Halaman 1 Strategi penelitian
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstrak Metanol Daun Kari
Rendemen ekstrak metanol daun kari yang dihasilkan dari proses maserasi menggunakan sampel kering daunMurraya koenigiisebanyak 20.94%. Rendemen ekstrak yang dihasilkan lebih besar dari rendemen yang dihasilkan oleh penelitian Rao (2005) sebesar 20.15%. Hal tersebut dapat disebabkan oleh sumber tanaman yang berbeda sehingga kandungan unsur hara maupun lingkungan tempat tanaman tumbuh berbeda yang mempengaruhi banyaknya metabolit sekunder yang dihasilkan (Hernani & Rahardjo 2005). Ekstrak yang diperoleh berwarna hijau tua pekat dengan aroma khas mirip daun teh (Gambar 3).
Gambar 3 Ekstrak kasar metanol daun kari.
Komponen Fitokimia
Penapisan fitokimia pada ekstrak metanol dilakukan untuk mengetahui jenis senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam ekstrak sampel. Hasil uji fitokimia ekstrak metanol 99% daun kari dapat dilihat pada Tabel 2. Hasil uji fitokimia ini tidak jauh berbeda dengan hasil penelitian Muthumani (2009) menggunakan metanol 87%, dengan metode ekstraksi soxlet yang terbukti mengandung saponin dan alkaloid. Menurut Hernani & Rahardjo (2005) metanol sering digunakan sebagai pelarut senyawa yang lebih polar seperti senyawa fenolik dan polifenolik sehingga senyawa flavonoid, tanin, alkaloid dapat terekstrak dengan baik. Berdasarkan hasil uji fitokimia tersebut diharapkan ada senyawa yang berperan sebagai hepatoprotektor.
Tabel 2 Hasil uji fitokimia ekstrak metanol daun kari
Senyawa Hasil Uji Alkaloid -Wagner +++ -Meyer ++ -Dragendorf +++ Tanin +++ Saponin ++ Flavonoid - Kuinon - Triterpenoid - Steroid +
+:sedikit terdeteksi, ++: terdeteksi sedang, +++: terdeteksi kuat, -: tidak terdeteksi.
Bobot Badan Tikus dan Konsumsi Pakan pada Tahap Adaptasi hingga Perlakuan
Berdasarkan pengamatan, bobot badan tahap adaptasi semua tikus mengalami peningkatan signifikan (p<0.05) dari hari minus 14 hingga hari ke-0 sebesar 29.67% yang dapat dilihat pada Gambar 4. Kenaikan bobot badan pada tahap adaptasi dipengaruhi oleh tingkat konsumsi pakan dan umur tikus yang berada pada masa pertumbuhan (mature point), yaitu kurang dari 6 bulan. Umur tikus yang digunakan pada awal adaptasi adalah ±2 bulan. Kondisi ini menunjukkan tikus dalam keadaan sehat, tidak terdapat gangguan pertumbuhan, kalorinya tercukupi, serta tidak adanya zat toksikan dalam pakan (Lu 2006).
9
Gambar 4 Grafik rata-rata bobot badan tikus kelompok N ( ), KN ( ), KP ( ), ED200 (X), dan ED300 ( ) pada tahap adaptasi hingga perlakuan.
Gambar 5 Grafik rata-rata konsumsi pakan tikus kelompok N ( ), KN ( ), KP ( ), ED200 (X), dan ED300 ( ) pada tahap adaptasi hingga perlakuan.
Menurut lembaga riset Ace Animal (2006), bobot badan tikus jenis Sprague Dawley pada usia 59-61 hari adalah 275-299 g, sedangkan bobot badan pada usia 70-77 hari sebesar 350- 399 g. Perbedaan bobot badan akhir tahap adaptasi, yaitu 170-250 g dengan bobot badan tikus lembaga riset tersebut diduga disebabkan oleh perbedaan kadar protein dalam pakan, dan konsumsi pakan. Konsumsi rata-rata pakan tikus selama tahap adaptasi mengalami peningkatan tidak signifikan (p>0.05) sebesar 13% dan fluktuatif (Gambar 5). Hal tersebut diduga disebabkan oleh proses penyesuaian pola makan dan lingkungan baru yang berbeda. Konsumsi pakan tikus pada awal masa adaptasi adalah 17.36±2.35 g dan akhir tahap adaptasi 19.68±0.48g.
Rata-rata bobot badan tikus tidak mengalami peningkatan yang signifikan pada hari ke-7 dan hari ke-14, yaitu sekitar 0.002% dan 5.24%. Respon peningkatan bobot badan
rendah dan fluktuatif tersebut dapat dilihat pada Gambar 4. Hal ini diduga disebabkan oleh stres tikus akibat pencekokkan yang mengakibatkan menurunnya nafsu makan dengan pola konsumsi yang tidak menunjukkan adanya peningkatan (Gambar 5).
Penurunan nafsu makan hari ke-14 diduga selain karena stres juga disebabkan oleh pemberian parasetamol. Gan (1980) menyatakan bahwa pemberian parasetamol dalam dosis berlebih dapat menimbulkan gejala-gejala anoreksia, mual, muntah, serta sakit perut yang terjadi dalam 24 jam pertama, dan dapat berlangsung terus menerus selama seminggu atau lebih. Gejala-gejala inilah yang menyebabkan nafsu makan hewan coba menurun.
Peningkatan rata-rata bobot badan tikus terjadi pada hari ke-21. Rata-rata bobot badan tikus pada hari ke-21 meningkat sebesar 4.76% secara signifikan (p<0.05) dari 250.73±8.34 g menjadi 262.67±10.14 g (Gambar 4). Peningkatan BB yang paling tinggi ditunjukkan oleh kelompok ED200 yaitu 6.33%, 5.46% (ED300), dan 4.8% (N). Kelompok lain menunjukkan peningkatan BB yang lebih rendah, yaitu 3.58% (KP), dan 3.56% (KN). Kenaikan bobot badan ini didukung oleh konsumsi pakan rata-rata yang juga mengalami kenaikan 6.38% walaupun tidak signifikan (p>0.05) (Gambar 5).
Secara keseluruhan bobot badan tikus maupun konsumsi pakan tikus rata-rata mengalami peningkatan dimulai dari tahap adaptasi hingga hari ke-21. Pemberian ekstrak dapat dikatakan tidak memberikan pengaruh yang signifikan terhadap pertumbuhan tikus karena kenaikan cenderung fluktuatif dan tidak menentu. Kenaikan bobot badan tikus selama percobaan diduga karena kondisi tikus yang masih berada dalam tahap pertumbuhan (<6 bulan).
Aktivitas ALT dan AST Selama Tahap Perlakuan
Hasil pengukuran serum hari ke-0 menunjukkan rata-rata aktivitas ALT semua tikus adalah 3.23±2.58 U/L (Lampiran 13 dan 14). Selain itu rata-rata aktivitas AST serum awal adalah 2.92±1.89 U/L. Berdasarkan penelitian Murugesh et al. (2005) aktivitas ALT dan AST tikus adalah 43.1±0.87 U/L dan 61.2±1.6 U/L. Perbandingan kadar AST dan ALT tikus kelompok normal jika dibandingkan literatur tidak sesuai. Namun menurut Wurochekke et al.(2008) kadar AST dan ALT bisa saja dapat mencapai kisaran 0 apabila tikus tidak memiliki penyakit yang dapat
10
mempengaruhi peningkatan aktivitas AST dan ALT. Kedua enzim tersebut tetap diproduksi namun dalam jumlah yang lebih kecil.
Berdasarkan percobaan aktivitas ALT kelompok normal (N) mengalami peningkatan dari hari ke-0 hingga ke-7 kemudian mengalami penurunan pada hari ke-14 dan mengalami kenaikan lagi pada hari ke-21 (Gambar 6 dan 7). Aktivitas AST kelompok N juga terus mengalami peningkatan dari hari ke- 0 hingga ke-21. Pada hari ke-21 aktivitas AST peningkatannya lebih tinggi dari kelompok perlakuan lainnya. Aktivitas ALT dan AST yang fluktuatif pada kelompok normal tersebut
diduga dapat disebabkan stres akibat pencekokan dan pengambilan darah terutama pada hari ke-21 yang dapat dilihat pada Gambar 6 dan 7. Menurut penelitian Leventet al. (2006) stres oksidatif dapat menurunkan kadar superoksida dismutase dan meningkatkan pembentukan radikal bebas reactive oxygen species(ROS) sehingga membran sel rusak dan enzim-enzim tertentu keluar dari membran sel ke darah seperti ALT dan AST. Keluarnya enzim tersebut menunjukkan peningkatan aktivitas ALT dan AST.
Gambar 6 Aktivitas ALT serum tikus rata-rata semua kelompok perlakuan pada hari ke-0 ( ), hari ke-7 ( ), hari ke-14 ( ), dan hari ke-21 ( ).
Gambar 7 Aktivitas AST serum tikus rata-rata semua kelompok perlakuan pada hari ke-0 ( ), hari ke-7 ( ), hari ke-14 ( ), dan hari ke-21 ( ).
Aktivitas ALT dan AST kelompok kontrol negatif (KN) terus mengalami peningkatan dari
hari ke-0 hingga ke-21 dengan kisaran 40-100 U/L. Peningkatan aktivitas ALT dan AST
11
kelompok KN jauh lebih tinggi dibandingkan kelompok lainnya (kecuali kelompok N pada hari ke-21) yang dapat dilihat pada Gambar 6 dan 7. Hal tersebut menunjukkan adanya perusakan hati yang terus berlangsung dan gagalnya mekanisme pertahanan antioksidan endogen dalam kehadiran radikal bebas yang berlebih (Balamuruganet al.2008). Pemberian parasetamol selama 21 hari terbukti dapat merusak sel hati yang terlihat dari peningkatan aktivitas ALT dan AST kelompok KN, berbeda dengan kelompok ekstrak dan kontrol positif yang hanya diberi parasetamol selama 7 hari. Tingginya aktivitas ALT dan AST juga menggambarkan kondisi stres oksidatif pada sel hepatosit. Kondisi ini terjadi akibat aktivitas NAPKI dan konjugat GSH-acetaminophen
yang dapat meningkatkan pembentukan
reactive oxygen species (ROS) seperti anion superoksida (O2•-), radikal hidroksil (•OH), dan
hidrogen peroksida (H2O2) (Tiwari & Khosa
2010). ROS akan mengoksidasi fosfolipid secara berantai yang disebut oksidasi lipid. Hal ini mengakibatkan kerusakan sel hati sampai timbul nekrosis hati, yaitu terjadinya gangguan integritas membran plasma, keluarnya isi sel, dan timbulnya respon inflamasi. Respon ini menyebabkan banyak sel yang mati (Gibson & Sket 1991) yang ditandai dengan peningkatan ALT dan AST, bilirubin, alkalin fosfatase, gamma glutamil transferase, serta dehidrogenase laktat pada serum (Firmansyah 2006).
Gambar 6 dan 7 menunjukkan aktivitas ALT dan AST pada kelompok kontrol positif (KP) mengalami peningkatan dari hari ke-0 hingga ke-7 namun tidak signifikan dibandingkan kelompok normal. Peningkatan aktivitas ALT dan AST terlihat cukup tinggi pada hari ke-14 sebesar 28% akibat pemberian parasetamol. Pada hari ke-21 aktivitas ALT dan AST kelompok KP menurun diduga akibat kandungan ekstrak silimarin dan kurkumin pada obat Curliv®plus yang diberikan pada hari ke-7 hingga ke-21. Berdasarkan penelitian Adji (2004). kurkumin dapat menghambat peningkatan konsentrasi lipid peroksida, serta menurunkan aktivitas ALT dan AST pada tikus Sprague Dawley yang diinduksi parasetamol selain itu, silimarin mampu menurunkan secara nyata aktivitas GGT, ALT, dan AST serum pada hati yang rusak (Tedescoet al.2004).
Gambar 6 dan 7 juga memperlihatkan aktivitas ALT dan AST pada kelompok ekstrak dosis 200 mg/KgBB (ED200) dan ekstrak dosis 300 mg/kgBB (ED300) mengalami peningkatan dari hari ke-0 hingga hari ke-14. Peningkatan pada hari ke-7 tidak signifikan
dibandingkan kelompok N, namun peningkatan pada hari ke-14 cukup besar, yaitu 492.57% (AST) dan 3.39% (ALT) pada ED200 dan 688.58% (AST) pada ED300. Hal tersebut diduga akibat pemberian parasetamol. Aktivitas ALT dan AST pada kedua kelompok ekstrak pada hari ke-21 mengalami penurunan 16.21% (ED200), dan 33.82% (ED300) untuk ALT 33.82% (ED200), dan 62.60% (ED300) untuk AST yang dapat dilihat pada Gambar 5 dan 6. Penurunan aktivitas ALT dan AST tersebut lebih besar dibandingkan penurunan ALT dan AST kelompok kontrol positif (KP) sebesar 7.64% dan 29.17%. Penurunan tersebut diduga akibat adanya kandungan tanin, saponin, alkaloid, dan steroid pada ekstrak.
Kandungan saponin pada ekstrak diduga membantu memperbaiki sel hati dan menurunkan aktivitas AST dan ALT. Batubara (2003) menyebutkan bahwa saponin dari akar kuning (Archangelisia flavaL. Merr) dapat menghambat peningkatan konsentrasi lipid peroksida, serta menurunkan aktivitas ALT dan AST pada tikus Sprague Dawley yang diinduksi parasetamol.
Kandungan tanin pada ekstrak diduga membantu memperbaiki sel hati dan menurunkan aktivitas AST dan ALT dengan cara menghilangkan senyawa radikal bebas. Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan Yen dan Hui (1995) yang membuktikan bahwa tanin pada teh telah terbukti mampu menghambat proses mutasi, membersihkan radikal bebas, dan menginduksi enzim yang bersifat antioksidan. Tanin terbukti mempunyai aktivitas antioksidan dan menghambat pertumbuhan tumor (Robinson 1995).
Alkaloid, dan steroid pada ekstrak metanol dapat menurunkan aktivitas ALT dan AST diduga karena kemampuannya menangkap senyawa radikal bebas. Berdasarkan penelitian Wang et al. (2003) alkaloid dan steroid dapat berperan sebagai donor elektron dan bereaksi dengan radikal bebas membentuk senyawa yang lebih stabil Selain itu alkaloid dapat berperan sebagai reduktor yang diduga karena kemampuannya menyumbangkan gugus hidrogen (Shimadaet al.1992).
Rasio aktivitas ALT/AST pada manusia maupun tikus normalnya adalah >1 (Imperiale
et al. 2000). Berdasarkan percobaan dari hari ke-14 hingga 21 aktivitas AST lebih besar dengan kisaran 46.66-200.4 U/L dibandingkan ALT dengan kisaran 29.90-111.6 U/L sehingga rasio ALT/AST <1 diduga disebabkan oleh sumber AST yang tidak hanya terdapat di hati tetapi juga banyak ditemukan
12
pada otot rangka, pankreas, jantung dan ginjal. Faktor stres ketika pengambilan darah mengakibatkan peningkatan aktivitas saraf simpatik perifer yang berhubungan dengan aktivitas otot rangka sehingga meningkatkan aktivitas AST (Arakawaet al.1996). Selain itu, berdasarkan penelitian Siddiq et al. (2007) rasio ALT/AST <1 atau AST/ALT >1 diduga menunjukkan adanya kelainan hati berupa hepatitis C maupun sirosis hati.
Gambaran Histopatologi Hati
Hasil pengamatan mikroskopik sel hati kelompok normal (N) dapat dilihat pada Gambar 8 yang menunjukkan bahwa tidak ada perubahan maupun kelainan yang berarti. Hasil pengamatan menunjukkan sel hati memiliki inti hepatosit yang terlihat jelas, adanya sitoplasma di dalam membran sel, dan sel-sel hepatosit yang tersusun melingkar dari vena sentralis.
Hasil pengamatan kelompok kontrol negatif (KN) yang diberi parasetamol dosis 500 mg/Kg BB menunjukkan adanya perubahan sel hati berupa pembelahan sel abnormal yang ditunjukkan oleh sel besar berinti banyak (sel membesar dan memiliki inti sel lebih dari 1) yang ditunjukkan oleh Gambar 9. Selain itu terlihat adanya nekrosis (kematian sel). Pada Gambar 9 nekrosis ditandai dengan terlihatnya inti sel hati yang mengalami penyusutan dan warnanya gelap. Secara mikroskopik, nekrosis bersifat koagulatif yang ditandai dengan inti hepatosit berubah menjadi suram, gelap, dan terdapat inti hepatosit yang mengalami karioreksis (penyusutan inti sel, mengecil dan akhirnya menghilang) (Nabib 1987).
Gambar 8 Gambaran histopatologi jaringan hati kelompok normal (N). Vena sentralis ( ) Perbesaran 100x, pewarnaan HE.
Gambar 9 Gambaran histopatologi jaringan hati kelompok kontrol negatif (KN) yang diberi parasetamol. Nekrosis ( ), sel besar berinti banyak ( ). Perbesaran 100x, pewarnaan HE.
Gambar 10 Gambaran histopatologi jaringan hati kelompok ekstrak dosis 300 mg/Kg BB (ED300). Sel basofilik/regenerasi sel ( ), vena portalis( ). Perbesaran 100x, pewarnaan HE.
Hasil pengamatan mikroskopik kelompok yang diberi perlakuan ekstrak metanol daun kari dosis 300 mg/Kg BB dapat dilihat pada Gambar 10. Hasil pengamatan menunjukkan adanya penyembuhan hepatosit yang ditunjukkan adanya sel basofilik yang berwarna biru. Warna merah keunguan sel hati pada bagian vena portalis meluas ke arah vena sentralis menunjukkan adanya perbaikan sel hati. Penyembuhan yang terjadi diduga oleh adanya proses regenerasi sel hati yang dibantu oleh kandungan senyawa antioksidan yang terdapat pada ekstrak.
Berdasarkan uji statistik, hasil skoring lesio jaringan hati (Tabel 7) untuk kelompok KP, ED200, dan ED300 tidak berbeda secara signifikan (p>0.05) jika dibandingkan dengan kelompok N. Nilai lesio jaringan hati kelompok normal sebesar 0.6 ± 0.55 yang menandakan persentase kerusakan sebesar 0%.
13
Hasil lesio histopatologi jaringan hati kelompok KN besarnya 2 yang menunjukkan terjadinya kerusakan jaringan hati sekitar 25- 50% dari area pandang pengamatan jaringan hati (Tabel 7). Konsentrasi AST dan ALT yang terus meningkat pada kelompok KN di hari ke- 21 didukung oleh teramatinya nekrosis sel atau kerusakan organ hepatosit (Gambar 9) akibat parasetamol secara anatomi akan terlihat dengan adanya bercak-bercak pada hati (Ariadini 2007). Nagy et al. (2007) menjelaskan induksi parasetamol dosis tinggi menyebabkan kematian sel hepatosit secara apoptosis maupun nekrosis. Hasil lesio histopatologi jaringan hati kelompok ekstrak dosis 200 mg/Kg BB dan 300 mg/Kg BB menunjukkan persentase kerusakan sebesar 0%.
Tabel 7 Hasil uji histopatologi hati yang diberi perlakuan ekstrak dan parasetamol kelompok skoring N 0.6 ± 0.55(a) KN 2 ± 0.50(b) KP 0.4± 0.55(a) ED200 0.4± 0.58(a) ED300 0.6± 0.50a) Keterangan : nilai dengan huruf yang berbeda
pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0.05).