Percobaan IV. Optimasi Perakaran dan Aklimatisasi
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
Pola perkembangan diameter clump embrio somatik J. curcas yang ditanam pada media MS dengan penambahan 20, 30, 40 dan 50 g/l sukrosa yang dikombinasikan dengan 0.0, 0.5, 1.0, 1.5 dan 2.0 mg/l 2,4-D pada umur 1-8 minggu setelah kultur dapat dilihat pada Gambar 2. Pada perlakuan 20 g/l sukrosa pertumbuhan diameter kalus embrio somatik mulai terlihat pada umur 1 minggu. Diameter terus meningkat antara minggu ke 1-6 setelah kultur. Pada umur 6 minggu pertumbuhan diameter embrio dengan perlakuan 1.5 mg/l 2,4-D terhenti dan tidak menunjukkan adanya peningkatan hingga umur 8 minggu. Pada perlakuan tanpa penambahan 2,4-D pertumbuhan diameter embrio lambat, namun terdapat pertumbuhan hingga embrio berumur 8 minggu. Pada umur 6-8 minggu diameter embrio pada perlakuan 1 mg/l 2,4-D tidak berbeda dengan 0.5, 1.5 dan 2.0 mg/l 2,4-D (Gambar 2A).
Gambar 2. Pertumbuhan diameter clump embrio somatik J. curcas umur 0-8 minggu pada media MS dengan penambahan 2,4-D pada konsentrasi 0.0, 0.5, 1.0, 1.5 dan 2.0 mg/l yang dikombinasikan dengan sukrosa. A 20 g/l sukrosa, B 30 g/l sukrosa, C 40 g/l sukrosa dan D 50 g/l sukrosa.
B
C D
Pada perlakuan 30 g/l sukrosa pertumbuhan diameter kalus embrio somatik J. curcas meningkat mulai minggu ke 1 hingga minggu ke 6 setelah kultur. Pada perlakuan 0.5 mg/l 2,4-D pertumbuhan diameter embrio meningkat lebih tinggi pada umur 3-5 minggu tetapi pada umur 6-8 minggu diameter embrio tidak berbeda dengan perlakuan 1.0, 1.5 dan 2.0 mg/l 2,4-D. Diameter embrio pada umur 8 minggu hampir sama untuk seluruh perlakuan kecuali perlakuan tanpa 2,4-D yang lebih rendah (Gambar 2B).
Perlakuan 40 g/l sukrosa, dengan penambahan 0-2 mg/l 2,4-D pertumbuhan menghasilkan diameter embrio relatif sama pada umur 1-5 minggu. Pada umur 6-8 minggu pertumbuhan diameter embrio pada perlakuan 1 mg/l 2,4-D meningkat sehingga pada umur 8 minggu lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan lainnya (Gambar 2C).
Pada perlakuan 50 g/l sukrosa pertumbuhan diameter embrio untuk seluruh perlakuan 2,4-D menunjukkan peningkatan pada umur 1-8 minggu setelah kultur. Pada umur 1-2 minggu pertumbuhan diameter embrio lambat sedangkan pada umur 2-8 minggu pertumbuhan diameter embrio meningkat. Pada umur 8 minggu diameter embrio tertinggi terdapat pada perlakuan tanpa 2,4-D kemudian diikuti perlakuan 1.0, 1.5, 2.0 dan 0.5 mg/l 2,4-D (Gambar 2 D).
Pada beberapa tanaman auksin 2,4-D lebih efektif dibandingkan dengan IAA atau IBA untuk meningkatkan proliferasi kultur embriogenik. Pada konsentrasi rendah 2,4-D dapat memblok ekspresi gen-gen yang dibutuhkan untuk perubahan bentuk perkembangan tahap hati, kotiledon dan perkecambahan sehingga proses proliferasi dapat terus berlangsung (Sianipar et al., 2007). Hal ini serupa pada embrio J. curcas pada perlakuan 30 dan 40 g/l sukrosa dimana pada perlakuan 1 mg/l menghasilkan diameter embrio yang tinggi (Gambar 2B dan 2C).
Pada perlakuan 50 g/l sukrosa tanpa penambahan 2,4-D diperoleh diameter tertinggi pada embrio J. curcas umur 8 minggu (Gambar 2D). Hal ini dapat terjadi karena dalam proses pembelahan sel embrio somatik J. curcas sudah mendapatkan cukup stres dari tingginya konsentrasi sukrosa yang diberikan, sehingga pada konsentrasi 50 g/l sukrosa ini pemberian 2,4-D mengakibatkan pertumbuhan diameter kalus embrio somatik menurun. Selain berfungsi sebagai sumber karbon, sukrosa juga berguna untuk mempertahankan tekanan osmotik pada media (Purnamaningsih, 2002). Sukrosa memiliki pengaruh signifikan pada tahap perkembangan embrio somatik. Konsentrasi sukrosa yang optimal dapat meningkatkan formasi embrio somatik pada tanaman Carica papaya (Mora et al., 2012).
Perkembangan jumlah embrio somatik J. curcas yang ditanam pada media MS dengan 20, 30, 40 dan 50 g/l sukrosa yang dikombinasikan dengan 0.0, 0.5, 1.0, 1.5 dan 2.0 mg/l 2,4-D mulai umur 1-8 minggu setelah kultur dapat dilihat pada Gambar 3. Pada perlakuan 20 g/l sukrosa jumlah embrio somatik mulai mengalami peningkatan pada umur 2 minggu. Mulai umur 2 minggu jumlah embrio meningkat sampai minggu ke-6. Pada perlakuan 1.0, 1.5 dan 2.0 mg/l 2,4-D jumlah embrio meningkat pada umur 1-4 minggu dan lebih cepat dibandingkan dengan perlakuan 0 dan 0.5 mg/l 2,4-D. Pada umur 6-8 minggu jumlah embrio tidak bertambah. Pada umur 8 minggu jumlah embrio somatik terendah terdapat pada perlakuan tanpa penambahan 2,4-D (Gambar 3A).
C
Gambar 3. Jumlah embrio J. curcas pada media dengan penambahan 0.0, 0.5, 1.0, 1.5 dan 2.0 mg/l 2,4-D yang dikombinasikan dengan sukrosa umur 1-8 minggu. A 20 g/l sukrosa, B 30 g/l sukrosa, C 40 g/l sukrosa dan D 50 g/l sukrosa. Skor jumlah embrio 1: Sangat sedikit (jumlah embrio <20 ); 2: sedikit (jumlah embrio 21-40), 3: Sedang (jumlah embrio 41-60), 4: Banyak (jumlah embrio 61-80), 5: Sangat banyak (jumlah embrio >80)
Pada 30 g/l sukrosa yang dikombinasikan dengan 0.5, 1.0 dan 2.0 mg/l 2,4-D menyebabkan jumlah embrio meningkat pada umur 1 minggu. Jumlah embrio somatik terus mengalami pertambahan secara cepat pada umur 2-6 minggu setelah kultur. Pada umur 5-8 minggu perlakuan 0.5, 1.0, 1.5, dan 2.0 mg/l 2,4-D menghasilkan jumlah embrio yang relatif sama. Jumlah embrio somatik terendah terdapat pada perlakuan tanpa penambahan 2,4-D (Gambar 3B). Pada 40 g/l sukrosa, perlakuan 0.5, 1.5, dan 2.0 mg/l 2,4-D jumlah embrio meningkat pada umur 1 minggu. Jumlah embrio meningkat dengan pesat pada umur 2-5 minggu. Pada umur 6-8 minggu pertambahan jumlah embrio melambat pada perlakuan 0.5, 1.0, 1.5, dan 2.0 mg/l 2,4-D. Perlakuan tanpa 2,4-D pertambahan jumlah embrio lebih rendah dibandingkan dengan perlakuan lainnya pada umur 2-8 minggu (Gambar 3C). Pada 50 g/l sukrosa dikombinasikan dengan 0.5, 1.0, 1.5, dan 2.0 mg/l 2,4-D, jumlah embrio meningkat pada umur 1-3 minggu, lebih tinggi dibandingkan pada perlakuan tanpa 2,4-D. Akan tetapi pada umur 4-8 minggu pertambahan jumlah embrio pada perlakuan tanpa 2,4-D meningkat dengan pesat sehingga memiliki jumlah embrio lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan lainnya (Gambar 3D).
A B
Pada 50 g/l sukrosa tanpa penambahan 2,4-D memiliki jumlah embrio lebih tinggi karena dalam proses pembelahan sel embrio somatik J. curcas sudah mendapatkan cukup stres dari tingginya konsentrasi sukrosa yang diberikan. Hal ini mengakibatkan perkembangan embrio kearah pendewasaan terhambat sehingga proliferasi embrio dapat terus berlangsung. Pada konsentrasi sukrosa tinggi pemberian 2,4-D mengakibatkan jumlah embrio somatik J. curcas
menurun. Zat pengatur tumbuh 2,4-D tidak hanya berperan pada proses diferensiasi jaringan tanaman tetapi juga potensi embriogenik yang dimiliki oleh tanaman tersebut (Kim et al., 2000). Konsentrasi sukrosa yang diberikan berperan sangat penting pada tahap proliferasi embrio somatik. Sukrosa pada beberapa konsentrasi yang berbeda signifikan mempengaruhi perkembangan sel serta proliferasi embrio somatik. Pada tanaman Fragaria xananassa konsentrasi sukrosa yang berbeda berpengaruh terhadap proliferasi kalus embriogenik, perkembangan embrio serta regenerasi embrio somatik (Gerdakaneh et al., 2009).
Pengaruh perlakuan faktorial antara konsentrasi sukrosa dengan 2,4-D berpengaruh nyata terhadap diameter kalus dan jumlah embrio somatik J. curcas
pada umur 8 minggu. Pada diameter kalus pengaruh tunggal perlakuan sukrosa pada beberapa konsentrasi berbeda sangat nyata dan pengaruh konsentrasi 2,4-D berbeda nyata akan tetapi pengaruh interaksi dari kombinasi perlakuan tidak signifikan. Pada peubah jumlah embrio somatik selain pengaruh faktor tunggal sukrosa dan 2,4-D terdapat pula pengaruh interaksi antara konsentrasi sukrosa yang dikombinasikan dengan 2,4-D (Tabel 1; Lampiran 2.1).
Tabel 1. Anova pada perlakuan sukrosa yang dikombinasikan dengan 2,4-D untuk peubah diameter kalus dan jumlah embrio somatik umur 8 minggu
No Variabel Signifikansi
Sukrosa 2,4-D Sukrosa x 2,4-D
1 Diameter embrio ** * ts
2 Skor jumlah embrio somatik ** ** **
Keterangan : *: signifikan pada taraf <5%; **: sangat signifikan pada taraf <1%; ts: tidak signifikan
Diameter clump embrio dan skor jumlah embrio somatik pada umur 8 minggu dapat dilihat pada Tabel 2. Diameter clump embrio somatik J. curcas
umur 8 minggu yang tinggi terdapat pada perlakuan 30 g/l sukrosa yang dikombinasikan dengan 1 mg/l 2,4-D dan perlakuan 50 g/l sukrosa tanpa pemberian 2,4-D meskipun tidak berbeda nyata dengan beberapa perlakuan lainnya. Hal ini menunjukkan bahwa proliferasi dapat meningkat dengan adanya penambahan 1 mg/l 2,4-D pada 30 g/l sukrosa. Auksin 2,4-D lebih efektif dibandingkan dengan IAA dan IBA untuk meningkatkan perkembangan dan proliferasi kultur embriogenik. Penambahan 2,4-D pada konsentrasi rendah dapat memblok ekspresi gen-gen yang dibutuhkan untuk perkembangan tahap jantung, kotiledon dan perkecambahan. Akan tetapi pada sukrosa konsentrasi tinggi tidak diperlukan penambahan 2,4-D untuk memacu pembelahan sel sehingga proliferasi dapat berlangsung dengan cepat (Sianipar et al., 2007). Sukrosa pada media merupakan salah satu sumber karbon sebagai pengganti karbon yang secara alami didapat tanaman dari atmosfer dalam bentuk CO2 yaitu komponen utama
fotosintesis (Winata, 1988). Dengan sukrosa yang cukup, maka pembelahan, pembesaran dan diferensiasi sel dapat berlangsung dengan baik (Srilestari, 2005). Oleh karena itu pada konsentrasi sukrosa 50 g/l tanpa penambahan 2,4-D embrio tetap dapat berproliferasi lebih cepat dan jumlah embrio yang dihasilkan lebih banyak dibandingkan dengan 20 dan 40 g/l sukrosa tanpa 2,4-D (Tabel 2).
Tabel 2. Diameter clump embrio dan rerata skor jumlah embrio pada proliferasi embrio somatik J. curcas kultivar Dompu umur 8 minggu
Keterangan: Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan pada α = 5%. Skor jumlah embrio 1: Sangat sedikit (jumlah embrio <20 ); 2: sedikit (jumlah embrio 21-40), 3: Sedang (jumlah embrio 41-60), 4: Banyak (jumlah embrio 61-80), 5: Sangat banyak (jumlah embrio >80)
Jumlah embrio tidak berbeda nyata pada beberapa perlakuan, meskipun demikian pada perlakuan 30 g/l sukrosa yang dikombinasikan dengan 1 mg/l 2,4-D dan perlakuan 50 g/l sukrosa tanpa penambahan 2,4-2,4-D jumlah embrio yang terbentuk relatif tinggi begitu pula pada perlakuan 20 g/l sukrosa yang dikombinasikan dengan 1 dan 2 mg/l 2,4-D dan 30 g/l sukrosa yang dikombinasikan dengan 2 mg/l 2,4-D. Jumlah embrio pada perlakuan 20 g/l sukrosa tanpa penambahan 2,4-D rendah meskipun tidak berbeda nyata dengan beberapa perlakuan lainnya (Tabel 2). Pada perlakuan ini sebagian besar embrio berubah menjadi kalus remah dan sedikit sekali embrio baru yang terbentuk. Keberadaan auksin pada media proliferasi sama pentingnya dengan keberadaan auksin untuk induksi embrio somatik. Namun jika konsentrasi auksin terlalu tinggi dan frekuensi subkultur juga tinggi maka jumlah sel embriogenik akan
Perlakuan Diameter clump
Embrio (cm) Rerata Skor Jumlah Embrio Sukrosa (g/l) 2,4-D (mg/l) 20 0 0.82 ± 0.08 efg 2.8± 0.34d 0.5 0.96 ± 0.11 abcdef 3.3± 0.42abcd 1 1.03 ± 0.07 abcd 3.9± 0.12a 1.5 0.95 ± 0.12abcdefg 3.6± 0.23ab 2 1.06 ± 0.14 abc 3.8± 0.63a 30 0 1.00 ± 0.18 abcde 3.1± 0.20bcd 0.5 1.05 ± 0.15 abc 3.7± 0.53ab 1 1.08 ± 0.17a 3.8± 0.54a 1.5 1.05 ± 0.20 abc 3.6± 0.57ab 2 1.07 ±0.20 ab 3.9± 0.57a 40 0 0.87 ± 0.07cdefg 2.8 ± 0.37cd 0.5 0.75 ± 0.06g 3.1± 0.38bcd 1 0.94 ± 0.04abcdefg 3.4± 0.16abc 1.5 0.79 ± 0.02fg 3.3± 0.35abcd 2 0.83 ± 0.09efg 3.3± 0.12abcd 50 0 1.10 ± 0.07a 3.8± 0.16a 0.5 0.85 ± 0.08defg 2.9± 0.12cd 1 1.07 ± 0.05ab 3.4± 0.19abcd 1.5 0.96 ± 0.06abcdef 3.3± 0.20abcd 2 0.88 ± 0.07bcdefg 3.4± 0.28abc
menurun drastis diakibatkan oleh pembelahan dan diferensiasi sel terganggu sehingga potensi sel embriogenik akan hilang secara bertahap (Bhojwani dan Razdan, 1996).
Warna, ukuran serta morfologi embrio somatik J. curcas umur 8 minggu dapat dilihat pada Tabel 3. Warna dan ukuran embrio somatik J. curcas bervariasi sesuai dengan perlakuan baik pada 20, 30, 40 maupun 50 g/l sukrosa. Sebagian besar embrio didominasi warna kuning-putih dengan ukuran embrio kecil hingga sedang. Pada 20 g/l sukrosa yang dikombinasikan dengan 0.0, 0.5 dan 1.0 mg/l 2,4-D, embrio somatik yang terbentuk berwarna kuning-hijau, sedangkan pada perlakuan 1.5 dan 2.0 mg/l 2,4-D didominasi oleh warna kuning coklat dan putih dengan ukuran embrio somatik berkisar antara kecil-sedang. Pada perlakuan 30 g/l sukrosa tanpa 2,4-D warna embrio somatik cenderung hijau dan perlakuan dengan penambahan 0.5, 1.0, 1.5 dan 2.0 mg/l 2,4-D terlihat putih kekuningan dan kuning cerah dengan ukuran embrio berkisar kecil-sedang.
Pada 40 g/l sukrosa yang dikombinasikan dengan 2,4-D pada konsentrasi yang berbeda respon embrio lebih bervariasi. Pada perlakuan tanpa penambahan D warna embrio kuning-hijau sedangkan pada perlakuan 0.5 dan 1.0 mg/l 2,4-D embrio berwarna kuning-putih dan kuning-cerah, sementara pada perlakuan dengan 1.5 mg/l 2,4-D berwarna kuning-hijau dengan ukuran embrio somatik berkisar kecil hingga sedang, sementara pada perlakuan 2.0 mg/l 2,4-D embrio berwarna putih hijau dengan ukuran besar. Hal serupa juga terlihat pada perlakuan 50 g/l sukrosa bahwa pemberian 2,4-D pada berbagai konsentrasi menghasilkan variasi warna dan ukuran embrio somatik (Tabel 3).
Pada media dengan 20 dan 30 g/l sukrosa tanpa 2,4-D proliferasi embrio somatik minim terjadi bahkan mengarah pada maturasi dan perkecambahan (Tabel 3). Pada 40 dan 50 g/l sukrosa tanpa 2,4-D tidak membuat proliferasi terhenti atau mengarah ke maturasi akan tetapi proliferasi tetap berlangsung. Hal ini ditunjukkan dari nilai diameter embrio yang tinggi serta masih banyak terdapat embrio dalam fase globular (Tabel 3). Saat kultur embriogenik ditanam pada media tanpa auksin maka proses yang menghambat diferensiasi sel terhenti kemudian embrio pada tahap globular mengalami perkembangan ke tahap selanjutnya. Proses diferensiasi terjadi dengan terbentuknya formasi protoderm di sekitar embrio globular. Tahap globular kemudian berkembang ke tahap pendewasaan (Bhojwani dan Razdan, 1996).
Kombinasi 20 g/l sukrosa dengan 0.5, 1.0 dan 2.0 mg/l 2,4-D menyebabkan sebagian besar embrio somatik berubah menjadi kalus remah kembali dan kehilangan embryonic potential meskipun beberapa embrio dalam fase globular masih terlihat pada clump dengan jumlah sangat sedikit. Pada perlakuan 20, 30 serta 40 g/l sukrosa tanpa penambahan 2,4-D sebagian besar embrio tidak mengalami proliferasi atau proliferasi sangat minim, sebagian besar embrio somatik mengalami pendewasaan kemudian berkecambah. Hal ini ditunjukkan dari banyaknya embrio fase kotiledon (Gambar 4).
Tabel 3. Warna, ukuran embrio serta morfologi embrio somatik J. curcas kultivar Dompu umur 8 minggu
Perlakuan Warna Diameter Embrio Morfologi Embrio Sukrosa (g/l) 2,4-D (mg/l)
20 0 hijau kecil-sedang Sebagian besar embrio telah membentuk kotiledon dan berkecambah
0.5 kuning, kehijauan
kecil-sedang Globular, bulat, kotiledon yg terbentuk mengarah ke pembentukan kalus kembali, terbentuk kalus remah
1 hijau sedang-besar Seluruh embrio somatik berubah menjadi kalus remah baru
1.5 kuning kecoklatan
kecil-sedang Globular, bulat, sebagian embrio berubah menjadi kalus remah
2 putih kekuningan
kecil-sedang Globular, bulat, sebagian terbentuk kotiledon, terbentuk kalus remah 30 0 hijau kecil-sedang Sebagian besar embrio telah membentuk
kotiledon dan berkecambah 0.5 putih
kekuningan
kecil-sedang Globular, bulat, sebagian membentuk kotiledon, terbentuk kalus remah baru 1 putih
kekuningan
kecil-sedang Sebagian kecil embrio masih berbentuk Globular, sebagian embrio membesar dan membentuk kalus remah, kotiledon yg terbentuk mengarah ke pembentukan kalus remah kembali.
1.5 kuning cerah kecil-sedang Globular, bulat, sebagian membentuk kotiledon, sebagian terbentuk kalus remah 2 Putih
kekuningan
kecil- sedang Globular, bulat, sebagian membentuk kotiledon, terbentuk embrio baru berukuran kecil
40 0 kuning kehijauan
kecil-sedang Globular, bulat, sebagian membentuk kotiledon dan berkecambah
0.5 kuning cerah kecil-sedang Globular, sebagian terbentuk kotiledon, terbentuk kalus remah baru
1 kuning putih kecil-sedang Globular bulat, sebagian sampai tahap kotiledon, terbentuk embrio baru berukuran kecil, tidak ada kalus remah 1.5 kuning hijau kecil-sedang Embrio sampai tahap torpedo, kotiledon,
terbentuk embrio baru berukuran kecil, tidak terbentuk kalus remah
2 putih hijau besar Ukuran embrio membesar membentuk kalus remah baru
50 0 kuning cerah kecil Globular, bulat, terbentuk embrio baru berukuran kecil, tidak terbentuk kalus remah 0.5 kuning hijau kecil-sedang Globular, bulat, sebagian sampai tahap
kotiledon, terbentuk kalus remah 1 putih hijau sedang-besar Ukuran embrio membesar dan terbentuk
kalus remah, kotiledon berubah menjadi kalus remah kembali
1.5 kuning putih kecil-sedang Globular bulat, terbentuk kalus remah, kotiledon mengarah ke pembentukan kalus remah kembali
2 putih hijau sedang-besar Sebagian embrio masih tahap globular, sebagian embrio membesar membentuk kalus remah, kotiledon mengarah ke pembentukan kalus remah
Berbeda dengan perlakuan sukrosa dengan konsentrasi lebih rendah, pada 50 g/l sukrosa tanpa pemberian 2,4-D proses proliferasi sangat dominan terjadi dan sebagian besar embrio berada pada fase globular (Gambar 4). Selain adanya pengaruh stres osmotik yang mempengaruhi peningkatan proliferasi pada perlakuan 50 g/l sukrosa, hal ini terjadi karena akumulasi auksin endogen dari embrio somatik yang dalam konsentrasi rendah dapat memacu laju proliferasi. Setelah embrio somatik terbentuk maka embrio tersebut mampu mensintesa auksin endogen dalam selnya sendiri melalui alternative pathway sehingga auksin yang sebelumnya berperan dalam menginduksi embrio berubah menjadi senyawa penghambat pendewasaan embrio sehingga proliferasi dapat terus berlangsung (Zimmerman, 1993).
Gambar 4. Proliferasi embrio somatik J. curcas pada media MS yang mengandung 20, 30, 40 dan 50 g/l sukrosa dikombinasikan dengan 0.0, 0.5, 1.5, dan 2.0 mg/l 2,4-D umur 8 minggu (Perbesaran 12,5 kali)
2,4-D (mg/l) Sukrosa (g/l) 20 30 40 50 0 0.5 1 1.5 2
Kombinasi 30 g/l sukrosa dengan 1.0 mg/l 2,4-D menghasilkan diameter
clump untuk fase globular yang tinggi, akan tetapi fase embrio yang terbentuk sangat beragam mulai dari fase globular, jantung, torpedo dan kotiledon. Sebagian besar didominasi oleh embrio dengan fase globular (Gambar 4). Pada media dengan 10-30 g/l sukrosa tanpa penambahan zat pengatur tumbuh, kultur embrio somatik J. curcas mengarah pada tahap pendewasaan dan perkecambahan tanpa melalui proses proliferasi kalus embriogenik. Sementara itu, embrio yang dikulturkan pada media dengan penambahan 2,4-D konsentrasi tinggi, tahap proliferasi tidak berlangsung dengan optimal dan bahkan kehilangan potensi embriogeniknya. Pada perlakuan ini terbentuk kalus remah asimetris. Pemberian 2,4-D pada konsentrasi optimal secara signifikan mampu menghambat proses pendewasaan dan perkecambahan embrio somatik sehingga proses proliferasi serta terbentuknya embrio sekunder dapat terus berlangsung (Lin-Cai et al., 2011).
Percobaan II. Perkecambahan Embrio Somatik J. curcas
Sukrosa yang dikombinasikan dengan PEG dapat menstimulasi pendewasaan dan perkecambahan embrio somatik J. curcas. Jumlah embrio berkecambah/ clump umur 0-8 minggu dapat dilihat pada Gambar 5. Pada 20 g/l sukrosa embrio mulai berkecambah pada umur 1 minggu pada perlakuan 0.0, 2.5, dan 5.0% PEG. Jumlah embrio berkecambah pada perlakuan 2.5 dan 5.0% PEG meningkat pada umur 2-5 minggu, kemudian terhenti pada umur 6-7 minggu dan meningkat lagi pada umur 8 minggu. Pada perlakuan tanpa PEG pertumbuhan jumlah embrio mengalami peningkatan pada umur 3-8 minggu. Pada perlakuan 10.0 dan 15.0% PEG pertumbuhan jumlah embrio berkecambah lambat. Pada umur 8 minggu jumlah embrio berkecambah paling sedikit terdapat pada perlakuan 15.0% PEG (Gambar 5A).
Pada 30 g/l sukrosa tanpa PEG dan dengan 2.5% PEG embrio mulai berkecambah pada umur 1 minggu dan terus mengalami peningkatan hingga umur 6 minggu setelah kultur kemudian menurun setelah umur 6 minggu. Pada perlakuan 5.0% PEG embrio mulai berkecambah pada umur 3 minggu. Jumlah embrio berkecambah meningkat dengan pesat pada umur 4-8 minggu setelah kultur. Pada perlakuan 10.0 dan 15.0% PEG embrio mulai berkecambah pada umur 5 minggu. Pertambahan jumlah embrio berkecambah terjadi pada umur 6-8 minggu pada perlakuan 10.0% PEG, sementara pada perlakuan 15.0% PEG jumlah embrio berkecambah tidak mengalami peningkatan pada umur 6-8 minggu. Pada umur 8 minggu jumlah embrio tertinggi terdapat pada perlakuan 5.0% PEG. Perlakuan 2.5, 10.0, dan 15.0% PEG lebih rendah dibandingkan perlakuan tanpa PEG (Gambar 5B).
Pada media dengan perlakuan 40 g/l sukrosa yang dikombinasikan dengan 0.0 dan 2.5% PEG embrio mulai berkecambah pada umur 2 minggu. Pada perlakuan 2.5% PEG jumlah embrio berkecambah terus mengalami peningkatan hingga umur 6 minggu dan pada perlakuan tanpa PEG pertambahan jumlah embrio terjadi pada umur 2-8 minggu. Pada perlakuan 5.0 dan 10.0% PEG embrio mulai berkecambah pada umur 4 minggu. Pada perlakuan 5.0% PEG jumlah embrio terus meningkat hingga umur 8 minggu setelah kultur. Pada perlakuan 10.0% PEG jumlah embrio berkecambah tidak menunjukkan peningkatan yang berarti. Pada perlakuan 15.0% PEG tidak terdapat embrio yang berkecambah.
Pada umur 8 minggu jumlah embrio berkecambah tertinggi terdapat pada perlakuan 5.0% PEG diikuti perlakuan 0.0, 2.5, 10.0 dan 15.0% PEG (Gambar 5C).
Pada 50 g/l sukrosa yang dikombinasikan dengan 0.0 dan 2.5% PEG embrio mulai berkecambah pada umur 1 minggu setelah kultur. Pada perlakuan tanpa PEG jumlah embrio terus meningkat hingga umur 5 minggu sementara pada perlakuan 2.5% PEG jumlah embrio berkecambah terus meningkat hingga umur 6 minggu. Pada perlakuan 5.0% PEG embrio mulai berkecambah pada umur 2 minggu setelah kultur dan terus meningkat hingga umur 8 minggu setelah kultur. Pada perlakuan 10.0% PEG embrio mulai berkecambah pada umur 6 minggu dan terus meningkat hingga umur 8 minggu akan tetapi pertumbuhannya lebih lambat dibandingkan dengan perlakuan 0.0, 2.5 dan 5.0% PEG. Pada perlakuan 15.0% PEG tidak terdapat embrio somatik yang berkecambah. Pada umur 8 minggu jumlah embrio berkecambah tertinggi terdapat pada perlakuan 5.0% PEG diikuti perlakuan 2.5, 0.0, 10.0 dan 15.0% PEG (Gambar 5D).
Gambar 5. Jumlah embrio berkecambah per clump embrio somatik J. curcas umur 0-8 minggu pada media MS dengan perlakuan PEG dengan konsentrasi 0.0, 2.5, 5.0, 10.0 dan 15.0 % yang dikombinasikan dengan sukrosa. A. 20 g/l sukrosa, B. 30 g/l Sukrosa, C. 40 g/l Sukrosa dan D. 50 g/l sukrosa.
Sukrosa dan PEG pada berbagai konsentrasi berpengaruh nyata terhadap diameter clump embrio, jumlah kecambah/clump serta persentase kecambah normal embrio somatik J. curcas pada umur 8 minggu. Dari ketiga peubah tersebut, selain mempunyai pengaruh tunggal dari perlakuan sukrosa dan PEG pada konsentrasi yang berbeda terdapat pula pengaruh interaksi dengan tingkat
A B
signifikansi sangat nyata. Pada peubah diameter clump embrio dan jumlah kecambah/ clump pengaruh tunggal sukrosa dan PEG sangat nyata sedangkan pada peubah persentase kecambah normal pengaruh tunggal dari konsentrasi sukrosa berbeda nyata dan pengaruh konsentrasi PEG berbeda sangat nyata (Tabel 4; Lampiran 2.2).
Tabel 4. Anova pada perlakuan sukrosa yang dikombinasikan dengan PEG untuk peubah diameter kalus, jumlah kecambah/clump serta persentase kecambah normal pada umur 8 minggu setelah kultur.
No Variabel Signifikansi
Sukrosa PEG Sukrosa x PEG
1 Diameter clump embrio ** ** **
2 Jumlah kecambah/ clump ** ** **
3 Persentase kecambah normal * ** **
Keterangan: * : signifikan pada taraf <5%; **: sangat signifikan pada taraf <1%
Diameter clump embrio, jumlah embrio berkecambah, persentase kecambah normal serta persentase clump berkecambah pada umur 8 minggu dapat dilihat pada Tabel 5. Pemberian PEG memperlambat pertumbuhan diameter
clump embrio J. curcas pada minggu ke-8 setelah kultur, dengan semakin tingginya konsentrasi PEG yang diberikan maka diameter embrio semakin lambat pertumbuhannya (Tabel 5). Hal ini mengindikasikan bahwa pemberian PEG dapat memberikan stres kekeringan yang mengakibatkan pembentukan embrio somatik baru terhambat dan mengarahkan pertumbuhan embrio ke arah maturasi dan perkecambahan. Polyethylene-glycol (PEG) merupakan polimer dengan berat molekul tinggi yang mampu memberikan stimulasi efek stres kekeringan untuk meningkatkan perkecambahan serta proses konversi embrio somatik menjadi planlet, sebagaimana proses yang terjadi pada perkecambahan embrio zigotik (biji). Hal ini telah dibuktikan pada penelitian embrio somatik pada tanaman
Pinus sylvestris, Abies numidica, Panax ginseng, Cryptomeria japonica, Abies cephalonica, Aesculus hippocastanum dan C. papaya (Koehler et al., 2013).
Jumlah embrio berkecambah/clump terbanyak terdapat pada perlakuan 20 g/l sukrosa yang dikombinasikan dengan 2.5 dan 5.0% PEG, 30 g/l sukrosa yang dikombinasikan dengan 5.0% PEG, 40 g/l sukrosa tanpa PEG dan kombinasi dengan 5.0% PEG serta 50 g/l sukrosa yang dikombinasikan dengan 5.0% PEG berbeda nyata dengan perlakuan lainnya. Pada perlakuan tanpa pemberian PEG pada 20, 30, dan 50 g/l sukrosa jumlah embrio berkecambah/clump yang terbentuk lebih sedikit dibandingkan dengan perlakuan dengan 2.5 dan 5.0% PEG. Pada 20, 30, 40 dan 50 g/l sukrosa yang dikombinasikan dengan 10.0% PEG serta 20 dan 30 g/l sukrosa yang dikombinasikan dengan 15.0% PEG jumlah embrio berkecambah/clump semakin menurun. Pada 40 dan 50 g/l sukrosa yang dikombinasikan dengan 15% PEG bersifat lethal bagi embrio somatik J. curcas
sehingga tidak ada embrio yang mampu berkecambah (Tabel 5).
Kecambah normal memiliki bentuk bipolar dengan hipokotil dan epikotil yang tumbuh dengan baik. Bentuk abnormalitas yang terjadi pada kecambah antara lain kecambah kembali ke bentuk kalus, hipokotil tidak dapat tumbuh dengan baik dan terjadinya fusi di antara 2 embrio. Perlakuan Pada media dengan
20 g/l sukrosa yang dikombinasikan dengan 5.0% PEG, 30 g/l sukrosa tanpa PEG