commit to user 33
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Kondisi Umum Penelitian
Pisang merupakan tanaman herba yang banyak berasal dari perkebunan rakyat. Beberapa tahun terakhir produksi pisang mengalami penurunan karena adanya hama dan penyakit pada budidaya pisang. Salah satu penyakit penting pisang adalah layu bakteri (darah pisang). Patogen penyebab penyakit ini adalah BDB (Blood Disease Bacterium).
Salah satu pengendalian yang dapat diaplikasikan adalah pengendalian hayati. Agens hayati yang dikaji dapat menghambat pertumbuhan dan perkembangan patogen adalah Bacillus endofit. Penelitian ini akan melakukan uji antagonisme in vitro Bacillus endofit terhadap pertumbuhan BDB dan melakukan uji kemampuan Bacillus dalam memacu pertumbuhan bibit pisang. Isolat Bacillus endofit diperoleh dari jaringan batang pisang kepok yang sehat, yang disuspensikan pada air steril 10 ml kemudian dikulturkan pada media TSA menggunakan metode streak dengan waktu inkubasi 1-2 hari. Isolat BDB diperoleh dari jaringan pembuluh kulit buah pisang yang disuspensikan pada air steril 10 ml kemudian dikulturkan pada media CPG menggunakan metode streak dengan waktu inkubasi 2-4 hari.
Bacillus endofit diuji kemampuannya dalam menghambat BDB secara in vitro. Isolat BDB dan Bacillus endofit selanjutnya dikulturkan pada media NA menggunakan metode dual culture dan diamati zona hambatan (bening) yang terbentuk dengan waktu inkubasi 1-2 hari. Selanjutnya Bacillus endofit diuji kemampuannya dalam memacu pertumbuhan bibit pisang. Isolat Bacillus endofit diinokulasikan pada bibit pisang kepok dengan melakukan pelukaan (ditusuk-tusuk jarum) pada akar. Bibit yang digunakan merupakan bibit hasil kultur jaringan, sehingga memiliki tingkat keseragaman tinggi tanaman yang tinggi. Pengamatan pertumbuhan bibit pisang dilakukan selama 1-8 MSI di rumah kasa. Selanjutnya setelah pengamatan pertumbuhan selesai, dilakukan reisolasi Bacillus endofit pada jaringan bibit pisang. Hal ini untuk memastikan bahwa Bacillus endofit telah terinvasi pada bibit pisang.
commit to user
20
B. Karakter Bacillus Endofit pada Pisang
Bakteri endofit telah diketahui bermanfaat bagi tumbuhan inangnya melalui sebuah interaksi berupa hubungan saling ketergantungan yang bersifat mutualisme (Hidayatun et al. 2011). Bacillus ini dilakukan karakterisasi koloni bakteri, dengan cara melihat morfologi koloni bakteri antara lain bentuk, elevasi, warna dan margin dan pewarnaan gram pada koloni Bacillus endofit. Hasil karakterisasi Bacillus endofit ditunjukkan pada Tabel 1, sedangkan hasil pewarnaan gram ditunjukkan pada Gambar 1.
Tabel 1. Karakter Bacillus endofit pisang
Isolat Bacillus
Koloni Pewarnaan Gram
Bentuk Elevasi Margin Warna Gram Warna
B1 Irregular Flat Lobate Putih Keruh Positif Ungu
B2 Irregular Raise Undulate Putih Keruh Positif Ungu
B3 Circulair Convex Entire Putih Keruh Positif Ungu
B4 Irregular Convex Entire Putih Keruh Positif Ungu
B5 Circulair Convex Entire Putih Keruh Positif Ungu
B6 Circulair Convex Entire Putih Keruh Positif Ungu
B7 Circulair Convex Entire Putih Keruh Positif Ungu
B8 Rhizoid Flat Entire Putih Keruh Positif Ungu
B9 Irregular Flat Lobate Putih Keruh Positif Ungu
B10 Circulair Raise Entire Putih Keruh Positif Ungu
A B
Gambar 1. Bacillus endofit (B5) pada media TSA (A) dan pewarnaan gram terhadap isolat B10 (B).
Menurut Sastrahidayat (1990) Bacillus endofit dikategorikan dalam gram positif yang dinding selnya memiliki kandungan asam muramik 16-20% bahan kering dan banyak mengandung fosfat. Asam muramik berfungsi untuk menjaga
commit to user
21
kekakuan dinding sel sehingga kandungan yang tinggi dapat mempertahankan bentuk bakteri dan mempengaruhi pertumbuhan bakteri patogen dalam antagonis in vitro. Keuntungan penggunaan agens hayati dari bakteri gram positif adalah membentuk spora yang tahan panas dan tahan kekeringan. Spora ini disebut endospora berfungsi sebagai alat proteksi bakteri pada perubahan lingkungan (Mehrota 1981, Maughan dan Auwera 2011).
Karakteristik morfologi isolat Bacillus endofit dalam penelitian ini (Tabel.1), memiliki bentuk koloni irregular (tidak beraturan) dan circulair (lingkaran), elevasi yang convex (menonjol ke atas), raise (agak menonjol) dan flat (rata) dan margin koloni yang undulate (bergelombang), lobate (tidak rata bergelombang secara beraturan) dan entire (rata). Hal ini terlihat adanya faktor yang mempengaruhi perbedaan dan persamaan secara morfologi pada isolat koloni Bacillus. Salah satu hal yang berperan dalam pembentukan koloni yaitu kerapatan populasi bakteri. Beberapa faktor yang mempengaruhi kerapatan populasi bakteri endofit yaitu jenis tanaman, umur tanaman, jenis jaringan (akar, batang dan daun), habitat, kemampuan memindahkan diri ke jaringan lain dan ketahanan yang
terbentuk oleh tanaman serta faktor lingkungan (Marwan et al. 2011, Melnick et al. 2008, Ngamau et al. 2012).
C. Antagonisme Bacillus Endofit terhadap BDB secara in vitro
Karakter Bacillus endofit yang bervariasi mempengaruhi kemampuannya dalam menghambat patogen maupun membentuk koloni pada media biakan. Berdasarkan uji F taraf 5% (Tabel 4, Lampiran 1), Bacillus Endofit mampu menghambat BDB secara in vitro. Hambatan Bacillus ditunjukkan dengan adanya zona bening pada media biakkan (Hadiwiyono dan Widono 2012) (Gambar 2). Kemampuan Bacillus endofit dalam menghambat BDB secara in vitro ditunjukkan pada Tabel 2.
commit to user
22
Tabel 2. Hambatan BDB oleh Bacillus endofit dalam uji antagonisme in vitro
Isolat Bacillus Zona Hambatan (cm) Persentase Hambatan (%)
Tanpa perlakuan 0.00±0.00 a 0.00±0.00a
B1 0.76±0.01 b 2.91±0.11b B2 0.79±0.12 b 3.18±0.95b B3 0.73±0.11 b 2.69±0.80b B4 0.89±0.13 bc 4.06±1.08b B5 0.78±0.13 b 3.12±0.98b B6 1.10±0.25 c 6.57±2.83c B7 0.84±0.13 b 3.61±1.09b B8 0.91±0.09 bc 4.21±0.85b B9 0.77±0.07 b 2.98±0.41b B10 0.92±0.05 bc 4.22±0.46b
Rata-rata ± standar deviasi dihitung dari 3 ulangan yang tiap ulangan terdiri 4 unit pengamatan, angka pada kolom yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata
Gambar 2. Diameter zona hambatan pada antagonis in vitro pada isolat B5 dan B0 (kontrol)
Mekanisme antagonisme dalam pengendalian hayati yaitu parasitisme langsung atau lisis dan matinya patogen, kompetisi makanan dengan patogen,
antibiosis dan pengaruh tidak langsung dari substansi yang menguap (Abadi 2003b) serta kompetisi tempat sebagai kolonisasi (Harni et al. 2012).
Isolat Bacillus mampu menghambat BDB, diduga Bacillus mampu menghasilkan antibiotik (Sastrahidayat 1990, Meliawati et al. 2006).Zat tersebut menyebabkan kematian sel pada bakteri yang peka (terbentuk daerah yang terlisis). Jenis antibiotik yang dihasilkan antara lain berupa iturin, surfactin, fengicin
commit to user
23
(Malfanova et al. 2012), polymyxin, difficidin, subtilin, dan mycobacilin (Kasutjianingati 2011, Li et al. 2012). Selain itu, Bacillus endofit juga mampu meningkatkan kandungan asam salisilat pada tanaman lada, yang memiliki peranan mengaktifkan gen-gen ketahanan tanaman (Harni dan Ibrahim 2011). Bacillus endofit mampu menghambat BDB secara in vitro (Tabel 2).
Isolat B6 memiliki kemampuan antagonis lebih tinggi dibandingkan dengan isolat yang lain (B4, B8 dan B10) dengan persentase hambatan 6,57% (Tabel 2). Hal ini disebabkan, adanya viabilitas bakteri yang berbeda-beda dalam medium biakan. Viabilitas bakteri yang baik dan stabil ditentukan oleh komposisi zat yang digunakan serta kemampuan isolat untuk memanfaatkan bahan-bahan yang digunakan pada media formulasi sebagai sumber karbon dan sumber energi, serta strategi bertahan isolat Bacillus endofit dengan menggunakan mekanisme efisiensi yang dimiliki oleh bakteri tersebut (Nurbaya et al. 2010).
D. Pemacuan Pertumbuhan Bacillus Endofit pada Bibit Pisang
Pertumbuhan adalah proses kenaikan volume yang bersifat irreversible (tidak dapat balik) karena adanya penambahan substansi termasuk di dalamnya ada perubahan bentuk yang menyertai penambahan volume tersebut. Pertumbuhan berfungsi sebagai proses yang mengolah masukan substrat tersebut menghasilkan produk pertumbuhan (Sitompul dan Bambang 1995). Berdasarkan uji F taraf 5%, pengaplikasian Bacillus endofit pada bibit pisang kepok tidak mempengaruhi pertumbuhan bibit pisang. Namun demikian, beberapa isolat Bacillus endofit memiliki kecenderungan memacu pertumbuhan bibit pisang. Hal ini ditunjukkan pada tinggi tanaman, jumlah daun, luas daun dan diameter batang (Tabel 3).
commit to user
24
Tabel 3. . Pengaruh berbagai isolat Bacillus endofit terhadap berbagai parameter pertumbuhan bibit pisang kepok
Isolat Bacillus Tinggi
Tanaman (cm)
Jumlah
Daun Luas Daun (cm
2 ) Diameter Batang(cm) Tanpa Perlakuan 73.94±8.7 6±0.33 2103.97±674.44 1.78±0.08 B1 78.60±4.8 7±0.96 1912.76±318.55 1.76±0.06 B2 73.12±5.3 6±0.19 1783.01±126.63 1.78±0.10 B3 84.39±13 6±0.38 2001.99±534.58 1.75±0.27 B4 74.82±11 6±0.19 1762.00±221.35 1.89±0.09 B5 74.10±9.2 7±0.84 1759.11±154.81 1.80±0.12 B6 71.71±1.7 6±0.51 1550.25±174.95 1.67±0.14 B7 77.19±7.7 7±0.58 1893.31±457.20 1.95±0.13 B8 81.27±3.6 7±0.33 2155.16±325.93 1.88±0.13 B9 77.74±4.9 6±0.51 1684.99±112.91 1.78±0.05 B10 77.29±7.0 6±0.58 1896.77±224.65 1.72±0.17
Rata-rata ± standar deviasi dihitung dari 3 ulangan yang masing-masing terdiri 3 bibit pisang kepok
1. Tinggi Tanaman
Tinggi tanaman merupakan parameter utama dalam uji pertumbuhan suatu tanaman. Hal ini dikarenakan dengan bertambahnya sel dalam tubuh tanaman maka terlihat adanya perbedaan. Salah satu faktor yang menentukan kualitas bahan tanam adalah jumlah substrat seperti karbohidrat yang tersedia bagi
metabolisme yang mendukung pertumbuhan awal tanaman (Sitompul dan Bambang 1995). Penelitian ini menggunakan bibit kultur jaringan
commit to user
25
Gambar 3. Grafik laju pertumbuhan tinggi tanaman bibit pisang kepok setelah inokulasi isolat Bacillus endofit dan tanpa perlakuan
commit to user
26
Gambar 4. Diagram balok tinggi bibit pisang kapok 8MSI (minggu setelah inokulasi) setelah diinokulasikan isolat bakteri Bacillus endofit
Menurut Ting et al. (2008) dan Kasutjianingati et al. (2011b), pemberian aplikasi Bacillus endofit mampu meningkatkan tinggi tanaman, diameter batang, berat akar dan luas daun pisang. Walaupun inokulasi ini tidak berpengaruh pada pertumbuhan bibit pisang, isolat B3 (Gambar 4) diduga memiliki pertumbuhan tinggi tanaman lebih cepat dibandingkan isolat yang lain. Hal ini diduga bibit pisang memiliki reaksi positif terhadap inokulasi Bacillus yang mampu menghasilkan indole acetic acid like substances (IAAS) dan meningkatkan produksi hormon tumbuhan lainnya. Menurut Harni et al. (2012) B. cereus mampu menghasilkan IAA pada akar nilam hingga 189,35ppm. Hal ini dikarenakan Bacillus termasuk bakteri gram positif yang mampu mensintesis IAA dari berbagai cara dan tidak tergantung triptofan dari luar (Siregar 2010). Ini menjadi keuntungan tersendiri pada bakteri gram positif. Auksin berfungsi untuk merangsang pertumbuhan dan perkembangan tunas, perkembangan akar, dan pembentukan buah (Dwidjoseputro 1980, Hadiwiyono dan Widono 2012, Ting et al. 2008).
Keberadaan bakteri endofit ini dapat meningkatkan ketersediaan unsur hara untuk tanaman. B.subtilis mampu menghasilkan menghasilkan siderofor dan melakukan fiksasi nitrogen (Ngamau et al. 2012). Hal ini memiliki hubungan
commit to user
27
sinergis dengan ketersediaan N yang mampu mendukung pertumbuhan vegetatif tanaman.
2. Luas Daun
Luas daun menunjukkan kemampuan tanaman dalam fotosintesis yang mengacu pada luas permukaan daun tersebut. Luas daun ini mempengaruhi laju fotosintesis per satuan tanaman. Luas daun tanaman yang diamati adalah daun yang mengalami proses fotosintesis (bukan daun yang masih menggulung atau belum berkembang sempurna) baik muda maupun tua. Luas daun merupakan parameter pertumbuhan yang juga mewakili pertambahan massa dalam tubuh tanaman dengan membandingkan keadaan awal dan akhir pengamatan.
Gambar 5. Diagram balok luas daun bibit pisang kepok dengan perlakuan beberapa isolat Bacillus endofit pada awal dan akhir pengamatan
Mekanisme pertumbuhan tanaman oleh rizobakteri dapat terjadi melalui beberapa cara di antaranya dengan melarutkan fosfat, fiksasi nitrogen (Hidayatun et al. 2012, Ngamau et al. 2012), menghasilkan hormon pertumbuhan tanaman (IAA, sitokinin, giberellin) sehingga mampu mendukung pertumbuhan akar lateral. Jika akar lateral makin banyak maka diharapkan penyerapan nutrisi makin lancar bagi tanaman sehingga mampu menyediakan relung lingkungan
commit to user
28
yang sesuai dan nutrisi yang mendukung interaksi kehidupan mikroorganisme yang menguntungkan (Kasutjianingati et al. 2011a, Ngamau et al. 2008).
Isolat B8 (Gambar 5) memiliki pengaruh pertumbuhan luas daun paling baik dibandingkan isolat lain. Isolat ini diduga mampu mengkolonisasi dengan baik pada jaringan tanaman. Hal ini diharapkan dengan tingginya nilai luas daun maka tinggi pula substansi yang terbentuk pada tubuh tanaman karena proses fotosintesis yang didukung dengan luas daun tersebut, sehingga tanaman mampu berproduksi secara optimal.
3. Jumlah Daun
Jumlah daun merupakan cerminan potensi tanaman dalam menyediakan tempat berlangsungnya fotosintesis. Hal ini menunjukkan bahwa daun merupakan organ tanaman yang mengandung kloroplas yang berperan dalam menangkap cahaya. Interaksi antara tanaman inang dan bakteri endofit dapat bersifat netralisme, mutualisme dan komensalisme (Marwan et al. 2011).
Gambar 6. Diagram balok jumlah daun bibit pisang kepok dengan perlakuan beberapa isolat Bacillus endofit
Bakteri endofit mampu menstimulasi hingga 8 helai daun pada bibit kultur jaringan pisang kepok (Hadiwiyono dan Widono 2012), 7 helai daun pada pisang barangan(Sitohang 2006) dan 6 helai daun pada pisang rajabulu. Isolat B1, B5, B7 dan B8 (Gambar 6) mampu menstimulasi bibit dalam memunculkan jumlah daun
commit to user
29
lebih banyak yaitu 7 helai daun. Jumlah daun merupakan variabel pengamatan pertumbuhan yang pertambahannya cepat. Menurut Kasutjianingati et al. (2011a) aplikasi menginokulasi eksplan dengan rhizobakteri secara in vivo pada beberapa tanaman selain pisang mampu meningkatkan pertumbuhan dan perkembangan planlet pisang. Menurut Harni et al. (2006) dan Ting et al. (2008) bakteri endofit mampu meningkatkan hormon pertumbuhan yang diasumsikan dengan adanya peningkatan hormon sitokinin yang mampu memunculkan tunas. Pertumbuhan tunas yang tinggi diharapkan mampu menghasilkan daun baru yang nantinya berfungsi untuk fotosintesis tanaman (Sitohang 2006, Harjadi 2002).
4. Diameter Batang
Batang merupakan bagian tanaman yang mampu menopang tanaman agar tumbuh tegak, sehingga semakin panjang suatu diameter tanaman maka tanaman tersebut mampu menopang tanaman yang subur. Pisang tergolong dalam tanaman monokotil, golongan ini mempunyai batang dari pangkal sampai ujung hampir tidak ada perbedaan dan beberapa golongan ini ada yang pangkalnya membesar selanjutnya ke atas tetap sama (Tjitrosoepomo 2005).Pengukuran diameter batang ini menggunakan jangka sorong.
Gambar 7. Pengaruh penyiraman berbagai isolat Bacillus endofit terhadap diameter batang bibit pisang kepok
commit to user
30
Gambar 8. Grafik laju pertumbuhan diameter batang bibit pisang kepok dengan inokulasi berbagai isolat Bacillus endofit
commit to user
31
Pembelahan sel memerlukan karbohidrat dan protein dalam jumlah yang relatif sangat besar sebab dinding-dinding sel baru, terbentuk dari selulosa dan
protoplasmanya kebanyakan terbentuk dari protein dan gula (Dwidjoseputro 1996). Laju pertumbuhan meningkat seiring dengan luasnya daun
karena pada awal pertumbuhan tanaman memiliki luas daun yang sempit, sehingga proses penyerapan cahaya pada tanaman sedikit (Gardner et al. 1991). Hal ini berhubungan dengan substansi yang terdapat pada tanaman tersebut yang mendukung proses pertambahan diameter tersebut.
Penelitian sebelumnya menjelaskan, bahwa Bacillus endofit pada planlet pisang mampu mensintesis diameter batang pisang berangan hingga 1,12cm (Ting et al 2008) dan pisang rajabulu 0,99cm (Kasutjianingati et al. 2011b). Isolat B7 (Gambar 7) diduga mampu mendukung perkembangan dan pertumbuhan diameter batang. Beberapa bakteri endofit diketahui dapat melarutkan fosfat, sehingga fosfat menjadi tersedia dan mudah diserap oleh tanaman. Fosfat merupakan unsur mikro penting yang dibutuhkan tanaman untuk pertumbuhan dan perkembangannya (Harni et al. 2006). Setiap jenis bakteri endofit mempunyai mekanisme spesifikasi baik dalam menekan pertumbuhan patogen dan pemacu pertumbuhan (Harni et al. 2012).