Hasil analisis ragam menunjukkan bahwa perlakuan kombinasi TDZ dan BA berpengaruh nyata terhadap persentase eksplan berkalus, volume kalus, dan warna kalus nodular. Kalus nodular terbentuk pada minggu ketiga setelah inisiasi. Berdasarkan Tabel 11, persentase eksplan berkalus yang tertinggi diperoleh dari 5 perlakuan (TDZ 0.1 mg l-1; TDZ 0.5 mg l-1; TDZ 1.0 mg l-1; kombinasi TDZ 0.1 mg l-1 dan BA 0.7 mg l-1; serta kombinasi TDZ 1.0 mg l-1 dan BA 0.7 mg l-1). Volume kalus terbanyak (skor 2.14) diperoleh dari perlakuan kombinasi TDZ 1.0 mg l-1 dan BA 0.7 mg l-1. Hal ini berarti kalus yang terbentuk hanya menutupi eksplan sekitar 50%. Kurang melimpahnya kalus, diduga karena perlakuan kombinasi TDZ dan BA hanya mampu menginduksi kalus pada bagian bekas potongan dan nodul yang masih muda, sedangkan bagian nodul yang telah tua dan
31 mengeras serta bagian eksplan yang posisinya jauh dari permukaan media sulit untuk berkalus.
Secara visual, semua perlakuan menghasilkan struktur kalus yang kompak, namun ukuran nodul-nodul yang terbentuk antar perlakuan relatif berbeda. Perlakuan TDZ 0.1 mg l-1 dan kombinasi TDZ 0.1 mg l-1 dengan BA 0.7 mg l-1 menghasilkan nodul yang berukuran lebih kecil daripada perlakuan lainnya. Warna kalus antar perlakuan juga berbeda, yaitu putih atau putih kekuningan (Tabel 11 dan Gambar 14).
Tabel 11. Pengaruh perlakuan TDZ dan BA terhadap induksi kalus nodular manggis klon Wanayasa, 10 MST.
ZPT (mg l-1 ) Eksplan berkalus (%) Volume kalus (skor) Struktur Kalus Warna Kalus MS0 (tanpa ZPT) 0.00c 0.00c - -
TDZ 0.1 100.00a 1.25b Kompak Putih
TDZ 0.5 100.00a 1.20b Kompak Putih
TDZ 1.0 100.00a 1.29b Kompak Putih kekuningan
BA 0.7 28.57b 1.00b Kompak Putih kekuningan
TDZ 0.1 + BA 0.7 100.00a 1.14b Kompak Putih
TDZ 0.5 + BA 0.7 87.50a 1.50b Kompak Putih kekuningan TDZ 1.0 + BA 0.7 100.00a 2.14a Kompak Putih kekuningan
Keterangan : Angka-angka pada kolom yang sama yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf 5% uji selang berganda Duncan.
Selain kalus nodular, pada perlakuan BA 0.7 mg l-1 terbentuk tunas sebanyak 85.71%, sedangkan pada perlakuan lainnya tidak terbentuk. Terbentuknya tunas pada perlakuan ini karena ZPT yang digunakan berasal dari kelompok sitokinin. Sitokinin dalam konsentrasi tertentu akan menginduksi pembentukan tunas, terutama BA yang sering digunakan untuk menginduksi tunas pada manggis.
Gambar 14. Penampilan kalus nodular manggis klon Wanayasa pada perlakuan TDZ dan BA, 10 MST (A) MS0; (B) TDZ 0.1 mg l-1; (C) TDZ 0.5 mg l-1; (D) TDZ 1.0 mg l-1; (E) BA 0.7 mg l-1; (F) TDZ 0.1 mg l-1 + BA 0.7 mg l-1; (G) TDZ 0.5 mg l-1 +BA 0.7 mg l-1; dan (H) TDZ 1.0 mg l-1 +BA 0.7 mg l-1.
32
Regenerasi Kalus Nodular Membentuk Tunas Kalus nodular klon Wanayasa
Berdasarkan hasil pengamatan selama 10 MST, tidak terjadi morfogenesis dari kalus nodular menjadi tunas. Sebaliknya, yang terjadi adalah perubahan warna kalus dari putih dan putih kekuningan menjadi coklat. Pencoklatan terbesar (55.56%) terjadi pada perlakuan kombinasi TDZ 0.5 mg l-1 dan GA3 0.05 mg l-1. Kalus yang tidak mengalami perubahan warna berasal dari perlakuan kombinasi TDZ 0.3 mg l-1 dan GA3 0.05 mg l-1 (Tabel 12).
Tabel 12. Pengaruh perlakuan TDZ dan GA3 terhadap morfogenesis kalus nodular menjadi tunas manggis klon Wanayasa, 10 MST.
ZPT (mg l-1) Pembentukan tunas Struktur kalus Warna kalus Putih kekuningan Coklat TDZ 0.1 0 Kompak 55.56bc 44.44ab TDZ 0.3 0 Kompak 88.89ab 11.11bc
TDZ 0.5 0 Kompak 77.78abc 22.22abc
TDZ 0.1 + GA3 0.05 0 Kompak 77.78abc 22.22abc
TDZ 0.3 + GA3 0.05 0 Kompak 100.00a 0.00c TDZ 0.5 + GA3 0.05 0 Kompak 44.44c 55.56a
Keterangan : Angka-angka pada kolom yang sama yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf 5% uji selang berganda Duncan.
Kombinasi TDZ dan GA3 tidak mampu meregenerasikan tunas yang berasal dari kalus (Gambar 15). Pada subkultur berikutnya seluruh perlakuan tersebut tidak mampu meregenerasikan kalus membentuk tunas. Sebaliknya, persentase kalus yang mencoklat semakin meningkat.
Gambar 15. Penampilan kalus nodular manggis klon Wanayasa pada media regenerasi, 10 MST (A) TDZ 0.1 mg l-1; (B) TDZ 0.3 mg l-1; (C) TDZ 0.5 mg l-1; (D) TDZ 0.1 mg l-1 + GA3 0.05 mg l-1; (E) TDZ 0.3 mg l-1 + GA3 0.05 mg l-1; (F) TDZ 0.5 mg l-1 + GA3 0.05 mg l-1.
33 Kalus nodular klon Sicincin
Pengaruh perlakuan terhadap morfogenesis kalus nodular mulai kelihatan pada minggu ketiga setelah subkultur. Hal tersebut ditandai dengan semakin padat dan jelasnya struktur nodular pada kalus. Pada sebagian kalus, terjadi perubahan warna dari putih kekuningan menjadi kehijauan. Setelah itu, terbentuk calon tunas. Umumnya, pada media regenerasi tidak terjadi lagi proliferasi kalus nodular, kecuali pada perlakuan kombinasi BA 0.7 mg l-1 dan TDZ 0.5 mg l-1 (Gambar 16). Pada media tersebut terbentuk kalus nodular baru dengan persentase yang rendah (data tidak ditampilkan).
Tabel 13. Pengaruh perlakuan BA dan TDZ terhadap morfogenesis kalus nodular menjadi tunas manggis klon Sicincin, 10 MST.
ZPT (mg l-1 )
Kalus beregenerasi
(%)
Jumlah tunas per eksplan Panjang tunas (cm) BA 0.7 75.00ab 18.33a 0.65 BA 1.4 62.50ab 9.60ab 0.85 BA 2.8 87.50a 6.29b 0.27 BA 0.7 + TDZ 0.5 75.00ab 7.17ab 0.25 BA 1.4 + TDZ 0.5 25.00b 1.00b 0.20 BA 2.8 + TDZ 0.5 50.00ab 6.00b 0.42
Keterangan : Angka-angka pada kolom yang sama yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (uji selang berganda Duncan).
Gambar 16. Penampilan tunas manggis klon Sicincin pada media regenerasi, 10 MST (A) BA 0.7 mg l-1; (B) BA 1.4 mg l-1; (C) BA 2.8 mg l-1; (D) BA 0.7 mg l-1 + TDZ 0.5 mg l-1; (E) BA 1.4 mg l-1 + TDZ 0.5 mg l-1; (F) BA 2.8 mg l-1 + TDZ 0.5 mg l-1.
34
Hasil analisis ragam menunjukkan bahwa perlakuan berpengaruh nyata terhadap persentase kalus beregenerasi dan jumlah tunas yang dihasilkan (Tabel 13). Untuk peubah panjang tunas, pengaruh perlakuan tidak memberikan pengaruh yang nyata. Persentase kalus beregenerasi tertinggi (87.50%) diperoleh dari perlakuan BA 2.8 mg l-1. Jumlah tunas yang terbanyak (18.33 tunas per eksplan) diperoleh dari perlakuan BA 0.7 mg l-1. Panjang tunas yang dihasilkan dari masing-masing perlakuan berkisar antara 0.20–0.85 cm (Tabel 13).
Secara umum, perlakuan BA secara tunggal mempunyai kemampuan yang lebih baik dalam meregenerasikan tunas daripada yang dikombinasikan dengan TDZ. Qosim et al. (2005) melaporkan bahwa penggunaan BA 0.5 mg l-1 menghasilkan kalus nodular beregenerasi membentuk tunas tertinggi (34.7%) dengan 7.8 tunas per eksplan. Hasil penelitian ini terbukti lebih baik daripada yang telah dilaporkan Qosim et al. (2005). Hal ini juga menunjukkan bahwa penggunaan BA dalam konsentrasi rendah lebih cocok digunakan untuk induksi tunas dari kalus nodular.
SIMPULAN
Kombinasi TDZ dan BA dapat menginduksi kalus nodular manggis. Media terbaik untuk induksi kalus nodular adalah kombinasi TDZ 1.0 mg l-1 dan BA 0.7 mg l-1. Penggunaan kombinasi TDZ dan GA3 tidak mampu meregenerasikan kalus nodular membentuk tunas. Perlakuan terbaik untuk regenerasi kalus nodular adalah BA 0.7 mg l-1, tunas yang diperoleh rata-rata 18.33 tunas per eksplan.
35
5 REGENERASI MELALUI EMBRIOGENESIS SOMATIK
PENDAHULUAN
Embriogenesis somatik merupakan pembentukan embrio dari sel somatik. Pola pertumbuhan embriogenesis somatik ada dua macam, yaitu embriogenesis langsung dan tidak langsung. Keberhasilan embriogenesis somatik manggis akan sangat membantu pemuliaan manggis secara in vitro, baik berupa variasi somaklonal dan transformasi genetik.
Keberhasilan regenerasi melalui embriogenesis somatik berbagai tanaman telah banyak dilaporkan, di antaranya pada tanaman mangga (Patena et al. 2002; Ermayanti dan Rantau 2009), jeruk manis (Cardoso dan Martinelli 2012), dan kopi (Oktavia et al. 2003; Riyadi dan Tirtoboma 2004). Pada tanaman manggis, regenerasi embriogenesis somatik telah dilaporkan oleh Elviana et al. (2011), Rohani (2012), dan Rineksane (2012).
Induksi embrio somatik umumnya menggunakan ZPT auksin, terutama 2,4-D dan pikloram. Penggunaan 2,4-2,4-D untuk embriogenesis somatik telah dilaporkan pada tanaman kopi (Oktavia et al. 2003, Riyadi dan Tirtoboma 2004), jeruk (Kiong et al. 2008), pepaya (Susanto et al. 2008) dan sagu (Riyadi et al. 2005), sedangkan penggunaan pikloram telah dilaporkan pada tanaman nenas (Rostika 2012), persik (Steinmacher et al. 2007), dan anyelir (Karami 2007). Namun penggunaan 2,4-D untuk induksi embriogenesis somatik pada manggis menghasilkan kalus yang sulit beregenerasi (Te-chato 1998; Rohani et al. 2012). Selain auksin, penggunaan sitokinin (khususnya TDZ dan BA) untuk induksi embriogenesis somatik juga telah dilaporkan pada tanaman kakao (Li et al. 1998), gula bit (Zhang et al. 2001), kacang tanah (Murch et al. 1999; Victor et al. 1999) dan cabe (Khan et al. 2006). Penggunaan kombinasi TDZ 0.7 mg l-1 dan BA 0.7 mg l-1 pada manggis menghasilkan embrio somatik (struktur globular) sebesar 40% (Elviana et al. 2011).
Keberhasilan embriogenesis somatik, selain ditentukan oleh ZPT, juga ditentukan oleh penggunaan senyawa organik lainnya, misalnya kasein hidrolisat dan ekstrak malt. Al-khayri (2011) melaporkan bahwa penggunaan kasein hidrolisat 1000 mg l-1 pada tanaman kurma dapat menginduksi embrio somatik sebanyak 29 embrio per eksplan. Menurut George dan de Klerk (2008), kasein hidrolisat dapat menjadi sumber kalsium, fosfat, beberapa unsur mikro, vitamin dan campuran 18 asam amino. Penggunaan ekstrak malt 1000 mg l-1 pada tanaman arbei dapat menginduksi embrio somatik sekunder sebesar 88% (Agarwal et al. 2004).
Penelitian mengenai embriogenesis somatik pada manggis masih sangat sedikit dilaporkan. Pembahasannya pun baru mengenai struktur globular. Oleh karena itu penelitian ini bertujuan untuk menentukan formulasi media yang cocok untuk menginduksi kalus embriogenik dan pembentukan embrio somatik pada manggis.
BAHAN DAN METODE
Penelitian dilaksanakan dari bulan Mei 2013 sampai April 2014, di Laboratorium Kultur Jaringan, Kelti BSJ, Balai Besar Penelitian dan
36
Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian Bogor (BB Biogen). Uji Histologi di Laboratorium Pertumbuhan dan Perkembangan Tumbuhan, Fakultas Biologi Universitas Gajah Mada (UGM). Bahan tanaman yang digunakan adalah daun dan batang muda in vitro dari klon Leuwiliang. Bahan kimia yang digunakan antara lain media dasar MS (hara makro, hara mikro, danvitamin), BA, TDZ, kasein hidrolisat (CH), ekstrak malt (EM), glutamin, PVP, sukrosa, dan phytagel. Bahan yang digunakan untuk uji histologi, yaitu larutan FAA, larutan dehidrasi, parafin, dan pewarna safranin dan fast green.
Penelitian terdiri atas dua percobaan, yaitu induksi kalus embriogenik dan pembentukan embrio somatik. Data yang diperoleh dianalisis secara statistik menggunakan program Statistical Analysis System (SAS 9.1). Nilai rata-rata dihitung dan dibandingkan menggunakan uji selang berganda duncan (DMRT) pada taraf 5% (P<0.05).
Induksi Kalus Embriogenik
Percobaan disusun dalam Rancangan Acak Lengkap (RAL). Terdapat delapan kombinasi perlakuan ZPT, yaitu TDZ (0, 0.1, 0.5, dan 1.0 mg l-1) dan BA (0 dan 0.7 mg l-1). Eksplan yang digunakan adalah batang muda in vitro dari klon Leuwiliang. Setiap perlakuan diulang 8 kali (botol) sehingga terdapat 64 satuan percobaan. Pada setiap botol dikulturkan empat potongan batang muda in vitro
dengan panjang ±0.5 cm atau daun muda in vitro dengan ukuran 0.5x0.5 cm. Media dasar yang digunakan adalah media MS (dilengkapi dengan sukrosa 30 g l -1
, phytagel 2.5 g l-1, glutamin 300 mg l-1, dan PVP 100 mg l-1). Eksplan diinkubasi pada ruang gelap dengan suhu 25±1 oC. Pengamatan dilakukan selama 10 minggu. Peubah yang diamati adalah jumlah eksplan berkalus, bobot kalus, volume kalus, struktur kalus secara visual dan warna kalus. Pengukuran volume kalus menggunakan sistem skoring. Skor 1 apabila kalus menutupi <1/4 bagian eksplan,
skor 2 apabila kalus menutupi 1/4−1/2 bagian eksplan, skor 3 apabila kalus menutupi 1/2−3/4 bagian eksplan, dan skor 4 apabila kalus menutupi >3/4 bagian eksplan.
Pembentukan Embrio Somatik
Percobaan disusun menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL). Terdapat empat macam perlakuan, yaitu kasein hidrolisat (CH) dan ekstrak malt (EM) (masing-masing 500 dan 1000 mg l-1). Setiap perlakuan diulang 10 kali (botol). Pada setiap botol perlakuan ditanami empat agregat kalus dari batang muda dan dua agregat kalus dari daun muda. Media dasar yang digunakan adalah media MS (dilengkapi dengan sukrosa 30 g l-1, phytagel 2.5 g l-1, TDZ 0.1 mg l-1, glutamin 300 mg l-1, dan PVP 100 mg l-1). Kultur diinkubasi pada ruang gelap dengan suhu 25±1 ⁰C. Pengamatan dilakukan selama 10 minggu. Peubah yang diamati adalah jumlah kalus yang membentuk embrio somatik, jumlah embrio per eksplan, struktur embrio secara mikroskopis.
37 HASIL DAN PEMBAHASAN
Induksi Kalus Embriogenik Eksplan daun muda in vitro
Pengaruh pemberian TDZ baik secara tunggal maupun yang dikombinasikan dengan BA baru terlihat pada 2 MST. Hal tersebut ditandai dengan pembengkakan jaringan pada bagian bekas potongan daun, terutama di bagian tulang daun. Kalus umumnya sudah terbentuk pada 3 MST dengan volume yang sedikit.
Hasil analisis ragam menunjukkan bahwa perlakuan berpengaruh nyata terhadap persentase eksplan berkalus, bobot dan volume kalus. Persentase kalus tertinggi (100%) diperoleh dari kombinasi perlakuan TDZ 1.0 mg l-1 dan BA 0.7 mg l-1 (Tabel 14). Hal ini berarti TDZ sangat berperan penting dalam menginduksi kalus pada eksplan. Pada percobaan ini, kombinasi TDZ 0.5 mg l-1 dan BA 0.7 mg l-1 tidak mampu menginduksi kalus. Diduga bahwa respon eksplan bersifat
genotype dependent, karena pada percobaan Elviana et al. (2011) dan Rohani et al.
(2012) perlakuan yang sama dapat menginduksi kalus embriogenik masing-masing sebesar 3.33% dan 20%.
Bobot kalus tertinggi diperoleh dari perlakuan TDZ 0.1 mg l-1 dan kombinasi TDZ 1.0 mg l-1 dengan BA 0.7 mg l-1. Volume kalus terbesar (skor 4) diperoleh dari perlakuan kombinasi TDZ 1.0 mg l-1 dan B 0.7 mg l-1 (Tabel 14). Volume skor 4 menandakan lebih dari 75% atau keseluruhan eksplan telah diselubungi oleh kalus.
Tabel 14. Pengaruh perlakuan TDZ dan BA terhadap pembentukan kalus manggis klon Leuwiliang dari eksplan daun muda in vitro, 10 MST.
ZPT (mg l-1) Eksplan berkalus (%) Bobot kalus (g) Volume kalus (skor) MS0 (tanpa ZPT) 0.00c 0.00c 0.00c
TDZ 0.1 80.00ab 0.35a 3.80a
TDZ 0.5 83.33ab 0.12b 3.17ab
TDZ 1.0 75.00ab 0.15b 3.00ab
BA 0.7 0.00c 0.00c 0.00c
TDZ 0.1 + BA 0.7 58.33b 0.16b 2.17b
TDZ 0.5 + BA 0.7 0.00c 0.00c 0.00c
TDZ 1.0 + BA 0.7 100.00a 0.34a 4.00a
Keterangan : Angka-angka pada kolom yang sama yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf 5% uji selang berganda Duncan.
Pada setiap perlakuan juga terdapat perbedaan struktur dan warna kalus. Struktur kalus dapat dibedakan menjadi dua jenis, yaitu semi friable (agak remah) dan kompak. Struktur kalus semi friable dengan warna putih dan putih kekuningan diperoleh dari perlakuan TDZ 0.1 mg l-1 dan kombinasi perlakuan TDZ 0.1 mg l-1 dengan BA 0.7 mg l-1, sedangkan dari perlakuan lainnya menghasilkan struktur kalus yang kompak dan berwarna putih kekuningan (Tabel
38
15 dan Gambar 17). Kalus yang bersifat semi friabel berpotensi membentuk embrio somatik, diawali dengan pembentukan struktur globular. Berdasarkan percobaan ini, TDZ memegang peranan penting dalam membentuk struktur kalus. TDZ dalam konsentrasi rendah (0.1 mg l-1) dapat digunakan untuk menginduksi kalus embriogenik manggis. Menurut Fiola et al. (1990), penggunaan TDZ >1 µM dapat merangsang pembentukan kalus, tunas adventif, dan embrio somatik.
Tabel 15. Pengaruh perlakuan TDZ dan BA terhadap struktur dan warna kalus manggis klon Leuwiliang dari eksplan daun muda in vitro, 10 MST. ZPT
(mg l-1 )
Struktur kalus Warna kalus
MS0 (tanpa ZPT) - -
TDZ 0.1 semi friable Putih
TDZ 0.5 Kompak putih kekuningan
TDZ 1.0 Kompak putih kekuningan
BA 0.7 - -
TDZ 0.1 + BA 0.7 semi friable Putih kekuningan
TDZ 0.5 + BA 0.7 - -
TDZ 1.0 + BA 0.7 Kompak putih kekuningan
Gambar 17. Penampilan kalus embriogenik manggis klon Leuwiliang dari eksplan daun muda in vitro pada media induksi kalus embriogenik, 10 MST (A) MS0 (B) TDZ 0.1 mg l-1; (C) TDZ 0.5 mg l-1; (D) TDZ 1.0 mg l -1
; (E) BA 0.7 mg l-1; (F) TDZ 0.1 mg l-1 +BA 0.7 mg l-1; (G) TDZ 0.5 mg l-1 +BA 0.7 mg l-1; dan (H) TDZ 1,0 mg l-1 +BA 0.7 mg l-1. Eksplan batang muda in vitro
Respon in vitro dari eksplan batang muda diawali dengan terjadinya pembengkakan pada bagian potongan atau yang terluka. Hasil analisis ragam menunjukkan bahwa formulasi media berpengaruh nyata terhadap peubah yang diamati. Dari delapan perlakuan, tujuh formulasi media mampu menginduksi pembentukan kalus. Kombinasi perlakuan TDZ 0.5 mg l-1 dan BA 0.7 mg l-1 tidak mampu menginduksi kalus. Persentase eksplan berkalus berkisar antara 42.86–
100%. Bobot basah kalus terbesar (0.36 g per eksplan) diperoleh dari kombinasi perlakuan TDZ 1.0 mg l-1 dan BA 0.7 mg l-1. Volume kalus terbesar (skor 4)
39 diperoleh dari perlakuan TDZ 0.1 mg l-1, kombinasi TDZ 0.1 mg l-1 dan BA 0.7 mg l-1 serta kombinasi TDZ 1.0 mg l-1 dan BA 0.7 mg l-1 (Tabel 16).
Munculnya kalus pada media MS0 tanpa pemberian ZPT serupa dengan yang ditemukan pada tanaman tembakau (George dan Sherrington, 1984). Selain itu, pemberian BA 0.7 mg l-1 secara tunggal juga menghasilkan tunas dalam jumlah sedikit. Struktur kalus yang terdapat pada perlakuan MS0 dan BA 0.7 mg l-1 agak berbeda dengan perlakuan lainnya, yaitu sangat kompak dengan nodul-nodul yang tidak terlalu jelas (Gambar18).
Tabel 16. Pengaruh perlakuan TDZ dan BA terhadap induksi kalus manggis klon Leuwiliang dari eksplan batang muda in vitro, 10 MST.
ZPT (mg l-1 ) Eksplan berkalus (%) Bobot kalus (g) Volume kalus (skor) MS0 (tanpa ZPT) 42.86c 0.04c 1.00c
TDZ 0.1 100.00a 0.28ab 4.00a
TDZ 0.5 100.00a 0.20b 3.63b
TDZ 1.0 100.00a 0.22b 3.75ab
BA 0.7 71.88b 0.03c 1.00c
TDZ 0.1 + BA 0.7 96.88a 0.26ab 4.00a
TDZ 0.5 + BA 0.7 0.00d 0.00c 0.00d
TDZ 1.0 + BA 0.7 100.00a 0.36a 4.00a
Keterangan : Angka-angka pada kolom yang sama yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf 5% uji selang berganda Duncan.
Tabel 17. Pengaruh perlakuan TDZ dan BA terhadap struktur dan warna kalus manggis klon Leuwiliang dari eksplan batang muda in vitro, 10 MST.
ZPT (mg l-1 )
Struktur kalus Warna kalus
MS0 (tanpa ZPT) Kompak Putih kekuningan TDZ 0.1 semi friable Putih
TDZ 0.5 Kompak putih kekuningan TDZ 1.0 Kompak putih kekuningan BA 0.7 Kompak putih kekuningan TDZ 0.1 + BA 0.7 semi friable Putih
TDZ 0.5 + BA 0.7 - -
TDZ 1.0 + BA 0.7 Kompak putih kekuningan
Sruktur kalus semi friable diperoleh dari perlakuan TDZ 0.1 mg l-1 dan kombinasi TDZ 0.1 mg l-1 dengan BA 0.7 mg l-1 dengan warna kalus putih (Tabel 17; Gambar 18 dan 19). Kalus yang bersifat semi friabel berpotensi membentuk embrio somatik, diawali dengan pembentukan struktur globular.
40
Gambar 18. Penampilan kalus embriogenik manggis klon Leuwiliang dari eksplan batang muda in vitro pada media induksi kalus embriogenik, 10 MST (A) MS0 (B) TDZ 0.1 mg l-1; (C) TDZ 0.5 mg l-1; (D) TDZ 1.0 mg l-1; (E) BA 0.7 mg l-1; (F) TDZ 0.1 mg l-1 +BA 0.7 mg l-1; (G) TDZ 0.5 mg l-1 +BA 0.7 mg l-1; dan (H) TDZ 1.0 mg l-1 +BA 0.7 mg l-1.
Gambar 19. Bentuk kalus pada manggis (A) semi friable dan (B) kompak. Pembentukan Embrio Somatik
Hasil percobaan menunjukkan bahwa penambahan CH dan EM tidak mampu menginduksi pembentukan embrio somatik. Secara visual, kalus yang awalnya semi friable berubah menjadi kompak (Gambar 20). Selain itu, pemberian CH dan EM pada media membuat sebagian besar kalus menjadi mencoklat. Pada eksplan yang berasal dari daun, kalus yang awalnya berwarna putih dan putih kekuningan berubah warna menjadi coklat dan akhirnya menjadi mati. Media yang paling banyak menyebabkan kalus coklat adalalah perlakuan CH 1000 dan EM 500 (masing-masing 50%) (Gambar 21).
Gambar 20. Penampilan kalus manggis klon Leuwiliang pada media pembentukan embrio somatik, 8 MST. (A) CH 500 mg l-1; (B) CH 1000 mg l-1; (C) EM 500 mg l-1; dan (D) EM 1000 mg l-1.
41
Gambar 21. Pengaruh CH dan EM terhadap perubahan warna kalus pada media pembentukan embrio somatik manggis klon Leuwiliang dari eksplan daun muda in vitro, 8 MST.
Gambar 22. Pengaruh CH dan EM terhadap perubahan warna kalus pada media pembentukan embrio somatik manggis klon Leuwiliang dari eksplan batang muda in vitro, 8 MST.
Kalus yang berasal dari batang muda in vitro juga mengalami kondisi yang sama dengan kalus yang berasal dari daun muda in vitro. Secara visual, kalus yang awalnya semi friable berubah menjadi kompak. Sebagian besar kalus menjadi mencoklat. Media yang paling banyak menyebabkan kalus mencoklat adalah perlakuan EM 500 dan EM 1000 (masing-masing 31.25 dan 69.23%) (Gambar 22). Selain itu, kalus yang awalnya semi friable dan berwarna putih, ketika disubkultur ke media yang mengandung CH dan EM, kalusnya menjadi agak kompak dan warna berubah menjadi putih kekuningan. Kalus yang berada dekat media berangsur-angsur berubah menjadi coklat. Pada umur 2 MST telah dapat dilihat proses perubahan warna tersebut, kalus menjadi lebih berair dan
0 20 40 60 80 100 CH 500 CH 1000 EM 500 EM 1000 Wa rna K a lus ( %) Konsentrasi CH dan EM (mg l-1) Putih Coklat muda Coklat tua
0 20 40 60 80 100 CH 500 CH 1000 EM500 EM1000 Wa rna k a lus ( %) Konsentrasi CH dan EM (mg l-1) Putih Coklat muda Coklat tua
42
berangsur-angsur berubah menjadi berwarna coklat muda dan selanjutnya coklat tua. Perubahan warna menjadi coklat tersebut kemudian diikuti oleh seluruh bagian kalus (Gambar 23). Proses pencoklatan sangat cepat sekali terjadi apabila kalus manggis disubkultur pada media yang tidak tepat.
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa penggunaan CH dan EM tidak efektif untuk meningkatkan pembentukan embrio somatik pada manggis. Hasil yang berbeda dilaporkan oleh Gholami et al. (2013), bahwa pemberian EM 500 mg l-1 pada media pembentukan embrio somatik jeruk menghasilkan struktur globular 36.50%, hati 35.15%, torpedo 33.70%, dan kotiledon 31.90%. Pada embriogenesis somatik sawit, pemberian CH 500 mg l-1 menghasilkan sebanyak 29.3 embrio per eksplan (Al-Khayri 2011).
Gambar 23. Perubahan warna kalus pada media pembentukan embrio somatik manggis klon Leuwiliang, 8 MST (A) kalus berwarna putih kekuningan, (B) kalus coklat muda, dan (C) kalus coklat tua dan mati.
Karena terjadi pencoklatan, kalus-kalus yang masih hidup dan berwarna putih atau putih kekuningan disubkultur ke media MS dengan penambahan TDZ 0.5 mg l-1 dan BA 0.7 mg l-1. Pada subkultur pertama, terjadi perubahan struktur kalus menjadi lebih seragam dan padat, kemudian menghijau dan mulai terlihat struktur globular. Pada subkultur kedua, biakan diinkubasi di ruang terang dengan cahaya intensitas rendah, struktur-struktur globular tersebut mulai menghijau dan membentuk tunas (Gambar 24). Jumlah rata-rata embrio yang terbentuk adalah 33.8 embrio per eksplan.
Gambar 24. Tahapan perkembangan embriogenesis somatik manggis klon Leuwiliang (A) kalus semi friable; (B) kalus menghijau; (C) globular; dan (D) kotiledon.
43
Gambar 25. Struktur embrio manggis pada tahap pendewasaan berdasarkan analisis histologi dengan pewarnaan safranin 1% dan fast green 1% (dengan perbesaran 40X).
Berdasarkan analisis histologi (Gambar 25), pada setiap tahap perkembangan kalus embriogenik, terjadi perubahan morfologi. Pada tahap awal, seluruh sel memiliki bentuk dan ukuran yang sama. Pada tahap globular dan pendewasaan embrio, jelas terlihat bahwa antar embrio saling berpisah, tidak lagi menyatu dengan jaringan induk. Haccius (1978) mendefinisikan bahwa embrio somatik merupakan individu yang mempunyai struktur bipolar dengan jaringan pembuluh yang tidak lagi terhubung dengan jaringan induk.
SIMPULAN
Kombinasi TDZ dan BA dapat menginduksi kalus embriogenik manggis. Media terbaik untuk induksi kalus embriogenik adalah TDZ 0.1 mg l-1. Kalus yang mempunyai struktur semi friable dengan warna putih berpotensi membentuk embrio somatik. Kasein hidrolisat dan ekstrak malt tidak dapat menginduksi pembentukan embrio somatik manggis. Penggunaan kombinasi TDZ 0.5 mg l-1 dan BA 0.7 mg l-1 dapat menginduksi pembentukan embrio somatik manggis setelah dua kali subkultur ke media yang sama.
44
6 PEMBAHASAN UMUM
Manggis merupakan tanaman asli Indonesia yang mempunyai potensi ekspor tinggi. Pada tahun 2012, nilai ekspor manggis menduduki peringkat kedua untuk komoditas buah-buahan. Sayangnya, potensi tersebut tidak diikuti oleh tingkat produksi dan luas panen. Produksi manggis masih fluktuatif dari tahun ke tahun, dengan tingkat pertumbuhan 1.74% (tahun 2011−2012). Luas panennya juga masih fluktuatif, sekitar 16 ha (Dirjen Hortikultura 2013).
Keragaman manggis di Indonesia cukup tinggi dan beberapa varietas unggul telah dilepas. Varietas manggis yang telah dilepas oleh Menteri Pertanian Republik Indonesia antara lain Wanayasa, Puspahiang, Ratu Tembilahan, Ratu Kamang, dan Raya (ppvt.setjen.deptan.go.id). Varietas unggul yang telah dilepas tersebut perlu dikembangkan supaya dapat memenuhi kebutuhan buah yang berkualitas dalam dan luar negeri.
Kebutuhan benih manggis dalam jumlah masal dapat terpenuhi melalui teknologi kultur in vitro. Selain itu, kultur in vitro dapat menunjang program pemuliaan tanaman manggis seperti rekayasa genetik dan variasi somaklonal. Metode regenerasi secara in vitro dapat dilakukan melalui organogenesis langsung,