Pengujian 3-(4-,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazolium bromida (MTT) terhadap sel Vero
3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik Gelembung Renang Ikan Cunang (Muraenesox talabon) dan Ketersediaan Kolagen
Gelembung renang merupakan salah satu bagian dari limbah hasil samping pengolahan produk perikanan dan dikelompokkan dalam jenis limbah jeroan. Gelembung renang telah dimanfaatkan salah satunya adalah obat-obatan tradisional dan jenis makanan tertentu. Jumlah produksi gelembung renang ikan cunang setiap bulannya mencapai 9 kwintal dengan harga jual Rp. 600.000/kg di kawasan Indramayu (Omat 2008). Data perikanan tangkap Indonesia menunjukkan total tangkapan ikan cunang mencapai 2554 ton pada tahun 2014 (KKP 2015). Gelembung renang ikan cunang (Muraenesox talabon) tergolong gelembung renang tipe tertutup dan berbentuk kantung memanjang dengan saluran buntu pada kedua ujungnya yang dapat dilihat pada Gambar 5a, 5b, dan 5c. Karakteristik dan ketersediaan kolagen pada gelembung renang M. talabon dapat dilihat dari proporsi gelembung renang, kandungan kimia, ketersediaan kolagen pada jaringan gelembung renang dan komposisi asam amino.
(a) (b) (c)
Gambar 5 Gelembung renang ikan cunang dipisahkan dari ikan (a), gelembung renang (b), kumpulan limbah gelembung renang (c).
Karakteristik proporsi dan proksimat gelembung renang
Proporsi gelembung renang pada ikan cunang merupakan salah satu cara untuk mengetahui ketersediaan gelembung renang sebagai bahan baku kolagen. Hasil pengukuran proporsi gelembung renang ikan cunang dapat dilihat pada Gambar 5. Gelembung renang memiliki proporsi yang lebih kecil daripada bagian lain, baik sebagai bagian tubuh maupun bagian dari limbah hasil perikanan, yakni masing-masing 0.57-0.67% dan 1.30-1.50%. Hasil pengukuran gelembung renang menunjukkan proporsi kurang dari 2% dengan bobot rata-rata 11.33 gram. Bobot yang rendah diduga akibat hilangnya sebagian besar konsorsium gas (O2, N2 dan H) dan air ketika dipreparasi. Penelitian Feuillade dan Nero (1998) menunjukkan bahwa proporsi gelembung renang Teleostei adalah ±5% (studi kasus tuna sirip kuning) dan 1-2% (studi kasus belut perak Jepang; Yamada et al. 2001). Proporsi (volume dan/atau bobot) pada Teleostei, khususnya kelompok Anguillidae
dipengaruhi fase pendewasaan, pola gerak, tekanan dan kedalaman (Skoglund 1961; Fänge 1983; Shrimpton et al. 1990).
Gelembung renang merupakan bagian yang belum dimanfaatkan dan dieksplorasi dari ikan cunang, yang diduga karena memiliki proporsi yang kecil dari total jeroan. Bagian lainnya seperti daging putih ikan cunang telah
dimanfaatkan sebagai campuran produk bakso dan kerupuk (Sarlan 2016) serta
nugget ikan (Murdinah dan Maharani 2009) di tingkat UKM atau unit usaha lebih besar. Limbah kulit dan tulang telah digunakan sebagai bahan baku kulit samak dan tepung ikan (Suryanti dan Peranginangin 2004). Oleh karena itu, bagian gelembung renang tersebut masih perlu diteliti lebih lanjut, salah satunya sebagai sumber kolagen. Keberlanjutan produksi gelembung renang menjadi kolagen tentunya tidak akan cukup jika hanya mengandalkan gelembung renang dari satu spesies saja. Ketersediaan gelembung renang hendaknya mencakup berbagai macam spesies dengan karakteristik proporsi yang lebih tinggi.
Gambar 6 Proporsi gelembung renang terhadap (a) seluruh bagian dan (b) limbah ikan cunang Muraenesox talabon ( kepala, jeroan, gelembung renang, kulit, tulang, daging).
Proporsi komponen air dari gelembung renang utuh beberapa jenis spesies ikan mencapai lebih dari 70%, seperti ditunjukkan pada Tabel 4. Kandungan tersebut berada di atas proksimat rata-rata masa otot/daging belut (Anguilla anguilla) dan belut conger (Conger conger) sebagai spesies kerabat dekat, yaitu 60-71% (air); 8-31% (lemak); 14.4% (protein) dan 80% (air); 0.2-11.9% (lemak); 19.4% (protein) (FAO 2015). Perbedaan hubungan terlihat antara kandungan proksimat gelembung renang utuh/segar (basah) dengan gelembung renang komersial (kering). Hasil uji korelasi menunjukkan bahwa hubungan antara kandungan serat sangat erat (R < 0.5) dengan komponen air, abu, protein dan lemak pada gelembung renang utuh/segar (basah). Setelah dikeringkan, keberadaan lemak tidak erat kaitannya dengan abu dan protein (R < 0.9), bahkan berkorelasi negatif dengan kadar air (Lampiran 3a, 3b). Lehninger (2000) menyatakan bahwa konsentrasi ion H+ dan OH− terkait dengan gugus fungsi protein dan lemak, sedangkan kandungan serat dan karbohidrat lebih dipengaruhi oleh afinitas mineral dan jumlah ion karbon bebas (Takatsuki et al. 1984; João-Ramalhosa et al. 2009).
Hasil uji T-berpasangan (Lampiran 3c) menunjukkan bahwa terdapat perbedaan kandungan protein dan lemak yang signifikan (p < 0,05) antara gelembung renang utuh/segar (basah) dengan gelembung renang komersial (kering). Hal tersebut diduga akibat defisiensi, fluktuasi atau bahkan eliminasi air
selama proses, penyimpanan, pengolahan dan pengeringan jaringan gelembung renang yang akan mengubah komposisi biokimia yang lain. Hasil uji korelasi pada perhitungan kandungan kimia basis kering (Tabel 5) menunjukkan bahwa kandungan serat akan menurun seiring meningkatnya kandungan abu, protein dan lemak (Lampiran 4a) pada bahan baku basah. Bahan baku kering menunjukkan bahwa kandungan abu akan menurun dengan semakin meningkatnya kadar protein, lemak dan serat (Lampiran 4b). Hasil uji T-berpasangan (Lampiran 4c) menunjukkan bahwa terjadi perubahan kandungan abu dan lemak secara signifikan (p < 0.05). Kandungan protein basis kering dari gelembung renang kering (komersial) lebih tinggi dari gelembung renang basah (limbah), namun kadar protein kedua produk tidak berbeda nyata (p < 0.05) secara statistik. Kandungan protein pada limbah gelembung renang lebih tinggi daripada gelembung renang kering (komersial). Hal tersebut merupakan alasan utama untuk menggunakan gelembung renang basah sebagai bahan baku kolagen, selain itu manfaat lainnya adalah sebagai tindakan antisipasi terhadap degradasi protein pada produk kering (selama proses, distribusi dan penyimpanan). Alasan lainnya adalah kolagen akan diekstrak dari jaringan menggunakan pelarut, sehingga lebih efektif apabila dalam keadaan basah atau masih mengandung kadar air.
Tabel 4 Kandungan kimia (basis basah) gelembung renang ikan cunang (basah, kering), tuna (Thunnus albacares), dan patin (Pangasius sp.)
Komposisi Cunang Persentase (%) basis basah (basah) Cunang (kering) Tuna1 Patin2 Air 73.88±0.22a 13.94 ± 0.33b 83.33 74.03 Abu 0.26±0.02a 0.27 ± 0.08a 0.2λ 0.08 Protein 24.3λ±0.18b 80.70 ± 0.65a 12.0λ 25.67 Lemak 0.48±0.02b 3.53 ± 0.45a 1.44 0.03 Karbohidrat* 0.λλ±0.27b 1.56 ± 0.70a 2.85 0.1λ *dihitung secara by difference
1Pengujian proksimat gelembung renang utuh/segar (basah) dari Thunnus albacares (Kaewdang et al. 2014)
2Pengujian proksimat gelembung renang utuh/segar (basah) dari Pangasius sp. (Yanuardi 2006)
a-bAngka-angka pada kolom yang sama diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (uji
selang berganda Duncan)
Tabel 5 Kandungan kimia (basis kering) gelembung renang ikan cunang (basah, kering), tuna (Thunnus albacares), dan patin (Pangasius sp.)
Komposisi Cunang Persentase (%) basis kering (basah) Cunang (kering) Tuna1 Patin2 Abu 0.λ8±0.07a 0.31 ± 0.09b 1.74 0.30 Protein λ3.3λ±0.87a 93.87 ± 0.41a 72.53 λ8.λ2 Lemak 1.83±0.06b 4.10 ± 0.51a 1.44 0.13 Karbohidrat* 3.80±1.00a 1.81 ± 0.81b 17.10 0.65 *dihitung secara by difference
1Pengujian proksimat gelembung renang utuh/segar (basah) dari Thunnus albacares (Kaewdang et al. 2014)
2Pengujian proksimat gelembung renang utuh/segar (basah) dari Pangasius sp. (Yanuardi 2006)
a-bAngka-angka pada kolom yang sama diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5%
Kandungan lemak dan mineral yang tinggi dikarenakan proses pengeringan secara proporsional. Jaringan adiposa sebagai tempat molekul lemak akan mengkerut setelah hilangnya air dan akan menyatu denngan lapisan luar gelembung renang yang menyebabkan gelembung renang kering tampak mengkilap. Oleh karena itu, gelembung renang kering tidak dipilih sebagai bahan baku kolagen karena peningkatan kandungan lemak dan mineral pada bahan baku memerlukan proses pengolahan tambahan berupa defatting (penghilangan lemak) dan demineralisasi (penghilangan mineral). Kandungan lemak dan pengotor seperti protein non kolagen pada gelembung renang juga dipengaruhi oleh faktor lainnya yakni spesies, jenis kelamin, umur dan fase pertumbuhan ikan. Umur dan fase pertumbuhan ikan berpengaruh pada kandungan lemak gelembung renang karena adanya sintesis lipoprotein dan wax ester pada pangkal dan ujung gelembung renang dari fase juvenil hingga fase dewasa (Neighbors dan Nafpaktitis 1982; Butler dan Pearcy 1982).
Karakteristik morfologis gelembung renang
Gelembung renang (swim bladder atau air bladder) dapat digolongkan dalam bagian kelenjar (bladder) yang tidak memiliki ataupun menghasilkan enzim, seperti halnya kandung kemih (urine bladder). Gelembung renang adalah organ internal pada sebagian besar ikan Teleostei, terdiri atas otot epitel selapis dan jaringan ikat. Potongan melintang jaringan gelembung renang ikan cunang dengan beberapa skala perbesaran ditunjukkan pada Gambar 7. Hasil kenampakan jaringan gelembung renang yang diwarnai menunjukkan warna yang berbeda dikarenakan reaksi histokimia larutan Casson’s Trichrome pada komponen kolagen, sitoplasma/otot dan nukleus masing-masing mengekspresikan warna kebiruan, merah dan hitam (Kiernan 1999). Hasil pewarnaan menunjukkan secara keseluruhan teradapat 3 zona lapisan melingkar seperti cincin (dari dalam ke luar), yakni lapisan tipis kemerahan, dilanjutkan dengan lapisan biru, dan lapisan tebal kemerahan (Gambar 7a). Lapisan tengah mengindikasikan jaringan kolagen berada di antara jaringan otot (bagian dalam dan luar). Di sisi luar otot terluar terwarnai biru kemerahan (mendekati ungu).
Karakteristik jaringan gelembung renang yang terdiri atas jaringan kolagen yang diapit oleh lapisan otot bagian dalam dan bagian diluar (Gambar 7b) mencirikan struktur tunica externa (membran luar) dan tunica interna (membran dalam). Kedua jenis otot tersebut berfungsi untuk menggerakkan dinding gelembung renang. Fungsi kolagen diantara kedua lapis otot adalah mempertahankan posisi normal dinding gelembung renang setelah kontraksi (mengembang, terapung) dan/atau relaksasi (mengempis, tenggelam). Beberapa fungsi gelembung renang ikan antara lain adalah organ menampung/mengatur sirkulasi gas, alat pengatur keseimbangan saat berenang secara vertikal, organ osilasi, dan sebagai reflektor gaya hidroakustik (Kleckner 1980; Kobayashi 1990; Taylor et al. 2010). Mekanisme kerja bagian ikan ini berlaku hukum II Newton, Archimedes dan Bernoulli secara bersamaan (Vogel 2013; Henshaw et al. 2013; Safiullin et al. 2014). Aksi yang diberikan akibat kontraksi/relaksasi dinding gelembung renang menyebabkan reaksi terapung/tenggelam dengan jarak (vertikal) tertentu, sebanding dengan volume udara yang bertambah/berkurang (sinergi hukum Newton dan Archimedes).
Gambar 7 Struktur morfologis gelembung renang ikan cunang (Muraenesox talabon) keseluruhan (A) dan sebagian kecil (B). Jaringan otot (JO), jaringan kolagen (JK), dan serabut kolagen (SK); Pewarnaan Casson’s Trichrome; Skala bar = 400 m.
Gerakan vertikal dari ikan Teleostei dibatasi ukuran gelembung renang (Jones 1951) sekaligus efisiensi kerja mekanis otot gelembung renang untuk mengkonsentrasikan konsorsium gas inert (Kobayashi 1989; Kobayashi 1990). Hal tersebut menjelaskan adaptasi spesies ikan pada kolom perairan tertentu (epipelagis, mesopelagis, atau batipelagis) berdasarkan tingkat perubahan volume gelembung renang (Taylor et al. 2010). Pola adaptasi yang sama diduga juga dilakukan oleh ikan tipe perenang cepat atau ikan migrasi termasuk ikan cunang.
A
Adaptasi yang terjadi yakni pada jumlah sel otot, yakni perubahan volume berulang pada gelembung renang memicu adaptasi otot untuk meningkatkan distribusi jaringan ikat, sehingga menjadi lebih kompak (stiffness) dan melawan tekanan (stress).
Kontribusi kolagen adalah membentuk jaringan ikat pada dinding selapis yang mirip seperti dinding-dinding usus dan ureter. Sifat fungsional yang unik dari kolagen sebagai materi piezoelektrik memenuhi kaidah Wolff (Ahn dan Grodzinsky 2009). Substansi kolagen memberi kemampuan gelembung renang untuk regulasi konsorsium gas spontan (efek elektroosmosis). Matriks kolagen pada epitel gelembung renang mengatur agar pH darah dari rete mirabele menuju dinding gelembung renang selalu lebih rendah dari insang menuju rete mirabele. Spesies
Anguilla rostrata dan Anguilla vulgaris memanfaatkan kondisi pH fisiologis tersebut untuk membantu transportasi asam laktat beserta ion-ion gas inert terdifusi ke dalam gelembung renang (Kleckner 1980; Steen 1963)
Selain itu, jaringan kolagen membentuk ketahanan dinding gelembung terhadap tekanan akibat perubahan kedalaman atau dikenal sebagai efek permeabilitas hidrolik (Taylor et al. 2010). Impermeabilitas terutama dibentuk oleh lapisan luar keperakan pada gelembung renang Anguillidae yang mengandung banyak kristal berbentuk jarum. Guanin menyumbang sekitar 13% dari berat kering lapisan perak (Kutchai dan Stein 1971). Struktur kristal jarum tersebut bersesuaian dengan ichthyol (jarum pendek kolagen) yang teramati pada pengamatan histologi. Struktur jarum tersebut dan serat elastin merupakan penyusun lapisan peritonium (ZFIN 2016). Sifat impermeabilitas didapat dari dinding perak gelembung renang keluarga belut (Conger conger dan Anguilla anguilla) sehingga jauh lebih kedap CO2, O2 dan N2. Penghilangan lapisan keperakan meningkatkan permeabilitas dinding gelembung 100 kali dan konstanta difusi (Denton et al. 1972; Lapennas dan Schmidt-Nielsen 1977).
Sifat fungsional unik lain adalah kontraksi/relaksasi yang berulang terus menerus menyebabkan lapisan penyangga (jaringan kolagen) mengalami osilasi atau pergerakan dengan periode tertentu (hukum Hertz). Gerakan osilasi tersebut menjadi tandingan gaya hidroakustik yang diberikan oleh instrumen Target Strength/TS, gelombang echo, sonar kapal, atau biosonar Cetacea (lumba-lumba dan paus) (Manik 2009; Schaefer dan Oliver 2010). Hal tersebut menjelaskan mekanisme ikan menggunakan bantuan gelembung renang sebagai osilator (alat penggetar) bagi organ Weber (organ pendengaran primitif) untuk mengamplifikasi gelombang mekanis dalam kolom perairan (gelombang hidroakustik). Hasil amplifikasi diterima sebagai impuls suara, untuk selanjutnya diteruskan ke sistem saraf pusat (Schulz-Mirbach et al. 2013). Ketika gelombang suara (gelombang mekanik) dihadapkan pada suatu jaringan antar-muka yang memiliki impedansi akustik yang berbeda, gelombang suara akan dipantulkan, dibiaskan atau dihamburkan (Alexander et al. 2015). Jaringan ikat, khususnya kolagen menimbulkan impedansi akustik karena distribusi kolagen menjaga surface tension
(tegangan permukaan) pada dinding gelembung selama melakukan fungsi kontraksi/relaksasi.
Pengamatan histologis dan kandungan biokimia mengindikasikan bahwa kelimpahan kolagen dalam gelembung renang cukup tinggi (± 50% dari total protein) dibandingkan kandungan rata-rata pada jaringan vertebrata dan terdistribusi di lapisan luar dan sejajar serabut otot. Serabut otot tersusun atas
endoderm tipis dan lapisan otot polos (muskularis mukosa) dengan serat longitudinal dan melingkar beberapa serabut kolagen. Oleh karena itu, membran internal dapat dijadikan bahan baku isolasi kolagen. Hal ini sesuai penelitian Trilaksani et al. (2006) terkait proses separasi tunica interna dan pembuluh darah pada gelembung renang ikan patin (Pangasius hypophthalmus), sehingga memperoleh membran dalam sebagai bahan baku isinglass.
Gambar 8 Ilustrasi mekanisme reaksi histokimia pewarna Hematoxylin-Besi dan
Casson’s Trichrome (menggunakan model substrat-auxachrome
-chromogen).
Jaringan kolagen dapat terwarnai oleh pewarna karena adanya mekanisme reaksi histokimia pada jaringan. Reaksi histokima tersebut terjadi antara pewarna/dye (chromogen), auxachrome dan substrat (dalam hal ini adalah protein).
Auxachrome adalah senyawa kimia tidak berwarna yang mengikat pewarna/dye.
Chromogen adalah agen pewarna yang memiliki afinitas sangat kecil terhadap jaringan. Senyawa auxachrome akan “menggandeng” chromogen untuk dapat melakukan penetrasi dan berikatan dengan jaringan. Pewarna Weigert’s iron -hematokilin direaksikan dengan jaringan sebelum pewarna Casson’s Trichrome
(CT) untuk mewarnai inti sel. Senyawa hematoksilin merupakan chromogen yang larut dalam etanol (auxachrome), namun dengan afinitas yang rendah terhadap substrat. Senyawa mordant besi sulfat (Fe2(SO4)2) dan natrium iodat (NaIO3) membantu mengoksidasi hematoksilin perlahan menjadi ferrous-oxy-hematein
yang bereaksi dengan inti sel (Kiernan 1999). Oleh karena itu inti sel berwarna hitam (Gambar 7) berupa titik-titik kecil.
Pewarna Casson’s Trichrome (CT) merupakan counterstain dari Weigert’s iron-hematokilin yang bertujuan untuk membedakan inti sel dengan substansi atau bagian jaringan yang lain, salah satunya kolagen sebagai matriks ekstraseluler.
Chromogen CT adalah Orange G (Mr = 452.38 g/mol), Aniline Blue (Mr = 737.7237 g/mol), dan Acid Fuchsin (Mr = 585.538 g/mol) sehingga disebut
trichrome (tri = tiga; chroma = warna). Ketiga warna tersebut terikat pada asam fosfotungstat atau phospotungstic acid (PTA) sebagai auxachrome. Ketiga pewarna tersebut saling berkompetisi untuk berpenetrasi ke dalam jaringan dengan tingkat afinitas yang berbeda (Gambar 8). Reaksi pelekatan dye pada jaringan terjadi secara elektrostatik, dimana molekul dengan afinitas tertinggi dan bobot molekul terkecil akan dapat menembus struktur yang lebih berpori. Pewarna Orange G diduga berikatan terlebih dahulu dengan struktur serabut otot yang kurang berpori karena bobot molekul yang lebih kecil diantara dye yang lain, sehingga sitoplasma dan otot terwarnai merah-jingga. Sementara dua pewarna lainnya tidak bisa menembus dan berikatan dengan sitoplasma dan otot, namun masih terikat pada auxachrome yang sama (PTA) sehingga warna merah-jingga dipengaruhi warna biru dari Aniline Blue
dan warna ungu dari Acid Fuchsin sehingga warna yang tampak adalah warna merah muda hingga merah keunguan.
Dua molekul pewarna lain yang masih berikatan dengan PTA mendapat donor ion H+ dari gugus amina protein yang terdapat pada kolagen. Asam-asam amino penyusun struktur kolagen menyumbang ion H+ dari struktur rantai alfa sehingga terbentuk suasana asam di permukaan struktur jaringan kolagen. PTA berikatan dengan gugus amina sekaligus “menggandeng” Aniline Blue dan Acid Fuchsin dan melekat pada situs atau posisi jaringan kolagen tersebut terdistribusi. Dengan kata lain, semakin banyak ion H+ dari struktur kolagen, maka semakin banyak chromogen yang berikatan dengan kolagen sehingga warna jaringan berwarna biru. Warna biru lebih dominan karena bobot molekul dye Aniline Blue
lebih besar dibandingkan Acid Fuchsin, sehingga Acid Fuchsin bisa terpenetrasi ke dalam struktur kolagen dan meninggalkan molekul Aniline Blue di permukaan. Reaksi pengikatan PTA- Aniline Blue- Acid Fuchsin pada struktur kolagen dapat dilihat pada Gambar 9.
Gambar 9 Reaksi histokimia kolagen dengan asam fosfotungtat dan chromogen
(dye) pewarna Trichrome pada proses pewarnaan jaringan gelembung renang ikan cunang (Muraenesox talabon).
Kandungan asam amino gelembung renang
Indikasi ketersediaan kolagen pada jaringan dapat dilihat dari proporsi kandungan protein dan jenis asam amino penyusunnya. Kadar protein dari sampel gelembung renang ikan cunang sebesar 93.39% (berat kering) menunjukkan bahwa gelembung renang ikan cunang memiliki potensi dan kualitas yang baik untuk dijadikan sebagai bahan baku kolagen sebagai alternatif pengganti kolagen terestrial. Ramachandran dan Reddi (2013) mengemukakan bahwa ketersediaan kolagen dapat diprediksi dengan mengetahui komposisi asam amino, terutama asam amino yang dapat membentuk sekuens triplet rantai alfa kolagen. Komposisi asam amino gelembung renang ikan cunang (Muraenesox talabon) ditunjukkan pada Gambar 10 dan Lampiran 5. Bahan baku mengandung 18 asam amino dari 20 asam amino yang umumnya ditemukan pada berbagai jenis derivat protein. Asam amino polar misalnya histidin (His), serin (Ser), treonin (Thr), tirosin (Tyr) dan metionin (Met) terdeteksi dengan kadar kurang dari 10 ppm. Kandungan sistein (Cys) tidak terdeteksi pada gelembung renang diduga kerana berada dibawah limit deteksi standar mix asam amino, yaitu 48.42 ppm (Waters Inc. 1996).
Kandungan arginin (Arg), asam aspartat (Asp), asam glutamat (Glu) dan lisin (Lys) berada pada kisaran 10-20 ppm atau sekitar 2 kali lipat dari kandungan asam amino polar. Komposisi glisina (Gly), prolina (Pro) dan alanina (Ala) merupakan 3 asam amino hidrofobik yang mendominasi pada gelembung renang, dengan kandungan mencapai 1-2.5 kali lipat asam amino bermuatan. Lehninger (2000) mengemukakan komposisi asam amino yang mendominasi komposisi yang lain menentukan sifat suatu bahan. Signifikansi ketersediaan kolagen terletak pada 80% asam amino non-polar misalnya glisina, alanina, valina dan prolina, sehingga diprediksi kolagen dalam bahan baku gelembung renang dapat terlarut sempurna pada pelarut non-polar, salah satunya asam-asam organik seperti asam asetat dan asam laktat (Bama et al. 2010). Kandungan glisina yang tinggi diduga karena ketersediaan glisina sangat penting pada setiap pembentukan sekuens dasar -Gly-X-Y- untuk pembentukan 3 rantai α dalam molekul tropocollagen. Posisi X dan Y sebagian besar adalah L-prolina dan L-hidroksiprolina maupun asam amino lain (Ramachandran dan Reddi. 2013).
Gambar 10 Komposisi asam amino per 1 gram (berat basah) limbah gelembung renang ikan cunang (Muraenesox talabon).
Hidroksiprolina bersifat hidrofobik karena merupakan derivat dari prolina yang terhidroksilasi atau mengikat gugus hidroksil (OH−) oleh enzim prolul hidroksilase pada saat proses metabolisme di semua jaringan tubuh (Marks et al. 1996). Ketersediaan hidroksiprolina diindikasikan sebagai penanda kolagen karena merupakan asam amino pembatas pada sekuens -Gly-X-Y- dan tidak dicantumkan pada hasil analisis asam amino karena berada di bawah limit deteksi standar mix
asam amino (AccQ•TAGTM) berdasarkan standar operasional prosedur (SOP) metode Nollet (1996) dan Waters Inc. (1996). Penelitian Niu et al. (2013) mengindikasikan bahwa hidroksiprolin terdeteksi dengan konsentrasi 0.17 mg/L pada isinglass (basis kering). Oleh karena itu, untuk saat ini dapat diasumsikan bahwa nilai tersebut merupakan limit deteksi asam amino hidroksiprolin untuk gelembung renang. Meskipun hidroksiprolina tidak terdeteksi, sekuens Gly, Pro dan Ala dengan kadar cukup tinggi mengindikasikan adanya kolagen tipe I (gen penyandi COL1A1 atau COL1A2). Kolagen tipe II dan tipe III merupakan modifikasi kolagen tipe I dengan komposisi prolina/hidroksiprolina dan alanina yang lebih rendah. Kolagen dari tipe IV sampai X ditemukan pada membran basal dan jaringan kartilago. Kolagen tipe I dan tipe II yang membentuk 3 dimensi (serat, globul, kubus, cincin dan lain-lain) adalah ciri kolagen XI-XVIII yang ditemukan hampir di seluruh jaringan tubuh (Ramachandran dan Reddi 2013)
Proses pengolahan lanjutan gelembung renang menjadi kolagen dilakukan dengan mempertahankan sekuens penciri kolagen dan menghilangkan zat lain yang masih ada dalam jaringan. Keberadaan senyawa-senyawa nonkolagen tersebut akan menghambat proses separasi kolagen dari jaringan. Optimasi proses pretretment
untuk menghilangkan lemak dan mineral-mineral dalam jaringan gelembung renang perlu dilakukan untuk mempercepat proses hidrolisis yang secara langsung mempengaruhi kualitas kolagen yang dihasilkan. Shon et al. (2011) menyatakan bahwa keberadaan lemak dan mineral-mineral lainnya akan mengganggu efektivitas kolagen dalam aplikasinya pada berbagai produk.
Penghilangan Protein Nonkolagen dari Gelembung Renang
Kolagen merupakan protein struktural utama pada jaringan ikat vertebrata yang terdiri atas 30% dari total protein. Kolagen ikan memiliki kemampuan bertaut silang sangat lambat bahkan dalam air mendidih, oleh karena itu pretreatment
ringan diperlukan untuk memecahkan ikatan taut silang sebelum ekstraksi (Schreiber dan Gareis 2007). Kolagen adalah protein fibrosa, berkontribusi dalam berbagai keunikan fungsi fisiologis jaringan sisik, tendon, tulang dan kartilago ikan (Jongjareonrak et al. 2005). Seperti halnya jaringan ikan lain, kolagen dapat diisolasi melalui eliminasi ± 70% substansi protein nonkolagen dari total protein gelembung renang dengan adanya pretreatment.
Pretreatment dilakukan dengan menggunakan proses asam atau basa sesuai dengan asal bahan baku. Pretreatment digunakan untuk menghilangkan protein nonkolagen (deproteinasi) dan untuk mendapatkan rendemen yang lebih tinggi. Salah satu cara pretreatment adalah penggunaan senyawa basa seperti NaOH. Kombinasi konsentrasi NaOH dan waktu perendaman terbaik dan optimal perlu dilakukan untuk memaksimalkan kelarutan protein nonkolagen dan lemak, namun
dengan meminimalkan tingkat kehilangan kolagen. Hasil pengamatan kandungan protein dari larutan NaOH sisa perendaman kulit dapat dilihat pada Gambar 11 serta Lampiran 7 dan Lampiran 8.
Gambar 11 Konsentrasi protein nonkolagen terlarut larutan NaOH. Konsentrasi NaOH 0.05 M; 0.10 M; dan 0.15 M. Durasi perendaman 2 jam selama 24 jam (12 siklus).
Kandungan protein terlarut dari larutan NaOH sisa perendaman gelembung renang semakin menurun seiring penambahan durasi perendaman. Protein non kolagen banyak dilepaskan mulai dari 2 jam pertama perendaman yang diindikasikan dengan kandungan protein terlarut yang terus menurun hingga durasi perendaman selanjutnya. Proses regulasi larutan NaOH secara bertahap setiap 2 jam dilakukan untuk memantau kondisi transisi antara degradasi protein non kolagen dan protein kolagen. Fluktuasi kenaikan protein terlarut terjadi dari 10 jam menuju 14 jam pada perendaman NaOH 0.05 M (7 siklus regulasi) dan terjadi dari 10 jam menuju 12 jam pada perendaman NaOH 0.10 M dan 0.15 M (6 siklus regulasi). Titik-titik tersebut diduga merupakan kondisi komponen kolagen mulai terdegradasi oleh NaOH setelah komponen nonkolagen. NaOH mampu mendegradasi kolagen melalui pemutusan ikatan sulfida (–S–) pada struktur primer. Ikatan –S– pada protein berfungsi sebagai elemen struktural dan menstabilkan struktur lipatan (fold) protein. Degradasi kolagen oleh larutan alkali menyerang asam-asam amino dengan gugus sulfur seperti metionina, homosisteina, sistina dan taurina (Ramachandran dan Reddi 2013).
Pengaruh konsentrasi dan durasi pretreatment
Perlakuan konsentrasi larutan NaOH memberikan pengaruh yang signifikan