Penentuan kadar air bertujuan mengetahui kandungan air pada sampel sebagai persen bahan keringnya, mengoreksi rendemen hasil ekstraksi, dan juga mengetahui masa simpan serbuk kering sampel. Suatu sampel dikatakan baik dan dapat disimpan dalam jangka waktu yang lama apabila memiliki kadar air <10% karena pada tingkat kadar air tersebut sampel relatif terhindar dari pencemaran yang disebabkan oleh mikrob penyebab kerusakan sampel (Winarno 1995). Pada penelitian ini, kadar air serbuk kering kulit batang berenuk diperoleh sebesar 11.87% (b/b) (Lampiran 2) Kadar air yang diperoleh bernilai >10%. Hal ini menunjukkan bahwa kandungan air pada serbuk kulit batang cukup tinggi sehingga sampel tidak baik disimpan dalam jangka waktu yang lama. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, simplisia serbuk kulit batang langsung diekstraksi dua hari setelah simplisia serbuk diperoleh.
Analisis Hasil Ekstraksi
Ekstraksi serbuk kulit batang dilakukan dengan metode maserasi. Maserasi merupakan metode ekstraksi dengan cara perendaman dalam jangka waktu tertentu dengan pelarut yang sesuai. Metode ini merupakan metode sederhana yang dapat digunakan untuk mengekstrak komponen bahan alam dalam sampel yang tidak tahan maupun tahan terhadap pemanasan sehingga dapat menghindari kerusakan komponen senyawa yang tidak tahan terhadap pemanasan (Meloan 1999).
Bobot serbuk kulit batang yang dimaserasi adalah sebanyak 150 g. Maserat dan residu dipisahkan dengan penyaringan kemudian maserat dipekatkan dengan penguap putar. Rendemen ekstrak kulit batang diperoleh sebesar 28.37% (b/b kering) (Lampiran 3).
Ekstrak metanol kulit batang kemudian dilarutkan dalam air dan diekstraksi cair-cair menggunakan n-heksana dan etil asetat. Prinsip dasar ekstraksi cair-cair yaitu proses kontak antara pelarut yang satu dan yang lainnya yang tidak saling bercampur dan memiliki densitas yang berbeda sehingga akan terbentuk dua fasa beberapa saat setelah penambahan dan pengocokan pelarut dalam corong pisah. Hal ini menyebabkan terjadinya perpindahan massa dari pelarut asal ke pelarut pengekstrak (Mirwan dan Ariono 2009). Komponen polar akan terdistribusi pada air, komponen semipolar akan terdistribusi pada etil asetat, dan komponen nonpolar akan terdistribusi pada n-heksana.
Bobot ekstrak metanol kulit batang yang digunakan untuk ekstraksi cair-cair adalah 5.02 g. Rendemen fraksi n-heksana, etil asetat, dan air yang diperoleh berturut-turut sebesar 2.57% (b/b), 4.33% (b/b), dan 92.71% (b/b) (Lampiran 4).
Aktivitas Antibakteri
Aktivitas antibakteri ekstrak metanol kasar kulit batang berenuk dan semua fraksi hasil partisi diuji dengan metode difusi cakram. Keempat ekstrak disiapkan dengan konsentrasi 20 mg/mL dalam DMSO. Kontrol positif yang digunakan adalah amoksisilin 1% (b/v) dalam DMSO.
Aktivitas antibakteri dari ekstrak ditunjukkan dengan dihasilkannya daerah hambat pada medium yang telah dikulturisasi. Semakin luas daerah hambat yang dihasilkan, kekuatan antibakteri tersebut semakin besar. Diameter daerah hambat diukur menggunakan jangka sorong. Data yang diperoleh disajikan berupa nilai rerata dan simpangan bakunya.
Berdasarkan metode yang dikembangkan oleh David Stout, pembagian aktivitas antibakteri dapat dilakukan berdasarkan ukuran diameter daerah hambat yang ter- bentuk. Berdasarkan metode tersebut, zat antibakteri yang menghasilkan daerah hambat sebesar <5 mm dikategorikan sebagai zat antibakteri berkekuatan lemah; 5-10 mm dikategorikan sebagai antibakteri berkekuatan sedang; 10-20 mm dikategorikan sebagai antibakteri kuat; dan >20 mm dikategorikan
sebagai antibakteri sangat kuat (Suryawiria 1978).
Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan terhadap dua jenis isolat bakteri, yaitu S. aureus (Gram positif) dan E. coli (Gram negatif). Kedua jenis bakteri tersebut dipilih karena merupakan bakteri yang paling umum dijumpai sebagai penyebab beberapa penyakit pada manusia dan hewan, juga penyebab kerusakan pada beberapa jenis bahan pangan.
Hasil pengujian aktivitas antibakteri disajikan dalam Tabel 1. Tabel tersebut menunjukkan diameter daerah hambat yang dihasilkan oleh setiap ekstrak. Berdasarkan tabel, terlihat bahwa ekstrak metanol memiliki aktivitas antibakteri yang lebih besar terhadap
E. coli dibandingkan terhadap S. aureus.Dari ketiga macam fraksi hasil partisi, fraksi n- heksana memiliki rerata aktivitas paling besar terhadap kedua bakteri. Kontrol positif amoksisilin 1% (b/v) memberikan aktivitas yang sangat besar terhadap bakteri S. aureus
dan E. coli, dengan diameter daerah hambat yang dihasilkan berturut-turut 42.367 mm dan 36.433 mm sehingga dikategorikan sebagai antibakteri dengan aktivitas yang sangat kuat.
Tabel 1 Aktivitas antibakteri ekstrak kulit batang berenuk Bahan uji Diameter daerah hambat (mm)* Aktivitas a b Metanol 2.687 ± 0.551 6.433 ± 0.862 lemah (a), sedang (b) n-heksana 6.067 ± 0.506 8.017 ± 0.605 sedang (a, b) Etil asetat 5.017 ± 0.465 3.633 ± 1.106 sedang (a),
lemah (b) Air 0.000 ± 0.000 0.000 ± 0.000 tidak aktif (a, b) Amoksisilin
1% b/v
42.367 ± 1.320
36.433
± 0.833 sangat kuat (a, b) DMSO 0.000 ± 0.000 0.000 ± 0.000 tidak aktif (a, b) Keterangan:
a: Staphylococcus aureus b: Escherichiacoli
*: nilai rerata 3 kali ulangan berikut simpangan bakunya Kontrol negatif DMSO dan ekstrak air tidak memberikan aktivitas pada kedua jenis bakteri uji. Berdasarkan Tabel 1 juga terlihat bahwa aktivitas antibakteri ekstrak masih kurang kuat dibandingkan kontrol positif, meskipun konsentrasi kontrol positif yang digunakan dalam pengujian hanya sebesar seperempat dari konsentrasi ekstrak yang diuji. Namun demikian, secara umum ekstrak tetap
dapat dikategorikan memiliki aktivitas antibakteri.
Struktur dinding sel S. aureus dan bakteri Gram positif lainnya hampir sama, yaitu memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal dan khas. Struktur dinding sel E. coli dan bakteri Gram negatif lainnya juga hampir sama, yaitu memiliki lapisan peptidoglikan yang lebih tipis dengan membran luar yang sedikit lebih tebal dibanding bakteri Gram positif. Oleh karena hasil pengujian menunjukkan bahwa ekstrak kulit batang berenuk memiliki aktivitas antibakteri baik terhadap S. aureus
maupun E. coli, maka dapat dikatakan ekstrak kulit batang berenuk juga dapat bekerja sebagai antibakteri terhadap jenis bakteri Gram positif dan negatif lainnya, mengingat adanya kemiripan struktur dinding sel antarsesama bakteri dalam satu golongan Gram. Dengan demikian, ekstrak kulit batang berenuk memiliki spektrum antibakteri yang luas.
Berdasarkan hasil pengujian tersebut, ekstrak n-heksana kulit batang kemudian dipilih sebagai ekstrak teraktif yang digunakan untuk analisis tahap selanjutnya, yaitu fraksinasi menggunakan kromatografi kolom.
Hasil Penentuan Eluen Terbaik dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Ekstrak n-heksana kulit batang berenuk dianalisis dengan KLT menggunakan fase diam silika G60 F254 dari Merck untuk menentukan komposisi eluen terbaik yang akan digunakan untuk fraksinasi meng- gunakan kromatografi kolom. Beberapa pelarut yang digunakan sebagai eluen adalah
n-heksana, diklorometana, kloroform, etil asetat, aseton, dan metanol. Profil kromatogram fraksi partisi n-heksana kulit batang berenuk setelah dielusi dengan berbagai eluen tunggal dan fase diam silika G60F254 di bawah lampu UV λ 254 nm disajikan pada Gambar 4.
10
Gambar 4 Profil kromatogram fraksi n-heksana kulit batang dengan berbagai eluen: nheksana (1), diklorometana (2), kloroform (3), etil asetat (4), aseton (5), metanol (6),dan eluen campuran etil asetat:diklorometana 7:3, 4:1, dan 9:1 (7, 8, dan 9).
Gambar 4 menunjukkan bahwa eluen tunggal diklorometana menghasilkan 5 noda namun belum terpisah dengan baik. Sementara itu, etil asetat menghasilkan 5 noda yang cukup terpisah namun noda yang dihasilkan masih ada yang terlalu dekat dengan garis depan eluen sehingga profil pemisahannya belum cukup baik. Dengan demikian, dicari komposisi eluen campuran antara diklorometana dan etil asetat dengan tujuan agar mampu memisahkan noda-noda dengan lebih baik. Berdasarkan hasil pencarian eluen campuran terbaik, diperoleh komposisi eluen etil asetat:diklorometana 9:1 sebagai eluen terbaik karena menurut Skoog
et al. (2004), eluen terbaik adalah eluen yang menghasilkan jumlah noda terbanyak dan terpisah. Data lengkap hasil analisis pemilihan eluen terbaik dengan KLT untuk ekstrak n- heksana kulit batang disajikan dalam Lampiran 5. Hasil analisis KLT kemudian dijadikan dasar penggunaan etil asetat dan diklorometana sebagai eluen pada proses fraksinasi dan pengelompokan fraksi hasil pemisahan ekstrak n-heksana kulit batang berenuk.
Fraksinasi dengan Kromatografi Kolom Pemisahan secara kromatografi kolom bertujuan mengetahui jumlah fraksi dari komponen-komponen kimia yang dapat terpisah untuk kemudian dinalisis kandungan senyawa aktifnya (Hayani 2007). Pemisahan ekstrak n-heksana kulit batang berenuk dilakukan dengan elusi gradien menggunakan komposisi eluen campuran etil asetat dan diklorometana sesuai peningkatan kepolaran. Elusi gradien ini diharapkan dapat
memisahkan komponen-komponen ekstrak dengan lebih baik.
Fraksi-fraksi yang terpisah dan keluar dari kolom ditampung setiap 5 mL pada tabung reaksi. Hasil fraksinasi ekstrak n-heksana kulit batang ditampung ke dalam 86 tabung reaksi yang berbeda kemudian dilakukan pengelompokan fraksi menggunakan KLT. Berdasarkan hasil pengelompokan fraksi diperoleh 10 fraksi. Masing-masing fraksi menunjukkan komponen yang berbeda yang ditunjukkan oleh pola Rf yang berbeda pula (Lampiran 6).
Fraksi Teraktif Antibakteri
Fraksi teraktif diketahui dengan cara menguji aktivitas antibakteri setiap fraksi hasil kromatografi kolom dengan konsentrasi masing-masing sebesar 1 mg/mL. Aktivitas antibakteri dilihat dari persentase inhibisi yang dihasilkan oleh masing-masing fraksi terhadap kedua jenis bakteri uji. Oleh karena semakin besar persentase inhibisi menunjukkan semakin besar pula aktivitas antibakteri, maka fraksi yang menunjukkan persentase inhibisi terbesar dipilih sebagai fraksi teraktif.
Hasil penentuan fraksi teraktif ditunjukkan pada Gambar 5. Berdasarkan gambar, terlihat bahwa fraksi teraktif hasil kromatografi kolom fraksi n-heksana kulit batang adalah fraksi II. Hal ini ditunjukkan dengan nilai persentase inhibisinya yang paling tinggi diantara fraksi- fraksi lainnya, yaitu sebesar 35.86% terhadap bakteri S. aureus dan 63.01% terhadap bakteri
E. coli. (Lampiran 7).
Gambar 5 Rerata persentase inhibisi hasil fraksinasi kromatografi kolom dengan elusi gradien terhadap bakteri S. aureus ( ) dan E. coli ( ). Kiri ke kanan: Fraksi I s.d. X dan kontrol positif amoksisilin 0.005%. Berdasarkan hasil tersebut, fraksi II diduga mengandung komponen yang paling aktif
0 10 20 30 40 50 60 70
I II III IV V VI VII VIII IX X Am
Re ra ta p erse n tas i in h ib isi (% ) Fraksi ke- 1 2 3 4 5 6 7 8 9
sebagai antibakteri. Oleh karena itu, fraksi II dipilih untuk analisis tahap selanjutnya, yaitu penentuan KHM dan KBM.
Konsentrasi Hambat Minimum dan Konsentrasi Bunuh Minimum Konsentrasi hambat minimum (KHM) merupakan konsentrasi terendah ekstrak yang tidak menunjukkan tanda pertumbuhan bakteri yang dapat teramati. Sementara itu, konsentrasi bunuh minimum (KBM) merupakan konsentrasi terendah ekstrak yang tidak menghasilkan tanda pertumbuhan bakteri setelah subkulturisasi kedua pada media steril yang baru (Batubara et al. 2009).
Hasil pengujian menunjukkan bahwa fraksi teraktif kulit batang berenuk memiliki nilai KHM terhadap bakteri S. aureus dan E. coli masing-masing sebesar 0.20 dan 0.10 mg/mL (Lampiran 8). Nilai KBM fraksi teraktif terhadap kedua bakteri tersebut masing-masing bernilai 10.00 dan 5.00 mg/mL (Lampiran 9). Dengan demikian, pada konsentrasi sebesar 0.20 dan 0.10 mg/mL, fraksi teraktif ekstrak n-heksana kulit batang berenuk telah mampu menghambat pertumbuhan bakteri S. aureus dan E. coli; dan pada konsentrasi 10.00 dan 5.00 mg/mL, fraksi teraktif telah mampu membunuh kedua jenis bakteri uji tersebut.
Hasil Uji Fitokimia
Uji fitokimia merupakan uji kualitatif yang digunakan untuk mengetahui kandungan senyawa metabolit sekunder yang terdapat dalam sampel. Dalam penelitian ini, uji fitokimia dilakukan terhadap ekstrak metanol kasar, ekstrak teraktif hasil partisi, dan fraksi teraktif hasil fraksinasi dengan kromatografi kolom.
Hasil uji fitokimia terhadap ekstrak metanol, ekstrak teraktif, dan fraksi teraktif kulit batang berenuk ditunjukkan pada tabel berikut.
Tabel 2 Hasil uji fitokimia
Komponen Ekstrak metanol Fraksi n-heksana Fraksi II Flavonoid + + - Saponin + - - Tanin + - - Alkaloid + + + Triterpenoid - - - Steroid + + + Keterangan: + : terdeteksi komponen - : tidak terdeteksi komponen
Berdasarkan uji fitokimia, diketahui bahwa fraksi teraktif ekstrak n-heksana kulit batang berenuk mengandung senyawa golongan alkaloid dan steroid. Golongan alkaloid dikenal karena toksisitasnya, namun tidak semua senyawa alkaloid bersifat toksik. Beberapa diantaranya telah digunakan sebagai obat analgesik, antiplasmodik, dan memiliki efek bakterisidal (Ogbuagu 2008). Steroid juga merupakan senyawa metabolit sekunder yang telah dikenal berfungsi sebagai penolak serangga dan serangan mikroba (Harborne 1987).
Mekanisme kerja alkaloid sebagai antibakteri diprediksi melalui penghambatan sintesis dinding sel yang akan menyebabkan lisis pada sel sehingga sel akan mati (Lamothe
et al. 2009). Variasi kerentanan organisme uji dapat diakibatkan oleh faktor intrinsik yang berkaitan dengan permeabilitas permukaan sel terhadap ekstrak (Suffredini et al. 2004). Steroid dapat berinteraksi dengan membran fosfolipid sel yang bersifat impermeabel terhadap senyawa-senyawa lipofilik sehingga menyebabkan integritas membran menurun, morfologi membran sel berubah, dan akhirnya dapat menyebabkan membran sel rapuh dan lisis (Bangham dan Horne 2006).
Adanya komponen asing dalam membran juga dapat menyebabkan pembentukan dinding sel akan terhalangi atau terbentuk dinding sel yang rapuh, yang selanjutnya akan menyebabkan lisis dan kematian sel (Morin dan Gorman 1995). Ketidakstabilan pada dinding sel dan membran sitoplasma bakteri menyebabkan fungsi permeabilitas selektif, fungsi pengangkutan aktif, dan pengendalian susunan protein dari sel bakteri menjadi terganggu. Gangguan integritas sitoplasma berakibat pada lolosnya makromolekul dan ion dari sel. Dengan demikian, sel bakteri menjadi kehilangan bentuk dan terjadilah lisis (Pelczar dan Chan 1986).