BAHAN DAN METODE
HASIL DAN PEMBAHASAN DNA Total
DNA total Tarsius sp. telah diisolasi dari lima contoh darah dan delapan cuplikan otot. Profil DNA total disajikan pada Gambar11. DNA total yang diperoleh digunakan sebagai cetakan untuk amplifikasi gen Sit b dan D-loop menggunakan teknik PCR.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Gambar 11. Profil DNA Total Tarsius sp. menggunakan gel agarose 1,2% Keterangan: lajur 1-6 DNA total T. bancanus, lajur 7-11 DNA total T. spectrum, lajur 12 DNA total T. dianae
Amplifikasi Gen Sit b dan D-loop Amplifikasi Gen Sit b
Amplifikasi daerah gen Sit b mtDNA pada Tarsius menggunakan primer L14841 dan H15149 menghasilkan fragmen DNA berukuran 374 pb pada semua contoh Tarsius. Ukuran fragmen DNA yang diperoleh sesuai dengan yang
500 pb 374pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Gambar 12. Profil DNA Tarsius sp. hasil amplifikasi menggunakan pasangan primer L14841 dan H15149
Keterangan: Lajur 1. DNA penanda 100 pb (Promega), lajur 2-11 DNA hasil amplifikasi menggunakan primer L14841 dan H15149
dikemukakan Kocher et al. (1989) pada burung, ikan dan rodensia serta Schmitz
et al. (2002) pada T. bancanus. Profil DNA hasil amplifikasi menggunakan primer L14841 dan H15149 disajikan pada Gambar 12.
Berdasarkan runutan genom mtDNA T. bancanus (Schmitz et al. 2002) fragmen ini terletak di dalam gen Sit b berdekatan dengan gen tRNAGlu (basa ke 63 dari ujung 5’ gen Sit b). Letak penempelan primer L14841 dan H15149 pada gen Sit b T. bancanus disajikan pada Lampiran 1. Skema letak penempelan primer L14841 dan H15149 pada DNA disajikan pada Gambar 13.
1140 pb
Amplifikasi Daerah D-loop
Amplifikasi daerah D-loop pada Tarsius sp. dilakukan dengan menggunakan pasangan primer DLTARPROF dan DLTARPHER dan pasangan primer DLTARPROF dan DLTARBFR. Primer DLTARPROF menempel pada gen tRNAPro, sedangkan primer DLTARPHER menempel pada gen tRNAPhe. Produk PCR hasil amplifikasi pasangan primer kedua, primer DLTARPROF menempel pada gen tRNAPro dan primer DLTARBFR menempel pada fragmen D-loop
bagian tengah. Besarnya fragmen DNA yang teramplifikasi pada penelitian setelah diplotkan dengan data runutan DNA mitokondria T. bancanus hasil penelitian Schmitz et al. (2002) adalah 1557 pb dan 417 pb. Profil DNA hasil amplifikasi primer tersebut disajikan pada Gambar 14.
Fragmen DNA 1557 pb hasil amplifikasi pasangan primer DLTARPROF dan DLTARPHER terdiri dari 27 pb fragmen tRNAPro, 1479 pb fragmen D-loop,
69 pb 62 pb 374 pb 704 pb 69 pb 66 pb
33 pb 34 pb
L14841 H15149
Primer
Gambar 13. Skema letak penempelan primer L14841 dan H15149 untuk mengamplifikasi daerah gen Sit b pada Tarsius sp.
tRNAThr tRNAPro tRNAGlu
dan 51 pb fragmen gen tRNAPhe, sedangkan fragmen DNA sepanjang 417 pb
Tarsius sp. hasil amplifikasi menggunakan pasangan primer DLTARPROF dan
DLTARBFR, berdasarkan runutan genom mtDNA T. bancanus (Schmitz et al.
2002) terdiri dari 27 pb fragmen gen tRNAPro dan 390 pb fragmen D-loop (Lampiran 2). Skema letak penempelan pasangan primer DLTARPROF dan DLTARPHER dan pasangan primer DLTARPROF dan DLTARBFR pada
Tarsius sp. disajikan pada Gambar 15.
66 pb 1479 pb 368 pb 1089 pb 39pb 8pb 29pb 17pb 19pb 22pb 21pb
tRNAPro tRNAPhe
DLTARPROF DLTARBFR DLTARPHER
Primer
Gambar 15. Skema letak penempelan primer DLTARPROF, DLTARBFR, DLTARPHER untuk mengamplifikasi fragmen D-loop pada
Tarsius sp.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Gambar 14. Profil DNA Tarsius sp. hasil amplifikasi menggunakan pasangan primer DLTARPROF- DLTARPHER dan DLTARPROF-DLTARBFR Keterangan: lajur 1. DNA penanda 100pb (Promega), lajur 2-5 DNA hasil amplifikasi menggunakan primer DLTARPROF- DLTARBFR, lajur 6-9 DNA hasil amplifikasi menggunakan primer DLTARPROF-DLTARPHER
1557pb
417pb 500 pb
Penentuan Runutan Nukleotida Gen Sit b Parsial Keragaman Runutan Nukleotida
Analisis keragaman nukleotida dilakukan setelah semua runutan DNA hasil penelitian dan primata spesies lain yang diambil dari Genbank disejajarkan (multiple alignment). Fragmen DNA Sit b parsial sepanjang 374 nukleotida (nt) hasil amplifikasi primer L14841 dan H15149, setelah dilakukan penentuan runutan menggunakan primer H15149 runutan DNA yang diperoleh pada penelitian ini adalah 276 basa (Lampiran 3), yaitu pada posisi ke 112 sampai dengan posisi ke 387 dari ujung 5’ gen Sit b utuh. Bagian yang tidak terbaca yaitu 48 basa nukleotida pada ujung 5’ primer L14841 dan 50 basa nukleotida dari ujung 5’ primer H15149 (disajikan pada gambar 16) . Dua ratus tujuh puluh enam basa nukleotida ini menyandi 92 asam amino (Lampiran 4). Nukleotida hasil penentuan runutan digunakan untuk penjajaran berganda dengan nukleotida primata lain yang diambil dari Genbank.
Sit b (1140 pb)
Primer
Hasil penjajaran nukleotida dan asam amino disajikan masing-masing pada lampiran 5 dan lampiran 6. Penjajaran asam amino hasil translasi ke 276
nukleotida gen Sit b pada Tarsius hasil penelitian dengan pembanding
T. bancanus (Malaysia, Genbank) diperoleh 92 asam amino (posisi ke 38 sampai dengan ke 129 dari ujung 5’ Sit b utuh) dengan 14 asam amino bersifat beragam. Jumlah penggunaan kodon dalam mt-DNA Tarsius disajikan pada Lampiran 5. Asam amino yang beragam beserta situs asam amino dan triplet kodon penyandinya disajikan pada.Tabel 4. Komposisi dan situs asam amino beragam pada Tarsius disajikan pada Tabel 5.
704 pb 62pb
48nt 50nt L14841 H15149
Gambar 16. Skema gen Sit b dan sebagian daerah hasil penentuan runutan DNA (berukuran 276 nt) yang dipakai untuk analisis keragaman genetik pada Tarsius sp.
374 pb
Hasil penjajaran asam amino T. spectrum dan T. dianae terlihat adanya asam amino yang merupakan penanda spesifik kedua spesies tersebut. Asam amino tersebut adalah asam amino ke 6 pada T.spectrum berupa isoleusina, metionina, treonina (I,M,T) sedangkan pada T. dianae berubah menjadi valina (V); asam amino ke 22, T berubah menjadi alanina (A); asam amino ke 23, M berubah menjadi T; asam amino ke 29, V berubah menjadi A; asam amino ke 39, glisina (G) berubah menjadi serina (S) dan asam amino ke 42, I berubah menjadi V. Tarsius bancanus (Sumatera) dan T. dianae dapat dibedakan oleh asam amino ke 2, pada T. bancanus berupa asam amino V, sedangkan pada T. dianae berubah menjadi I; asam amino ke 6 leusina (L) ,I berubah menjadi V; asam amino ke 29, V berubah menjadi A; asam amino ke 39, G berubah menjadi S; asam amino ke 42, I berubah menjadi V; asam amino ke 55, M berubah menjadi I; dan asam amino ke 85, T berubah menjadi A.
Tarsius bancanus asal Malaysia (Genbank) dan T. dianae dapat dibedakan pada asam amino ke 2, pada T. bancanus asal Malaysia berupa asam amino V sedangkan pada T. dianae berubah menjadi I; asam amino ke 6, L berubah menjadi V; asam amino ke 9, V berubah menjadi I; asam amino ke 22, T berubah menjadi A; asam amino ke 23, M berubah menjadi T; asam amino ke 29 , V berubah menjadi A; asam amino ke 39, G berubah menjadi S; asam amino ke 41 L berubah menjadi I; asam amino ke 42, I berubah menjadi V; asam amino
Tabel 5. Komposisi dan situs asam amino beragam pada Tarsius hasil penelitan dan T. bancanus asal Malaysia (Genbank)
AA ke 2 (39) 6 (43) 9 (46) 22 (59) 23 (60) 29 (66) 39 (76) T. banc * V L V Tp M V G T. banc V L, I V, I Tp Tp V G T. spec I I, M, Tp I Tp M V G T. diana I V I A Tp A Sp AA ke 41 (78) 42 (79) 45 (82) 55 (92) 78 (115) 85 (122) 92 (129) T. banc * L I L M I Tp M T. banc I, L I M M V, I Tp I, M T. spec I I I, M I I A I, M T. diana I V M I I A M
asal Malaysia (Genbank), …p : polar;
ke 45, L berubah menjadi M; asam amino ke 55, M berubah menjadi I; dan asam amino ke 85, T berubah menjadi A.
Tarsius bancanus (Sumatera) dan T. spectrum dapat dibedakan pada asam amino ke 2, pada T. bancanus berupa asam amino V sedangkan pada
T. spectrum berubah menjadi asam amino I; asam amino ke 23, T berubah menjadi M; asam amino ke 55, M berubah menjadi I; dan asam amino ke 85 ,T berubah menjadi A.
Tarsius bancanus asal Malaysia (Genbank) dan T. spectrum dapat dibedakan oleh asam amino ke 2, pada T. bancanus asal Malaysia berupa asam amino V sedangkan padaT. spectrum berubah menjadi I; asam amino ke 6, V berubah menjadi I, M, T; asam amino ke 9, V berubah menjadi I; asam amino ke 41, L berubah menjadi I; asam amino ke 45, L berubah menjadi M,I; asam amino ke 55, M berubah menjadi I; dan asam amino ke 85, T berubah menjadi A.
Tarsius bancanus asal Malaysia (Genbank) dan T. bancanus dapat dibedakan pada situs asam amino ke 23, pada T. bancanus asal Malaysia berupa asam amino M sedangkan pada T. bancanus berubah menjadi T dan asam amino ke 45, L berubah menjadi M.
Empat belas situs asam amino yang beragam dari semua spesies Tarsius
(Tabel 6), ada 5 situs asam amino beragam yang hanya terdapat pada T. dianae
yaitu berturut-turut asam amino ke 6, yaitu V yang lain L, I, M, T; asam amino ke 22 yaitu A yang lain T; asam amino ke 29 yaitu A yang lain V; asam amino ke 39 yaitu S yang lain G; dan asam amino ke 42 yaitu A yang lain I. Ke lima situs asam amino tersebut dapat dijadikan penanda khusus T. dianae untuk membedakan dengan T. spectrum dan T. bancanus serta terhadap T. bancanus
asal Malaysia (Genbank).
Rata-rata perbedaan asam amino pada spesies T. spectrum adalah 1,5,
T. bancanus (Sumatera) sebesar 2,8, semua spesies Tarsius adalah 5,5. Jika dibandingkan dengan spesies primata lain rata-rata perbedaan asam amino sebesar 14,9. Adanya perbedaan asam amino dari masing-masing spesies
Tarsius tersebut menunjukkan asam amino pada posisi tersebut dapat digunakan sebagai penanda genetik masing-masing spesies. Perbedaan asam amino yang ada tidak bisa dijadikan penanda genetik intra spesies karena perbedaan intra spesies (pada T.spectrum dan T. bancanus) sangat kecil. Hal ini sesuai dengan Kocher et al. (1989), bahwa dari 80 asam amino (situs ke 47 sampai dengan ke 126) dari burung, ikan, rodensia dan manusia yang dianalisis dapat
membedakan masing-masing spesies tersebut. Rata-rata perbedaan asam amino di antara spesies burung adalah 5, sedangkan perbedaan antara burung dengan ikan adalah 23.
Menurut Kocher et al. (1989), dari ke 80 asam amino tersebut, 39 situs asam amino bersifat beragam di antara vertebrata, 37 situs bersifat kekal untuk ke empat spesies yang dianalisis dan 4 situs asam amino (situs ke 80, 83, 97 dan 100) bersifat kekal yang dihubungkan dengan fungsi Sit b. Pada penelitian ini 14 situs asam amino bersifat beragam, dan 78 situs bersifat kekal termasuk ke 4 situs asam amino (ke 80, 83, 97 dan 100) (Gambar 17).
17a 17b 17c
Gambar 17. Posisi asam amino hasil amplifikasi menggunakan primer L14841dan
H15149
17a. situs asam amino beragam antara Tarsius sp. dengan primata lain (dari 92 aa, situs ke 38 s/d 129)
17b. situs asam amino beragam antar spesies Tarsius (92 aa) situs asam amino unik pada T. dianae
17c. situs asam amino beragam di antara vertebrata (dari 80 aa, situs ke 47 s/d 126) (Kocher et al. 1989)
(huruf) situs asam amino kekal (Kocher et al. 1989) situs asam amino kekal yang berhubungan dengan fungsi Sit b
Berdasar sifat kimiawi asam amino, dari keempat belas situs asam amino tersebut ditemukan 37,9% (5,31 dari 14) macam penggantian asam amino yang bersifat non polar menjadi non polar, sebanyak 8,4% (1,17 dari 14) macam asam amino non polar menjadi asam amino polar, 7,1% (1 dari 14) macam asam amino polar menjadi asam amino non polar, dan 45,6% asam amino tidak
38 38
47
129 129
berubah (Tabel 6). Penggolongan asam amino berdasarkan polaritasnya disajikan pada lampiran 6. Keadaan ini sesuai dengan pendapat Dayhoff (1972), bahwa substitusi asam amino lebih sering terjadi pada asam amino yang memiliki kesamaan sifat kimiawi, misalnya polaritas dibanding antara asam amino yang berbeda sifat kimiawinya.
Tabel 6. Perubahan asam amino Sit b parsial hasil penjajaran Tarsius hasil penelitian dengan T. bancanus (Genbank) berdasar sifat kimianya
Asam amino NP Æ NP NP Æ P P Æ NP P Æ P Tdk berubah ke 2 0,67 - - - 0,33 ke 6 0,66 0,17 - - 0,17 ke 9 0,75 - - - 0,25 ke 22 - - 0,33 - 0,67 ke 23 - 0,67 - - 0,33 ke 29 0,33 - - - 0,67 ke 39 - 0,33 - - 0,67 ke 41 0,75 - - - 0,25 ke 42 0,33 - - - 0,67 ke 45 1 - - - - ke 55 0,67 - - - 0,33 ke 78 0,25 - - - 0,75 ke 85 - - 0,67 - 0.33 ke 92 0,4 - - - 0,6 14 5,81 1,17 1 - 6,02
Keterangan: NP: non polar; P: polar
Komposisi asam amino Tarsius sp. disajikan pada lampiran 7, sedangkan rata-rata komposisi asam amino disajikan pada Tabel 7. Komposisi asam amino hasil translasi gen Sit b parsial (Tabel 7) dari Tarsius dan T. bancanus asal Malaysia (Genbank) ternyata dari 20 macam asam amino yang biasanya terdapat di dalam gen tersebut tidak ditemukan 2 macam asam amino, yaitu lisina (Lys) dan prolina (Pro) pada semua spesies Tarsius; ditemukan 11 macam asam amino dalam jumlah yang sama (Cys, Asp, Glu, Phe, His, Asn, Gln, Arg, Ser, Trp dan Tyr) untuk semua spesies Tarsius; ditemukan 1 macam asam amino (Ala) berjumlah sama untuk intra spesies tetapi beragam untuk antar
spesies; ditemukan 1 macam asam amino (Gly) berjumlah sama untuk
T. bancanus (Sumatera), T. spectrum, T. bancanus asal Malaysia; 4 macam asam amino (Ile, Leu, Met, Val) beragam jumlahnya pada T. bancanus
(Sumatera); dan 3 macam asam amino (Ile, Met, Thr) beragam jumlahnya pada
T. spectrum.
Rata-rata komposisi asam amino terbanyak pada T. bancanus, T. spectrum, T. dianae dan T. bancanus asal Malaysia (Genbank) adalah
berturut-turut, leusina dan treonina (10,87%); isoleusina (10,71%); alanina dan leusina (9,78%) dan leusina (13,04%).
Tabel 7. Rata-rata komposisi asam amino hasil translasi gen Sit b parsial T. bancanus,T. spectrum, T. dianae dan primata lain
Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met T.banc* 6,52 3,26 2,17 1,09 8,70 9,78 4,35 5,43 0,0 13,04 7,61 T.banc 6,52 3,26 2,17 1,09 8,70 9,78 4,35 V 6,79 0,0 v 10,87 V 7,07 T.spec 7,61 3,26 2,17 1,09 8,70 9,78 4,35 V 10,71 0,0 9,78 V 7,45 T.diana 9,78 3,26 2,17 1,09 8,70 8,70 4,35 8,70 0,0 9,78 6,52 N.couc* 8,70 3,26 3,26 0,00 8,70 8,70 4,35 11,96 0,0 10,87 5,43 Rata2 7,45 3,26 2,25 1,01 8,70 9,63 4,35 9,16 0,0 10,40 7,14
Asn Pro Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr Total T.banc* 3,26 0,00 1,09 3,26 5,43 9,78 6,52 2,17 6,52 92 T.banc 3,26 0,00 1,09 3,26 5,43 10,87 V 6,79 2,17 6,52 92 T.spec 3,26 0,00 1,09 3,26 5,43 v 9,01 4,35 2,17 6,52 92 T.diana 3,26 0,00 1,09 3,26 5,43 8,70 5,43 2,17 6,52 92 N.couc* 3,26 0,00 1,09 3,26 5,43 9,78 4,35 2,17 5,43 92 Rataan 3,26 0,00 1,09 3,26 5,43 9,63 5,28 2,17 6,44 92 * : Genbank, v : jumlah asam amino dalam kelompok bervariasi.
Lampiran 8 dan lampiran 9 berturut-turut menyajikan matriks perbedaan nukleotida dan asam amino Sit b dari semua Tarsius sp dengan spesies primata lain. Perbedaan asam amino Tarsius hasil penelitian setelah dibandingkan dengan T. bancanus asal Malaysia (Genbank) adalah berkisar antara 0 dan 12 asam amino (0% dan 14%), sedangkan perbedaan nukleotida berkisar antara 2 dan 52 (0,7% dan 18,8%)
Hasil penjajaran berganda runutan nukleotida gen Sit b parsial semua contoh Tarsius sp. pada penelitian tidak terjadi insersi dan delesi sehingga ukurannya tetap sama. Demikian juga terhadap DNA primata lain yang digunakan sebagai pembanding (Lampiran 3). Komposisi nukleotida untuk masing-masing Tarsius disajikan pada lampiran 10. Rata-rata komposisi nukleotida gen Sit b parsial Tarsius sp. disajikan pada Tabel 8. Rata-rata komposisi nukleotida A +T pada T. bancanus, T. spectrum dan T. dianae pada peneitian ini lebih banyak daripada komposisi nukleotida G+C nya. Komposisi A+T paling banyak ditemukan pada T. spectrum (62%) dan paling rendah pada
T. bancanus asal Sumatera (57,1%). Sebaliknya, kandungan G+C paling rendah adalah pada T. spectrum (38%) dan paling tinggi pada T. bancanus asal
Tabel 8. Rata-rata komposisi nukleotida pada gen Sit b parsial Tarsius sp.
T C A G A +T C+G T-1 C-1 A-1 G-1 T-2 C-2 A-2 G-2 T-3 C-3 A-3 G-3 1 27,5 27,2 29,6 15,7 57,1 42,9 28,5 17,1 28,0 26,4 40,2 22,8 18,5 18,5 13,9 41,6 42,4 2,2 2 31,6 22,4 30,4 15,6 62,0 38,0 28,1 16,5 30,4 25,0 41,0 22,0 18,5 18,5 25,1 28,7 42,2 3,3 3 30,8 23,6 29,0 16,7 59,8 41,3 30,4 14,1 28,3 27,2 39,1 23,9 18,5 18,5 22,8 32,6 40,2 4,3 R 30,2 24,1 30,0 15,7 60,2 39,9 28,4 16,5 29,4 25,6 40,6 22,5 18,5 18,5 21,6 33,3 42,1 3,0 4 30,8 24,6 29,0 15,6 59,8 40,2 30,4 17,4 26,1 26,1 41,3 21,7 18,5 18,5 20,7 34,8 42,4 2,2
Keterangan:1.T. bancanus;, 2. T. spectrum , 3. T. dianae, 4. T. bancanus (Genbank)
R: rata-rata 1,2 dan 3
Sumatera (42,9%). Hal ini sesuai dengan pendapat Schmitz et al. (2002) bahwa primata kecil memiliki basa A+T lebih banyak pada gen yang menyandi asam amino dan primata besar lebih banyak basa G+C. Seperti halnya ciri khas gen- gen yang menyandi protein dalam genom mtDNA, keragaman terbesar pada gen Sit b ini terletak pada nukleotida ketiga dari setiap kodon (Randi 1996 dan Butorina et al. 2000). Komposisi nukleotida ketiga dari kodon yang paling banyak adalah nukleotida A (42,1%) kemudian berturut-turut nukleotida C (33,3%),T (21,6%) dan G (3,0%). Komposisi nukleotida kodon kedua adalah yang paling
tidak beragam, basa A dan G dari semua Tarsius hasil penelitian dan
T. bancanus asal Malaysia (Genbank) semua memiliki jumlah yang sama yaitu, masing-masing 18,5%.
Hasil perbandingan ke 276 basa nukleotida gen Sit b parsial Tarsius
dengan T. bancanus asal Malaysia (Genbank), sebanyak 79 nukleotida dikategorikan sebagai situs beragam (Lampiran 3). Dari 79 situs nukleotida beragam tersebut kejadian substitusi paling sering pada basa ketiga dari triplet kodon, yaitu sebanyak 52 kali; basa kesatu dan ketiga dari triplet kodon sebanyak 8 kali; pada basa kesatu dari triplet kodon sebanyak 6 kali; pada basa kedua dari triplet kodon sebanyak dua kali; dan pada basa kesatu, kedua dan ketiga dari triplet kodon sebanyak 1 kali (Tabel 9).
Tabel 9. Jumlah dan posisi basa dari triplet kodon beragam (79 situs) gen Sit b parsial Tarsius sp.
Basa dari triplet kodon yang beragam Jumlah
Ke 1 6
Ke 2 2
Ke 3 52
Ke 1 dan 3 8
Keragaman nukleotida pada penelitian ini terjadi karena adanya substitusi transisi dan transversi. Rasio transisi terhadap transversi dan rata-rata perbedaan asam amino Tarsius sp. disajikan pada Tabel 10. Kejadian transisi dan transversi pada penelitian paling tinggi adalah 38,1 (antara T. dianae dan
T. spectrum) dan 15,3 yaitu antara T. spectrum dan T. bancanus (Genbank), sedangkan kejadian transisi dan transversi paling kecil terjadi berturut-turut antara T. bancanus (Sumatera) dan T. bancanus asal Malaysia (Genbank), yaitu sebesar 18 dan antara T. dianae dan T. spectrum, yaitu 4,6.
Tabel 10. Rasio transisi terhadap transversi (di bawah diagonal) dan rata-rata perbedaan asam amino Tarsius sp. dan primata lain.
T. banc* T. banc T. spec T. dianae N. coucang* T. banc * T. bancanus T. spectrum T. dianae N. coucang* 4,3 7,1 12 16 18/7 7,5 10 15,3 34,1/15,3 33,9/10,6 6,7 14,4 32/11 35,8/6,5 38,1/4,6 18 34/33 34,8/31 36,1/29,7 33/30 Keterangan: * = Genbank
Rata-rata kejadian transisi dan transversi pada basa ke 1, 2 dan 3 setiap kodon disajikan pada Tabel 11. Transisi dan transversi pada penelitian ini paling kecil terjadi pada basa ke 2 setiap kodon yaitu berturut-turut 0,3 (T. spectrum
terhadap T. bancanus asal Malaysia); dan 0,0 (Tarsius hasil penelitian terhadap
T. bancanus asal Malaysia); Transisi dan transversi paling sering terjadi berturut- turut pada basa ketiga (T. dianae terhadap T. spectrum), yaitu 28,0 dan basa
ketiga (N. coucang terhadap T. bancanus asal Malaysia, T. bancanus dan
T. dianae).
Rata-rata rasio transisi terhadap transversi dari T. bancanus, T. spectrum, T. dianae dan T. bancanus (Genbank) adalah 3,68. Rasio tersebut sesuai dengan pendapat Kocher et al. (1989), bahwa substitusi nukleotida pada tingkat spesies sebagian besar adalah transisi sedangkan pada tingkat genus adalah transversi. Pada gen penyandi protein, substitusi nukleotida transisi (yaitu perubahan antara basa purin atau antara basa pirimidin) dan transversi (perubahan dari basa purin menjadi basa pirimidin, dan sebaliknya) dapat menyebabkan perubahan atau tanpa adanya perubahan asam amino yang ditranslasikan. Kejadian transisi dan transversi pada penelitian ini paling sering terjadi pada basa ketiga triplet kodon. Transisi pada basa ketiga tidak
menyebabkan perubahan asam amino dan transversi pada basa ketiga tidak selalu menyebabkan perubahan asam amino. Oleh karena itu, perubahan asam amino pada tingkat spesies sebagian besar adalah asam amino sinonimus sedangkan pada tingkat genus perubahan asam amino sinonimus lebih sedikit terjadi dibanding dengan tingkat spesies. Penggunaan kodon pada Tarsius sp. dapat dilihat pada Lampiran 5.
Dua puluh asam amino penyusun protein disandi oleh 60 triplet kodon, 7 asam amino (Val, Ser, Pro, Thr, ala, Arg, Gly) masing-masing disandi oleh 4 macam triplet kodon (hanya berbeda pada basa ketiga triplet kodon, yaitu A, C, G atau T) dan 12 asam amino (Phe, Ile, Met, Tyr, His, Gln, Asn, Lys, Asp, Glu, Cys dan Trp) disandi masing-masing oleh 2 macam triplet kodon (berbeda pada basa ketiga, yaitu A dan G atau C dan T) dan 1 asam amino (leu) disandi oleh 6 macam kodon ( 4 kodon berbeda pada basa ketiga, 2 kodon berbeda pada basa ke 1 dan basa ke 3). Oleh karena itu, semua kejadian transisi pada basa ketiga triplet kodon tidak akan mengubah asam amino yang ditranslasikan, sedangkan transversi basa ketiga triplet kodon hanya akan mengubah asam amino yang hanya mempunyai 2 macam kodon penyandi. Transisi dan transversi pada basa kesatu dan ketiga dari triplet kodon akan mengubah asam amino yang ditranslasikan kecuali transisi T dan C dari basa kesatu yang menyandi leusin (lampiran 7).
Tabel 11. Rata-rata transisi basa ke 1,2 dan 3 (di bawah diagonal) dan transversi basa ke 1, 2 dan 3 (di atas diagonal) setiap kodon pada gen Sit b parsial Tarsius dan primata lain.
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 2 / 0 / 5 3 / 0 / 12,3 3 / 0 / 8 7 / 2 / 24 2,5 / 1 / 14,5 1 / 0 / 9,6 1 / 0 / 5,5 5 / 2 / 24 6 / 0,3 / 27,9 4,5 / 1,3 / 28,1 0 / 0 / 4,5 4 / 2 / 23,7 10 / 2 / 20 10,3 / 1 / 24,5 7,9 / 2,3 / 28 4 / 2 / 24 10 / 1 / 23 9 / 0 / 25,8 7 / 1,3 / 27,9 14 / 1 / 18
Keterangan: 1. T. bancanus (Genbank); 2. T. bancanus, 3. T. spectrum, 4. T. dianae, 5. N. coucang (Genbank)
Sembilan puluh dua asam amino yang dianalisis pada penelitian ini, terdapat 24 asam amino kekal (nukleotidanya tidak mengalami substitusi), 54 asam amino bersifat sinonimus (nukleotida mengalami substitusi tetapi asam aminonya tetap) dan 14 asam amino bersifat non sinonimus (nukleotida berubah
dan asam aminonya berubah). Rasio antara asam amino kekal, asam amino non sinonimus dan asam amino sinonimus disajikan pada Tabel 12.
Tabel 12. Rasio antara asam amino total, asam amino kekal, asam amino sinonimus dan asam amino non sinonimus Sit b parsial Tarsius sp.
ASAM AMINO
Rasio kekal / total 24/92 = 0,26 Rasio sinonimus / total 54/92 = 0,59 Rasio non sinonimus / total 14/92 = 0,15 Rasio sinonimus / non sinonimus 54/14 = 3,86
Asam amino non sinonimus dan asam amino sinonimus (68 asam amino) pada penelitian ini disebabkan oleh adanya 79 situs nukleotida beragam. Dua puluh dua situs nukleotida beragam menyandi 14 asam amino non sinonimus dan 57 situs nukleotida menyandi 54 asam amino bersifat sinonimus. Kedua puluh dua situs nukleotida beragam (menyandi 14 asam amino non sinonimus) adalah karena substitusi transisi dan transversi basa ke 1 dari triplet kodon, transisi pada basa kedua dari triplet kodon dan transversi basa ketiga dari triplet kodon. Namun, transversi basa ketiga dari triplet kodon tidak selalu mengakibatkan perubahan asam amino. Sedangkan 57 situs nukleotida beragam (menyandi 54 asam amino bersifat sinonimus) merupakan substitusi transisi pada basa ketiga dari triplet kodon, transversi pada basa ketiga dari triplet kodon dan transisi pada basa kesatu dari triplet kodon. Transversi pada basa kedua dari triplet kodon tidak terjadi pada penelitian ini. Transisi yang terjadi pada basa ke 1 adalah perubahan A menjadi G dan G menjadi A, sedangkan transversi terjadi perubahan dari C menjadi A dan C menjadi G. Transisi pada basa ke 2 terjadi perubahan T menjadi C, sedangkan pada basa ke 3 transisi terjadi pada perubahan C menjadi T, A menjadi G, T menjadi C, G menjadi A dan transversi terjadi perubahan dari C menjadi G, C menjadi A, A menjadi C dan A menjadi T.
Hubungan Kekerabatan Tarsius sp. Berdasar Runutan Nukleotida dan Asam Amino Sit b Parsial
Jarak genetik berdasar runutan nukleotida gen Sit b parsial (276 nt) (dapat dilihat pada Lampiran 11), paling kecil sebesar 0,7%, yaitu antara T. spectrum 3 dan T. spectrum 6; T. spectrum 4 dan T. spectrum 6; T. spectrum 5 dan T. spectrum 9, dan nilai paling besar 22,3% yaitu antara T. spectrum 3 dan
T. bancanus (Genbank) serta antara T. spectrum 8 dan T. bancanus (Genbank).
Terhadap T. dianae, jarak genetik paling kecil adalah 16,3% (terhadap
T. bancanus 4) dan jarak genetik paling besar adalah terhadap T. spectrum 8 (19,4%). Jarak genetik keseluruhan berdasarkan nukleotida pertama, kedua dan ketiga pada setiap kodon adalah 13,1%.
Analisis hubungan kekerabatan antar Tarsius dilakukan terhadap 276 nukleotida yang menyusun gen Sit b parsial, dan terhadap 92 asam amino sebagai hasil translasi dari nukleotida tersebut, yang ditunjukkan dengan Gambar 18 dan 19. Dalam gambar tersebut dihasilkan juga hubungan kekerabatan antar Tarsius dengan spesies primata lainnya. Adapun data runutan nukleotida spesies pembanding diambil dari Genbank.
Filogram yang dihasilkan dari nukleotida daerah gen Sit b parsial terlihat bahwa T. spectrum, T dianae dan T. bancanus membentuk cabang tersendiri. Pemisahan ini didukung oleh nilai bootstrap yang tinggi (94%). Pemisahan dengan pola yang sama juga ditunjukkan oleh filogram hasil analisis asam amino
Gambar 18. Filogram menggunakan metode Neighbor joining dari nukleotida
T spec5 (Tangkoko) T spec9 (Tangkoko) T spec7 (Tangkoko) T spec8 (Tangkoko) T spec4 (Air Madidi) T spec3 (Air Madidi) T spec6 (Tangkoko) Tdianae T banc5 T banc8 T banc3 T banc4 N coucang Lemur catta C. albifrons M sylvanus M mulatta Hyl lar Pan troglo Pan panisc G goriilla Homo sapiens 99 45 36 58 46 78 100 51 74 97 58 94 64 70 61 33 69 59 0.02
Sit b parsial. Berdasarkan pola filogram tersebut menunjukkan bahwa hasil yang didapat sama dengan pembagian spesies Tarsius berdasar morfologi dan vokalisasi, yaitu terpisahnya dengan jelas T. syrichta, T. spectrum, T. dianae, T. pumilus, T. pelengensis, T. sangiriensis, dan T. bancanus (Musser dan Dagosto 1987 dan Niemitz et al. 1991).
Pada percabangan T. spectrum terlihat adanya 2 kelompok yang terdiri dari T. spectrum 3, 6, 4 dan 8 dan kelompok lain yang terdiri dari T. spectrum 5, 7 dan 9. Adanya kelompok yang terdiri dari T. spectrum 3 dan 4 (Air Madidi) dengan T. spectrum 6 dan 8 (Tangkoko) menunjukkan bahwa T. spectrum yang