Isolasi Fage
Tiga wilayah di Kabupaten Bogor menjadi lokasi pengambilan sampel limbah cair rumah tangga yaitu: Kelurahan Sindang Barang, Cibeureum dan Babakan Darmaga.
Satu fage spesifik Shigella sp. berhasil diisolasi hanya dari sampel limbah cair rumah tangga Babakan Darmaga dengan inang Shigella 51-X. Hal ini menandakan bahwa di dalam cairan limbah mengandung Shigella 51-X yang merupakan inang bagi fage. Keberhasilan isolasi diperlihatkan dengan terbentuknya plak. Plak mulai dapat teramati setelah masa inkubasi selama 12,5 jam, namun pengamatan setelah masa inkubasi 48 jam pada suhu 37 °C memperlihatkan dampak lisis (plak) lebih jelas (Gambar 3). Morfologi plak memiliki batas yang jelas, tidak disertai pembentukan zona lisis sekunder berupa bayangan. Sel inang mengalami lisis diakhir siklus replikasi fage ketika virion harus keluar dari sel inang untuk menginfeksi sel inang baru (Catalao et al. 2011). Fage yang terisolasi seragam, berukuran kecil dengan bentuk bulat dan rata-rata berdiameter 1,22 mm. Ukuran tersebut tidak jauh berbeda dengan delapan fage spesifik Pseudomonas plecoglossisida yang merupakan patogen terhadap ikan hasil isolasi Park et al (2000) dengan rata-rata diameter plak 1,4 mm. Fage SF-9 spesifik Shigella dysentriae type 1 juga menghasilkan plak berukuran tidak jauh berbeda, yaitu dengan diameter rata-rata 1 mm (Faruque et al. 2003).
A B
Gambar 3 Isolasi fage dengan menggunakan metode dua lapis agar, memperlihatkan; (A) pembentukan plak akibat lisisnya sel inang oleh fage, (B) perlakuan kontrol (tanpa infeksi fage) tidak memperlihatkan pembentukan plak.
Pertumbuhan inang sangat mempengaruhi pembentukan plak, apabila pertumbuhan inang tidak merata akan mempengaruhi kemampuan infeksi fage dari satu sel ke sel lainnya. Pembentukan plak tidak dapat berlangsung jika hanya beberapa sel terdekat saja dapat diinfeksi. Penggunaan media pendukung pertumbuhan bakteri yang lambat dapat menyebabkan penurunan ukuran ledakan sel yang terinfeksi, sehingga plak yang terbentuk juga akan berukuran kecil (Los et al. 2008)
Pengukuran konsentrasi fage di dalam suatu sampel dilakukan melalui prosedur plak assay. Terbentuknya sejumlah plak mencerminkan jumlah fage yang menginfeksi dan melisis sel inang. Perkiraan jumlah fage FY51-X yang menginfeksi dan melisis sel inang adalah 1,84 x 10
. Hal ini berkaitan dengan kemampuan fage dalam bereplikasi, fage akan bereplikasi dengan baik pada saat sel inang berada dalam kondisi pertumbuhan yang optimal yaitu pada fase eksponensial. Kondisi pertumbuhan optimal akan dicapai oleh inang jika nutrisi yang dibutuhkan tersedia dalam jumlah cukup.
8
PFU mL-1. Hasil tersebut menunjukkan kisaran normal yang dibutuhkan untuk melakukan plak assay bagi jenis fage litik dengan menggunakan metode dua lapis agar. Perkiraan jumlah fage yang menginfeksi dan melisis sel bakteri sebelumnya juga telah dilaporkan oleh Clokie dan Kropinski (2009), yaitu 106 – 1011 PFU mL-1 untuk metode dua lapis agar; 108 – 1010 PFU mL-1 untuk pencawanan langsung; dan 106 – 1011 PFU mL-1
Fage merupakan virus yang menginfeksi bakteri dan hanya akan bereplikasi ketika menginfeksi inangnya. Infeksi dimulai ketika genom fage mulai memasuki sel inang dan mengendalikannya untuk membuat salinan asam nukleat serta memproduksi protein fage. Secara umum dapat dikatakan bahwa fage mengalihkan sumberdaya inang untuk memproduksi kebutuhannya. Asam nukleat dan kapsomer diproduksi serta dirakit kembali, maka siklus reproduksi fage dapat dikatakan selesai dan fage siap keluar dengan melisis sel inang. Lisis sel inang dapat diidentifikasi dengan pembentukan plak dan dijadikan standar keberhasilan dalam isolasi dan karakterisasi fage. Kemampuan fage melisis sel bakteri inanngnya dapat dimanfaatkan untuk mengendalikan bakteri-bakteri patogen, termasuk Shigella sp. Pengendalian bakteri patogen dengan menggunakan fage telah sering dipergunakan, untuk small drop plaque assay system.
karena fage dianggap sebagai agen alternatif yang tepat untuk mengendalikan bakteri (Yang et al. 2010).
Kisaran Inang Fage
Kisaran inang berkaitan dengan spesifisitas inang yang ditandai oleh pelekatan dan penetrasi fage pada protein luar inang yang berperan sebagai reseptor. Setiap fage memiliki kisaran inang berbeda-beda. Fage yang terisolasi dalam penelitian ini memiliki kisaran inang sempit, hanya menginfeksi Shigella 51-X (Tabel 2). Hal ini menandakan bahwa fage FY51-X memiliki protein sensor yang hanya dapat mengenali protein reseptor pada Shigella 51-X saja, dengan demikian hanya inang ini saja yang bersifat permisif terhadap fage FY51-X dan dapat dipastikan bahwa diantara semua bakteri uji tidak ada yang memiliki homologi reseptor dengan Shigella 51-X. Kaitan ini dapat dijelaskan karena kisaran inang dipengaruhi oleh spesifisitas dan homologi reseptor yang dimiliki masing-masing inang. Reseptor yang dapat dikenali oleh fage terdapat pada komponen penyusun dinding sel inang, dapat berupa protein; karbohidrat; glikoprotein; lipid; dan lipoprotein. Fage menginfeksi inang menggunakan protein spesifik yang akan ditempelkan pada reseptor di membran luar inangnya (Flores et al. 2011) dengan komponen yang berbeda-beda sebagaimana telah disebutkan sebelumnya. Fage memiliki satu atau lebih protein permukaan yang dapat berinteraksi dengan komponen reseptor, sehingga fage memiliki kemungkinan untuk menempel pada beberapa reseptor spesifik pada dinding sel inang.
Tabel 2 Kisaran inang fage FY51-X terhadap beberapa galur bakteri
Galur inang Reaksi Galur inang Reaksi
Shigella 68 Shigella 25 Shigella 26 Shigella 50 Shigella 42 Shigella 51-M Shigella 98 − − − − − − − Shigella 70 Shigella 51-X Salmonella p19 Salmonella p15 Salmonella p38 Salmonella p84 E. coli non patogen
− + − − − − −
Fage hanya dapat bereproduksi di dalam sel inang yang sesuai. Hal ini dapat dikaitkan dengan sifat umum virus yang merupakan parasit intraseluler obligat. Kondisi seperti ini diperkirakan karena fage tidak memiliki perangkat untuk mesintesis protein untuk dirinya sendiri. Inang fage ditentukan oleh sistem pengenalan fage itu sendiri, sehingga fage hanya dapat meginfeksi satu atau beberapa inang tertentu saja. Identifikasi sel inang fage menggunakan kesesuaian antara protein pada bagian luar fage sebagai sensor dengan molekul-molekul reseptor spesifik pada permukaan sel inang. Reseptor tersebut merupakan molekul yang berperan untuk menjalankan fungsi normal tertentu bagi inang. Reseptor untuk fage spesifik bakteri Shigella diduga merupakan protein yang berperan dalam transport besi untuk keperluan metabolisme sel Shigella (Payne 2006), sama halnya dengan reseptor untuk fage T1 dan T5 yang juga merupakan protein transport besi (Langenscheid et al. 2004). Berbeda dengan fage spesifik Shigella serta fage T1 dan T5, reseptor untuk fage lambda adalah protein yang berperan dalam transport maltose (Moldovan 2005). Tanpa reseptor spesifik fage tidak dapat mengadsorbsi dan menginfeksi inang. Perubahan situs reseptor karena mutasi akan menghasilkan inang resisten terhadap infeksi virus, akan tetapi fage juga dapat dengan cepat bermutasi mengimbangi mutasi inang sehingga tetap dapat melekat pada inang yang resisten.
Fage merupakan entitas biologi yang memiliki kemampuan untuk bereplikasi dan tumbuh, serta menginfeksi bakteri inang dengan kisaran relatif sempit. Kemampuan ini tidak dimiliki oleh antibiotik. Potensi yang dimiliki tersebut menjadi keunggulan dan sekaligus kekurangan bagi aplikasi fage dibandingkan antibiotik. Kisaran inang sempit memungkinkan bagi fage hanya menginfeksi dan mengeliminasi bakteri tertentu tanpa harus mengganggu flora normal usus.
Fage dapat berevolusi untuk memperluas kisaran inang dengan secara kontinyu mengurangi panjang ekor (Forde et al. 2008), sehingga memungkinkan fage kisaran inang sempit dapat memperluas kisaran inangnya. Kemampuan berevolusi memberikan keunggulan tambahan bagi fage dibandingkan antibiotik. Keaktifan bereplikasi memberikan kemungkinan yang besar bagi fage untuk bermutasi dan memungkinkan untuk memperluas kisaran inang dan mengatasi kemungkinan bakteri menjadi resisten. Hal ini tidak dapat dilakukan oleh antibiotik yang merupakan molekul statis yang tidak memiliki kemampuan untuk merespon perubahan sifat
bakteri inang. Pada umumnya fage memang memilki kisaran inang sempit, namun sebagaimana dijelaskan bahwa fage memiliki kemampuan untuk berevolusi maka ditemukan beberapa fage seperti fage 7888 spesifik S. sonnei (Strauch et al. 2001b) yang memiliki kisaran inang luas terhadap isolat Shigella lainnya, termasuk S. dysenteriae type 1 dan juga isolat E.coli dengan homologi reseptor inang berupa lipopolisakarida kasar pada dinding selnya. Kemudian fage lainnya yang memiliki kisaran inang luas yaitu AR1 dan LG1 (Goodridge et al. 2003), yang mampu melisis E. coli dan beberapa enterobakteri; seperti Proteus mirabilis, S. dysenteriae, dan dua isolat Salmonella.
Stabilitas Fage terhadap Suhu dan pH
Fage FY51-X relatif stabil pada suhu 20 dan 37 °C pada semua durasi waktu uji. Toleransi fage terhadap suhu berkorelasi dengan suhu optimum pertumbuhan inang, yaitu 37 °C untuk Shigella sp. (Aberoumand 2010). Namun, peningkatan suhu menyebabkan fage mengalami penurunan aktivitas dan bahkan sama sekali tidak memperlihatkan aktivitas yang ditandai oleh tidak adanya plak pada suhu 60 °C (Gambar 4). Kestabilan dapat dilihat dari jumlah hitungan fage relatif. Hitungan fage relatif mengalami reduksi rata-rata sebesar 13,2%; 52,5%; dan 67% masing-masing untuk suhu 20, 43 dan 50 °C. Serta benar-benar mencapai titik terendah pada suhu 60
°C. Selanjutnya, pengujian stabilitas terhadap pH memperlihatkan bahwa fage ini stabil pada pH netral (7) dan lebih toleran terhadap kondisi asam dibandingkan kondisi basa (Gambar 5), dengan hitungan fage relatif rata-rata mengalami reduksi antara 48 – 54% untuk pH 3 – 5; dan di atas 50% untuk pH 8 – 10. Meskipun kisaran pH pertumbuhan fage umumnya luas, berkisar antara 5 – 9; dengan pH optimum 5 – 6, namun rata-rata fage stabil pada pH 7 (Jończyk et al. 2011).
Pemanfaatan fage sebagai biokontrol patogen membutuhkan pemahaman yang baik mengenai efek faktor lingkungan terhadap aktivitas fage. Kondisi ini disebabkan oleh adanya faktor lingkungan yang berpengaruh terhadap stabilitas interaksi fage dengan inang (Flores et al. 2011). Faktor lingkungan tidak hanya berpengaruh terhadap multiplikasi fage tetapi juga terhadap mekanisme infeksi (Burns & Slater 1982; Tey et al. 2009). Virus, termasuk fage merupakan parasit obligat yang membutuhkan inang untuk bereproduksi. Suhu, pH dan laju transfer massa
merupakan parameter lingkungan yang sangat penting yang tidak hanya berpengaruh terhadap infeksi fage tetapi juga pertumbuhan inang yang penting bagi keberlangsungan multiplikasi fage.
Gambar 4 Stabilitas fage FY51-X terhadap suhu inkubasi 20, 37, 43 dan 50°C (perlakuan suhu 60°C tidak menunjukkan aktivitas lisis) selama 10 (■),
30 (■) dan 60 menit (■).
Faktor lingkungan, yaitu suhu dan pH merupakan parameter fisik yang memiliki peranan penting dalam kompleksnya mekanisme fisiologi makhluk hidup. Suhu dan pH yang terlalu rendah atau tinggi tidak memungkinkan mikroorganisme untuk tumbuh optimal. Variasi kebutuhan akan kedua faktor lingkungan ini merupakan refleksi kisaran rata-rata habitat dimana mikroorganisme tersebut berada. Peningkatan atau penurunan suhu dan pH berpengaruh terhadap laju reaksi kimia dan ezimatik mikroorganisme, membawa dampak pada laju pertumbuhan, serta dapat menimbulkan perubahan fisiologi protein dan mutasi.
Fage memiliki kemampuan yang berbeda-beda antara satu dan lainnya dalam hal respon terhadap variasi kondisi fisik lingkungan. Chandra et al (2011) melaporkan bahwa fage memiliki kemampuan adaptasi yang cukup baik dan cukup luas terhadap variasi pH yang berkisar antara 4 – 10. Namun, hasil bertolak belakang diperlihatkan pada kestabilan terhadap suhu, fage dapat bertahan pada suhu di bawah
0 100 200 300 400 500 600 700 800 20 37 43 50 Jum la h f age /pl ak ( P F U m L -1) Suhu (oC)
50 °C dan terus menurun seiring dengan peningkatan suhu hingga tidak ditemukan sama sekali adanya aktivitas pada suhu 60 °C.
Gambar 5 Stabilitas fage FY51-X terhadap pH 3, 4, 5, 7, 8, 9 dan 10; masing-masing diinkubasi selama 30(■), 60 (■), 120 (■) menit dan 24 jam (■).
Suhu memegang peranan penting dalam tahapan perkembangbiakan fage, seperti penempelan; penetrasi ke sel inang; multiplikasi dan periode laten. Pada suhu rendah pergerakan fage menjadi lebih lambat untuk mencapai inang, sehingga berpengaruh terhadap penempelan fage ke permukaan sel inang, dengan demikian hanya sedikit fage yang mampu melakukan penetrasi ke sel inang. Hal ini terjadi karena semakin lama fage terpapar dengan suhu yang tidak sesuai maka akan berimplikasi pada semakin banyaknya fage yang mengalami reduksi. Proses reduksi terus berlangsung seiring pertambahan waktu, baik pada suhu di bawah suhu optimum (37 °C) maupun di atasnya, hingga mencapai titik kritis pada suhu terlalu tinggi. Demikian juga dengan pH, di dalam masing-masing unit pH uji dengan semakin lamanya durasi waktu uji akan memperlihatkan reduksi jumlah fage. Sehingga pada akhirnya dapat diprediksi hanya sedikit fage yang akan bermultiplikasi. Hal ini juga dilaporkan oleh Tey et al (2009), dimana dalam percobaan yang dilakukan memperlihatkan bahwa titer fage mencapai jumlah
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 3 4 5 7 8 9 10 Jum la h f age /pl ak ( P F U m L -1) pH
tertinggi pada pH 7, diikuti pH 6 dan 8. Kemudian, titer fage juga mencapai jumlah tertinggi pada suhu 37 °C, diikuti suhu 27 dan 42 °C.
Kondisi jumlah fage yang mencapai kestabilan pada pH 7 dengan suhu inkubasi 37 °C juga dilaporkan oleh (Verthe et al. 2004). Jumlah fage tersebut kemudian secara bertahap menurun ketika pH meningkat di atas 7, yaitu pada kondisi lingkungan dalam keadaan basa. Ketidakstabilan fage terhadap suhu dan pH diperlihatkan dengan penurunan jumlah plak atau sama sekali tidak terbentuk plak. Suhu dan pH mempengaruhi stabilitas lipid membran, laju sintesis DNA, dan laju sintesis protein (Pope et al. 2004). Sehingga berpengaruh pada struktur dan kesesuaian protein, serta interaksi antara protein dengan protein yang berfungsi sebagai sensor pada fage (Tan et al. 2004). Terganggunya sensor protein akibat ketidakstabilan atau terdenaturasinya protein struktural fage oleh suhu dan pH yang tidak sesuai menyebabkan fage kehilangan kemampuan untuk menginfeksi inang, dan akhirnya gagal memperbanyak diri karena DNA fage tidak terinjeksi ke sel inang.
Di sisi lain, pada suhu tinggi akan memperpanjang periode laten (Burns & Slater 1982), sehingga akan dibutuhkan periode yang panjang dari tahapan infeksi ke tahapan
Selain berpengaruh terhadap kemampuan fage menempel pada permukaan inang, pH lingkungan juga memberikan dampak terhadap aktivitas enzimatik inang dan berefek terhadap reproduksi fage dan laju pertumbuhan inang (Tey et al. 2009). Dampak pH terhadap perkembangan fage dijelaskan oleh Jończyk et al (2011). Pada pH rendah fage akan mengalami koagulasi dan pengendapan. Koagulasi akan terjadi pada pH 2, sedangkan pengendapan akan terjadi pada pH 3 dan 4. Namun, jika fage yang mengalami pengendapan terdapat dalam jumlah banyak metode pengocokan
multiplikasi. Kemudian, Tey et al. (2009) melaporkan bahwa produksi fage lebih rendah pada suhu 27 dan 42 °C dibandingkan suhu 37 °C. Hal ini dikaitkan dengan peranan suhu terhadap aktivitas enzim seluler, dimana suhu optimum untuk semua enzim seluler berkisar antara 20 – 40 °C. Pada suhu rendah, aktivitas enzim juga akan rendah dan akan memperlambat metabolisme sel secara keseluruhan, yang akan memicu perlambatan pertumbuhan sel inang dan perkembangbiakan fage. Kebalikannya, suhu yang terlalu tinggi menyebabkan enzim seluler akan mengalami denaturasi.
dapat dipergunakan untuk menghomogenkannya kembali di dalam pelarut, tetapi daya infeksi fage setelah dihomogenkan tidak dijelaskan.
Faktor lingkungan lain yang berpengaruh terhadap aktivitas fage adalah musim. Huynh dan Kory (1993) melaporkan bahwa fage spesifik Pseudomonas lebih sedikit ditemukan pada musim panas dibandingkan fage Enterococcus dan Colifage, konidisi ini dapat disebabkan oleh kerentanan fage terhadap suhu, variasi jumlah inang dan curah hujan. Sedangkan Chibani-Chennoufi et al (2004) melaporkan jumlah titer fage di Norwegia lebih banyak pada musim dingin dibandingkan musim panas. Musim dingin diperkirakan merupakan kondisi lingkungan optimal bagi bakteri inang untuk tumbuh dan berkorelasi terhadap peningkatan jumlah fage.
Penentuan Berat Molekul Protein
Berat molekul protein fage FY51-X dianalisis dengan sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Hasil analisis memperlihatkan sejumlah protein struktural dari fage ini, sekitar 8 pita protein diperlihatkan pada gel pemisah (Gambar 6), dengan berat molekul masing-masing 86,18; 58,80; 54,47; 44,42; 38,12; 31,09; 22,89; dan 19,65 kDa. Perkiraan ukuran berat molekul protein tersebut berada dalam kisaran berat molekul protein fage SboM-AG3 spesifik Shigella boydii (Anany et al. 2011), yang memiliki 15 pita protein dengan berat molekul sekitar 12,7 – 126,3 kDa. Molekul protein dengan berat tertentu menunjukkan bahwa protein tersebut merupakan penyusun bagian tertentu dari fage seperti kepala, ekor dan serbut ekor.
Beberapa fage telah diketahui berat molekul protein strukturalnya, antara lain fage spesifik Pseudomonas fluorescens (Sillankorva et al. 2008) yang memiliki kemiripan dengan fage yang termasuk ke dalam supergrup fage T7. Fage ini memiliki protein struktural dengan berat masing-masing 63,1 kDa (ekor); 59,7 kDa (leher); 45,2 kDa (mayor kapsid); 30,6 kDa (penyusun kapsid); dan 18,6 kDa (virion internal).
1 2
Gambar 6 Profil SDS-PAGE fage FY51-X memperlihatkan 8 pita protein, dengan berat molekul berkisar 19,65 sampai 86,18 kDa, (1 = marker, 2 = fage FY51-X)
Protein struktural fage dapat dideterminasi lebih lanjut untuk mendapatkan derajat homologi antar protein struktural penyusun berbagai fage. Hasil determinasi tersebut dapat digunakan untuk melihat hubungan kekerabatan berdasarkan residu asam amino pada sekuen N-terminalnya. Salah satu homologi diperlihatkan antara fage spesifik Pseudomonas fluorescens (Sillankorva et al. 2008) dengan fage BA3 (serabut ekor), ϕYeO3-12 dan T3 (mayor kapsid), homologinya mencapai 80%. Masing-masing bagian dari fage disusun oleh beberapa protein struktural dengan berat molekul berbeda-beda seperti dilaporkan oleh Lu et al (2005). Hasil analisis secara detil protein struktural fage JL-1 memperlihatkan bahwa protein penyusun kepala terdiri dari tiga molekul protein dengan berat masing-masing 34, 45 dan 61 kDa. Protein penyusun ekornya masing-masing dengan berat molekul 28, 50 dan 76 kDa.
Efektivitas Lisis Sel Bakteri Shigella sp. oleh Fage
Hasil pengujian efektivitas lisis menunjukkan bakteri yang diinokulasi tanpa fage (kontrol) mulai memperlihatkan peningkatan jumlah sel berdasarkan angka nilai kerapatan optik setelah 1 jam masa inkubasi dan terus meningkat sampai 12 jam. Kultur bakteri yang ditambahkan dengan fage juga menunjukkan pertumbuhan setelah 1 jam masa inkubasi, namun setelah 2 jam pertumbuhannya mulai mengalami
97 kDa 66 kDa 45 kDa 30 kDa 20,1 kDa 86,18 kDa 58,80 kDa 54,47 kDa 44,42 kDa 38,12 kDa 31,09 kDa 22,89 kDa 19,65 kDa
tekanan oleh peningkatan jumlah fage (Gambar 7). Setelah masa inkubasi mencapai 4 jam, jumlah sel bakteri menurun drastis hingga masa inkubasi 12 jam. Penelitian Park et al (2000) memperlihatkan bahwa pertumbuhan bakteri tanpa penambahan fage mulai mengalami peningkatan jumlah sel setelah 6 jam masa inkubasi. Perlakuan dengan penambahan fage memperlihatkan pertumbuhan bakteri tertekan selama 12 jam setelah 2 jam masa inkubasi dan secara cepat meningkat kembali dalam durasi waktu 24 – 48 jam setelah masa inkubasi. Hasil pada Gambar 4 juga menunjukkan bahwa fage FY51-X efektif melisis bakteri inang Shigella sp. pada 4 jam setelah masa inkubasi. Dengan demikian waktu optimal lisis fage ini adalah 4 jam setelah
inkubasi, relatif lambat jika dibandingkan dengan fage λ (Shao & Wang, 2008)
dengan waktu lisis optimal 29,3 – 68 menit. Waktu lisis dipengaruhi oleh laju adsorbsi. Fage dengan laju adsorbsi tinggi akan memiliki rata-rata waktu lisis pendek (cepat), demikian juga sebaliknya.
Gambar 7 Efektivitas lisis sel bakteri Shigella oleh fage FY51-X; (ж) kontrol Shigella tanpa fage, (♦) Shigella yang diinfeksi fage, (▲) jumlah fage (PFUx103).
Siklus hidup fage sama dengan siklus hidup virus pada umumnya yang terdiri dari tiga tahapan, yaitu fage mencari inang untuk memulai infeksi, memproduksi progeni di dalam sel inang, dan keluar dari sel inang untuk melanjutkan siklus hidup baru. Secara khusus untuk fage litik, tahapan tersebut dapat diringkas menjadi adsorbsi, replikasi, maturasi dan lisis. Infeksi dimulai pertama sekali dengan
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Jum la h fa g e/ pl ak ( P F U x10 3) R apa t opt is ( O D600 nm ) Waktu (Jam)
menempel pada permukaan inang yang rentan. Adsorbsi dapat berlangsung jika ada kesesuaian protein pada serat ekor fage dengan reseptor pada permukaan sel inang. Kemampuan adsorbsi juga ditentukan oleh kerapatan sel inang. Kemampuan adsorbsi akan menentukan efektivitas lisis.
Pertumbuhan fage selain ditentukan oleh kesesuaian protein, juga ditentukan oleh kerapatan sel inang. Ketika jumlah sel inang meningkat pada 1 jam setelah masa inkubasi, fage juga mengalami pertumbuhan hingga mencapai keseimbangan 2 jam setelah masa inkubasi dan selanjutnya secara perlahan melampaui periode eklips dan mulai melisis sel bakteri. Pertumbuhan fage akan dimulai setelah selesainya periode eklips, umumnya 30 – 40 menit setelah inokulasi pada suhu 37 oC (Kasman et al. 2002). Periode ini dibutuhkan fage untuk menginjeksi genomnya ke inang, mengekspresikan gen, dan merakit progeni yang selanjutnya dilepaskan ke lingkungan. Kerapatan sel inang sangat rendah akan menyebabkan terjadinya penundaan peningkatan jumlah fage sehingga jumlahnya tidak akan melampaui jumlah fage yang diinfeksikan pada awal masa inkubasi. Jika kemampuan lisis sel inang oleh fage pada perlakuan awal memperlihatkan laju yang lambat, maka dapat dilakukan peningkatan konsentrasi fage hingga mencapai konsentrasi sama dengan inangnya (Barrow et al. 1998).