patogen karena anti-QS memiliki cara kerja yang selektif untuk
21
menghambat mikrob patogen daripada penggunaan bakterisida yang dapat memunculkan sifat resisten pada patogen(Anzhou et al. 2013).