p35S-2AShemADigesti dengan
HASIL DAN PEMBAHASAN
Konstruksi vektor ekspresi ALAS
Pada penelitian ini telah dilakukan konstruksi rekombinan binary vector yang membawa gen hemA dibawah promoter 35S baik dengan orientasi sense maupun antisense. Seri plasmid pGreen (Hellens et al. 2000) dipakai dalam penelitian ini karena ukurannya yang kecil sehingga memudahkan dalam proses kloning, fleksibilitas dalam pemilihan penanda seleksi dan banyaknya situs restriksi untuk kloning (MCS) serta jumlah kopi yang banyak. Plasmid binary vektor yang berukuran kecil sangat berguna jika DNA yang ingin kita masukkan ke dalam sel tanaman berukuran besar. Selama ini binary vector yang ada berukuran lebih dari 10 kb. Seri plasmid pGreen hanya bisa bereplikasi di dalam sel Agrobacterium jika berada bersama plasmid pSOUP yang membawa gen pSa replicase yang berkerja in trans terhadap pSa ori yang terdapat pada pGreen. Analisis restriksi atas plasmid rekombinan yang dihasilkan dalam proses konstruksi vektor ekspresi asam δ-aminolevulinat sintase (ALAS) dapat dilihat pada Gambar 20 dan 21. Peta plasmid baik yang membawa gen hemA dengan orientasi sense maupun antisense terhadap promoter 35S dapat dilihat pada Gambar 22. Karena plasmid pGreen tidak dapat dimobilisasi dengan cara konjugasi, introduksinya ke dalam Agrobacterium dilakukan dengan metode
freeze-thaw (An et al. 1988) bersama-sama dengan plasmid pSOUP. Bila
diinginkan untuk membuat tanaman transgenik yang marker-free, kedua plasmid ini bisa dipakai untuk membawa T-DNA yang terpisah antara gen yang diinginkan dengan marker antibiotik untuk seleksi transforman.
Gambar 20. Hasil analisis restriksi plasmid rekombinan pOK12-hemA, p35S- 2hemA dan pGII0029-hemA. M: molekular marker, 1: fragmen hemA berukuran ± 1.2 kb, 2: pOK12, 3: pOK12-hemA didigesti dengan HindIII + EcoRI, 4: pOK12-hemA didigesti dengan HindIII + EcoRI+BamHI, 5:p35S-2, 6: p35S- hemA yang didigesti dengan HindIII+EcoRI, 7: p35S-hemA yang didigesti dengan HindIII+EcoRI+BamHI, 8:p35S-hemA yang didigesti dengan EcoRV, 9:pGII0029, 10:pGII0029-hemA yang didigesti dengan EcoRV
Gambar 21. Hasil analisis restriksi plasmid rekombinan pGII0029-hemA (A) dan pGII0029-AShemA (B) yang didigesti dengan BamHI (3 & 5), EcoRI (1 & 6) dan HindIII (2 & 7)
1.0 kb 1.5 kb 3.0 kb M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 1 2 3 M 5 6 A B 1.0 0.5 1.5 2.0 3.0 6.0
Gambar22. Peta plasmid rekombinan pGII0029-hemA dan pGII0029-AShemA
Transformasi rekombinan binary plasmid ke Arabidopsis thaliana
Introduksi gen penyandi ALAS dilakukan pada tanaman Arabidopsis thaliana karena tanaman ini relatif cepat pertumbuhan dan siklus hidupnya pendek serta cara transformasi melalui infeksi Agrobacterium pada bagian bunga (Floral dip transformation) yang langsung dapat menghasilkan biji transgenik (Clough and Bent 1998). Dengan cara ini tidak diperlukan proses kultur jaringan karena benih yang dihasilkan dapat langsung diseleksi pada saat ditumbuhkan di tanah dan disemprot dengan antibiotik kanamisin (in solium selection) (Gambar 23). Dengan tersedianya cara transformasi yang sederhana dan cepat ditambah dengan selesainya sekuen total genom Arabidopsis thaliana pada tahun 2000, membuat studi tentang ekspresi suatu gen di Arabidopsis thaliana menjadi sangat mengguntungkan. Berkembangnya teknologi microarray memungkinkan untuk mempelajari ekspresi suatu gen dan pengaruhnya terhadap gen-gen lain secara mendalam.
Pada penelitian ini, binary vector yang membawa antisense hemA tidak jadi digunakan sebagai kontrol insersi karena faktor insersi T-DNA yang acak tidak mungkin mendapatkan insersi pada tempat yang sama antara konstruk sense dan antisense.
Gambar 23. Kecambah Arabidopsis yang akan (A) dan setelah (B, C dan D) diseleksi dengan penyemprotan antibiotik kanamisin (in solium selection)
Analisis tanaman Arabidopsisthaliana transgenik
Dalam penelitian ini, berhasil didapatkan beberapa kandidat tanaman transgenik hasil seleksi secara in solium (Gambar 23D) dan berdasarkan analisis dengan PCR, dari lima tanaman, empat diantaranya positif membawa gen hemA dan kanamisin (Gambar 24). Satu tanaman tidak membawa kedua gen tersebut yang diduga non-transforman yang lolos dari seleksi (escape). Seleksi
A
B
transforman secara in solium ini, menghendaki adanya keseragaman perkecambahan sehingga semua tanaman mengalami seleksi pada waktu yang sama. Penyemprotan kanamisin pada kecambah Arabidopsis thaliana yang memiliki satu pasang daun sangat efektif untuk menyeleksi tanaman yang non- transforman. Bila ada kecambah Arabidopsis thaliana yang baru muncul kemudian (terlihat dari jumlah daunnya yang lebih sedikit dari yang lain) biasanya 7-10 hari setelah penyemprotan kanamisin terakhir, kemungkinan bukan transforman (escape).
Gambar 24. Analisis kandidat tanaman transgenik menggunakan PCR dengan primer spesifik gen hemA dan kanamisin resisten. M: marker; 1-5: kandidat tanaman transgenik; 6: non-transforman; 7: kontrol
Bukti bahwa gen yang diintroduksikan dapat terekspresi dengan baik pada tanaman Arabidopsis thaliana transgenik adalah dari hasil analisis transkrip menggunakan Reverse Transcriptase (RT)-PCR (Gambar 25). Pada analisis transkrip, tanaman Arabidopsis thaliana non-transforman tidak dijumpai adanya produk amplifikasi yang berarti secara alami Arabidopsis thaliana tidak mempunyai gen ini. Tanaman menggunakan jalur biosintesis C-5 (dari glutamat)
hemA Kanr
(Beale et al. 1975) untuk menghasilkan prekursor senyawa tetrapirol sedangkan gen hemA dari Rhodobacter sphaeroides merupakan enzim biosintesis asam δ- aminolevulinat (ALA) jalur C-4 (kondensasi suksinil-CoA dan glisin) (Gibson et al. 1958). Amplifikasi gen hemA pada preparasi total RNA juga tidak didapati adanya produk amplifikasi, sehingga memastikan bahwa amplifikasi produk dengan primer spesifik hemA pada preparasi cDNA tanaman Arabidopsis thaliana transgenik merupakan hasil dari ekspresi gen hemA yang diintroduksikan. Hasil analisis transkrip ini diketahui bahwa keempat tanaman Arabidopsis thaliana transgenik dapat mengekspresikan gen hemA yang diintroduksikan. Untuk membuktikan bahwa ekspresi gen juga terjadi pada taraf translasi, dilakukan analisis aktivitas enzim ALA sintase. Pengujian aktivitas enzim merupakan cara langsung untuk mengetahui suatu gen terekspresi atau tidak. Karena analisis western blotting untuk mengetahui ada tidaknya ekspresi gen pada taraf protein tidak menjamin bahwa enzim itu aktif karena bisa saja protein enzim ada tapi tidak aktif karena ada masalah pelipatan protein. Tanaman Arabidopsis thaliana transgenik no 4 yang diesei aktivitas enzimnya mempunyai aktivitas ALAS sebesar 40.5 nmol.mg-1.h-1 (tabel 2).
Dari keempat tanaman yang positif membawa gen hemA, hanya tanaman No. 4 yang sangat berbeda dari segi morfologinya yaitu tanaman tumbuh lebih besar (Gambar 26) akan tetapi mengalami keterlambatan dalam pembungaan (sekitar satu minggu) dan penurunan jumlah biji yang dihasilkan (± 25% dari tipe liar). Terjadinya perubahan morfologi tanaman menjadi lebih besar dan keterlambatan pembungaan, mungkin disebabkan oleh meningkatnya efisiensi pemanfaatan nitrogen oleh tanaman. Karena tanaman yang diberi pemupukan
nitrogen yang berlebihan juga memperlihatkan hal yang sama yaitu tanaman menjadi tumbuh subur (lebih banyak daun) tetapi pembungaan menjadi terlambat. Hotta et al. (1997a) melaporkan bahwa tanaman yang disemprot dengan larutan ALA mengalami peningkatan laju fotosintesis, peningkatan fiksasi CO2 dan
penurunan respirasi serta meningkatnya penyerapan hara khususnya N akibat peningkatan aktivitas nitrat reduktase. Yoshida et al. (2004) juga melaporkan adanya peningkatan pengambilan nitrogen dan rasio antara nitrogen dalam bentuk nitrat per total nitrogen pada daun dan petiol pada tanaman Komatsuna. Walaupun penelitian di atas berasal dari aplikasi ALA secara eksogenous, namun kemungkinan hal yang sama terjadi pada tanaman Arabidopsis thaliana transgenik yang membawa gen hemA. Karena gen hemA merupakan penyandi enzim ALAS, ekspresi gen ini menyebabkan terjadinya peningkatan produksi ALA didalam sel (tabel 2).
Gambar 25. Hasil analisis RT-PCR pada tanaman transgenik T1. M: molekular marker, 1-4: Tanaman transgenik, 5: Tanaman kontrol, 6: hemA, 7: Kontrol negatif PCR, 8: Internal kontrol 18SRNA, 9-11: kontrol cDNA hemA 1.0 kb 18SR 0.5 kb M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Gambar 26. Profil tanaman transgenik no 4 (tanda panah).
Tanaman mendapatkan nitrogen dari tanah biasanya dalam bentuk nitrat Enzim yang terlibat dalam pemanfaatan nitrat adalah nitrat reduktase dan nitrit reduktase. Nitrat reduktase akan mereduksi nitrat menjadi nitrit dan oleh enzim nitrit reduktase akan direduksi menjadi ammonium. Nitrat dan nitrit reduktase merupakan enzim yang mengandung heme (Vance 1990). Oleh karena heme
seperti juga klorofil dibentuk dari ALA, maka dapat dimengerti mengapa peningkatan sintesis ALA dapat meningkatkan aktivitas kedua enzim diatas.
Terjadinya penurunan jumlah biji yang dihasilkan kemungkinan efek dari ekspresi ALAS di bawah promoter kuat secara konstitutif. Pada saat pembentukan biji biasanya akan terjadi peningkatan sintesis DNA dan protein yang terlibat dalam pembentukan biji. Pada saat ini aktivitas di organ vegetatif menjadi rendah bahkan sebagian besar N yang ada di biji berasal dari re-alokasi N yang terdapat pada organ vegetatif. Sedangkan 75% C yang ada di biji berasal dari fotosintat. (Peoples and Gifford 1990). Bila aktivitas sel di organ vegetatif masih tetap tinggi seperti dalam hal ini ekspresi ALAS secara berlebihan akan terjadi persaingan pemakaian sumber daya di tanaman yang berakibat biji kekurangan bahan baku yang diperlukan untuk perkembangannya. Selain itu mungkin ALA bersifat organ spesifik di mana pada organ generatif dapat menyebabkan proses fertilisasi menjadi terganggu sehingga berakibat menurunnya jumlah biji yang dihasilkan. Yoshida et al. (2004) melaporkan adanya hubungan erat fungsi fisiologis ALA dengan biosintesis H2O2. Aplikasi
ALA tidak hanya menaikkan berat basah dan berat kering tanaman tetapi juga jumlah H2O2 yang ada dijaringan tanaman. H2O2 merupakan senyawa yang
berperanan dalam proses programmed cell death (PCD). Hotta et al (1997b) melaporkan bahwa tanaman kacang merah yang diberi perlakuan ALA pada fase awal seperti fase daun primer atau daun pertama, meningkat hasilnya sampai 20- 30%, sedangkan jika perlakuan diberikan pada fase pembungaan malah menurunkan hasil sekitar 10%.
Tabel 2. Hasil analisis berat basah dan berat kering Arabidopsis thaliana transgenik dan non transgenik
Berat Basah (gr) Berat Kering (gr)
Kontrol 0.95 (100%) 0.18 (100%)
Transgenik 1 0.92 (96.8%) 0.21 (116.6%)
Transgenik 2 1.05 (110%) 0.18 (100%)
Transgenik 3 0.57 (60%) 0.10 (55.5%)
Transgenik 4 1.11 (116.8%) 0.19 (105.5%)
Hasil analisis berat kering dan berat basah memperlihatkan sejumlah data yang menarik (Table 2). Tanaman transgenik no 4 mempunyai berat basah tertinggi dan mengalami kenaikan 16.8% dibandingkan kontrol tetapi berat keringnya hanya naik 5.5%. Hal serupa terjadi pada tanaman transgenik no 2. Sedangkan tanaman transgenik no 1 yang berat basahnya turun 3.2% dibandingkan kontrol justru mengalami kenaikan berat kering tertinggi 16.6%. Kalau hal ini dihubungkan dengan analisis yang telah diuraikan sebelumnya, yaitu meningkatkanya aktivitas enzim nitrat reduktase, meningkatnya berat basah mungkin akibat meningkatnya efisiensi pemakaian nitrogen oleh tanaman. Proses asimilasi N anorganik dapat dianggap sebagai bagian dari proses fotosintesis. Asimilasi nitrat (NO3-) atau NH4+ membutuhkan tenaga pereduksi
dan ATP yang mana keduanya disediakan oleh reaksi terang dari fotosintesis. Kerangka karbon yang dibutuhkan untuk asimilasi N anorganik didapat dari oksidasi senyawa karbon tereduksi yang juga dihasilkan dari proses fotosintesis. Oleh karena itu, meningkatnya asimilasi N akan menguras hasil fiksasi CO2
selama proses fotosintesis yang berakibat pada rendahnya pertambahan berat kering tanaman. Pada tanaman transgenik no 1, karena berat basahnya lebih
rendah dari kontrol mungkin disebabkan oleh kemampuannya untuk asimilasi N tidak sebaik tanaman transgenik no 2 dan 4 sehingga tersedia tenaga pereduksi (NADPH) yang cukup untuk mereduksi CO2 yang terlihat dengan terjadinya
kenaikan berat kering dibandingkan dengan kontrol.
Tanaman transgenik no 3 mengalami penurunan berat basah maupun berat kering yang cukup besar. Hal ini mungkin terjadi karena adanya kelainan perakaran (Gambar 27), dimana tanaman ini buluh akarnya tidak berkembang seperti pada tanaman kontrol maupun transgenik lainnya. Kelainan perakaran ini menyebabkan penyerapan haranya menjadi menurun dan berakibat pada rendahnya pertumbuhan tanaman. Mungkin insersi T-DNA, bukan akibat ekspresi hemA karena jumlah mRNAnya mirip dengan tanaman transgenik no 1, menyebabkan mutasi pada gen perakaran sehingga akar tidak berkembangan dengan baik.
Gambar 27. Kondisi perakaran tanaman transgenik no 4 (A) dan 3 (B)
Ekspresi ALAS meningkatkan kandungan klorofil
Tabel 3. Hasil analisis kandungan klorofil, aktivitas ALAS dan ALA Chl-a (mg/g) Chl-b (mg/g) Total Chl (mg/g) ALA-S (nmol.mg-1.h-1) ALA (µM) Kontrol 3.577 (100%) 1.369 (100%) 4.946 (100%) 0 0.535 Trangenik 5.313 (148.5%) 1.797 (131.2%) 7.11 (143.7%) 40.5 1.357
Hasil analisis kandungan klorofil terhadap tanaman transgenik no 4 didapatkan bahwa terjadi peningkatan kandungan total klorofil dari 4.9 mg/g berat basah pada tanaman tipe liar menjadi 7.1 mg/g berat basah atau terjadi kenaikan sekitar 43%. Klorofil a dan b mengalami kenaikan sekitar 48% dan 31% (Tabel 3). Peningkatan kandungan klorofil sejalan dengan meningkatnya sintesis ALA yang mungkin sebagian dikonversi menjadi klorofil. Zavgorodnyaya et al. (1997) yang mengekspresikan ALAS khamir ditanaman tembakau dan ditargetkan ke dalam kloroplas mendapatkan bahwa ekspresi ALAS di tanaman yang sebelumnya telah membawa antisense terhadap GSA-AT (salah satu enzim pada jalur C-5) dapat mengembalikan fenotip seperti pada tipe liarnya. Ekspresi ALAS juga dapat meningkatkan kapasitas sintesis ALA (30% dibanding kontrol) dan klorofil (20% dibanding kontrol) serta membuat tanaman menjadi tahan terhadap gabaculin (suatu inhibitor kuat terhadap enzim transaminase yang tergantung vit B, termasuk GSA-AT). Aktivitas ALAS yang tertinggi mencapat 23.05 nmol.mg-
1
.h-1. Jika kemampuan untuk mensintesis klorofil baru dapat ditingkatkan dengan menyediakan prekursor klorofil yang lebih banyak mungkin dapat menunda terjadinya senescen. Karena pada proses senescen terjadi penghancuran klorofil (Matile et al. 1996). Proses senescen dapat menurunkan laju fotosintesis yang pada akhirnya akan menurunkan produktifitas tanaman pertanian.
Analisis penurunan sifat monogenik Mendel
Untuk mengetahui pola penurunan sifat dari tanaman transgenik dilakukan pendeteksian keberadaan gen hemA pada 21 tanaman T1 dengan PCR. Ternyata dari 21 tanaman T1, 16 diantaranya membawa gen hemA (76%) atau dengan perbandingan 3:1, sehingga dapat disimpulkan bahwa pola pewarisannya normal sesuai dengan penurunan sifat monogenik Mendel (Gambar 28).
Gambar 28. Hasil analisis PCR turunan pertama tanaman transgenik No. 4
Pengujian ketahanan terhadap salinitas
Pada tanaman Arabidopsis thaliana transgenik yang mengekspresikan ALAS terjadi peningkatan ketahanan terhadap cekaman salinitas. Hal ini ditunjukkan dengan kemampuannya bertahan hidup selama penyiraman dengan larutan NaCl sampai 200 mM setiap hari selama 2 minggu (Gambar 29). Penelitian yang dilakukan oleh Watanabe et al. (2000) pada kecambah kapas juga menunjukkan hal serupa dimana kecambah kapas dapat tumbuh pada tanah yang diberi perlakuan 1.5% NaCl dan ALA. Hasil analisis kandungan Na+ dijaringan akar tanaman menunjukkan jumlah yang lebih rendah dari tanaman kontrol. Oleh karena itu mereka menduga kehadiran ALA dapat mengurangi pengambilan Na+.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 K+ 1.0 0.75 HemA Kanr kb
Mungkin juga karena ALA meningkatkan pengeluaran Na+ dari sel melalui pengaktifan Na+/H+ antiporter sehingga Na+ di jaringan akan lebih rendah.
Nishihara et al. (2003) melaporkan bahwa tanaman bayam yang ditumbuhkan pada dua konsentrasi NaCl 50 mM dan 100 mM dapat tumbuh dengan baik bahkan meningkat laju fotosintesisnya jika diberi perlakuan ALA 0.6 dan 1.8 mM. Daun bayam yang diberi perlakuan ALA memperlihatkan rasio asam askorbat teroksidasi/tereduksi yang rendah dan dan rasio glutathion tereduksi/teroksidasi yang tinggi jika dibandingkan kontrol dengan kondisi NaCl yang sama. Sedangkan aktivitas enzim antioksidan seperti askorbat peroksidase, katalase dan glutathion reduktase meningkat secara nyata, terutama setelah 3 hari setelah pemberian 0.6 dan 1.8 mM ALA. Data ini mengindikasikan bahwa perlindungan terhadap kerusakan oksidatif oleh jumlah antioksidan dan aktivitas enzim yang tinggi dan dengan lebih aktifnya siklus askorbat-glutathion mungkin terlibat dalam toleransi terhadap NaCl.
Enzim yang terlibat pendetoksikasi senyawa radikal bebas (ROS) seperti superoksida dismutase, katalase, peroksidase merupakan protein yang mengandung heme. Oleh karena itu sintesis ALA yang lebih tinggi akan menyediakan senyawa heme yang lebih banyak bagi pembentukan enzim-enzim pendetoksikasi radikal bebas seperti superoksida, hydrogen peroksida dan radikal hidroksil. Hal ini adalah salah satu kunci penting dalam ketahanan terhadap cekaman salinitas.
Pada penelitian lain menunjukkan bahwa pemberian ALA (tanpa cekaman) dapat meningkatkan jumlah fruktan (polifruktosilsukrosa) sebagai karbohidrat non-struktural pada tanaman rakkyo (Yoshida et al. 1996) dan bayam
(Yoshida et al. 1995). Seperti diketahui bahwa fruktan merupakan gula alcohol yang berperanan sebagai osmoprotektan dalam menjaga turgor sel terutama pada cekaman kekeringan. Sehingga ekspresi gen ALAS mungkin dapat meningkatkan toleransi terhadap cekaman salinitas pada tanaman, karena pada cekaman salinitas air juga menjadi tidak tersedia karena tekanan osmotik diluar sel lebih tinggi.
Gambar 29. Pengujian ketahanan terhadap cekaman salinitas. Tanda panah menunjukkan tanaman transgenik no. 4 yang tahan terhadap pemberian larutan NaCl 200 mM
Kloning Gen Chlorophyll A Oxygenase (CAO)
Kemampuan untuk hidup ditempat yang ternaungi ditentukan oleh kemampuan tanaman untuk memperbesar antena penangkap cahaya. Dalam keadaan cahaya redup, biasanya tanaman akan memperbesar antena sehingga jumlah cahaya yang diperlukan untuk proses fotosintesis dapat tercukupi. Oleh karena itu modifikasi genetika untuk mengatur ukuran antena mungkin sangat berguna dimasa depan dalam rangka meningkatkan produktifitas tanaman
pertanian. Dalam penelitian ini telah dilakukan kloning gen CAO (1.6 kb) yang bertanggung jawab dalam biosintesis klorofil b. Klorofil b diketahui sangat berperan dalam menentukan ukuran antena. Gen CAO yang diklon ke dalam plasmid pAS900 (Gambar 30) ini telah dilakukan pengurutan nukleotidanya setelah dibandingkan dengan yang ada di GeneBank menunjukkan tidak adanya mutasi pada urutan nukleotidanya (Gambar 31).
Gambar 30. Peta plasmid rekombinan pAS900-CAO1 yang membawa gen CAO
ATGAACGCCG CCGTGTTTAG TCCTTCTGCT TTATCTCTCC CTATCTCCTT CTCTAAAACC CGATCCTCTT TTCTCTCCAG AAGAGTCAAT AAAGAAGGGC GTGAAAGGAG AATTTAGGGT ATTTGCTGTG TTTGGTGATG AGAGTGGATT AGTTGAGAAG GGAGACCTTT GTTTGATGTG GAGGATCCTA GATCAAAAGC TCCTCCTTAT AAAGGAAAGT TTTTAGATGT TAATCAAGCT ATTGAAGTTG CTAGGTTTGA TATTCAATAC TTGGATTGGC GTGCTCGTCA AGATCTTCTT ACCATTATGA TTCTTCATGA CAAGGTTGTT GATGTACTTA ATCCTCTAGC TCGTGAGTAC AAGTCCATCG GTACAGTGAA GAAAGAACTA GCTGGATTGC AGGAAGAATT ATCGAAAGCA CACCAACAGG TTCATATATC TGAAGCAAGG GTTTCGACTG CTTTAGACAA GTTAGCCCAC ATGGAAGAAT TGGTTAATGA TAGGTTGTTA CCTGGCAGAG TTGTAACGGA ATTAGATAAA CCCTCCTCTT CAACCACTGC TTCTGCTGTC GAGTTAGATA GGGAAAAGAC AAACACGGGT GCGAAAAGCT TGAATGTTTC TGGTCCGGTT CCGCCTTATA GTCCACACTT GAAGAATTTT TGGTATCCCG TTGCTTTCAC TGCAGATCTC AAGCATGATA CAATGGTACC AATTGAATGC TTTGAACAAC CATGGGTTAT CTTTAGGGGT GAAGACGGGA AACCAGGATG TGTACGGAAT ACATGTGCGC ATAGAGCATG TCCTCTTGAT CTTGGCACAG TGAACGAGGG ACGTATTCAA TGTCCGTACC ATGGATGGGA ATACTCAACC GATGGAGAAT GTAAGAAGAT GCCGTCTACA AAGTTACTGA AGGTGAAGAT CAAATCATTA CCTTGTCTTG AACAAGAAGG TATGATCTGG ATTTGGCCCG GTGATGAGCC ACCTGCACCT ATACTTCCTT CTTTACAGCC TCCATCAGGG TTTTTAATTC ATGCTGAGCT TGTAATGGAC CTCCCGGTGG AACACGGTTT ACTTCTAGAT AATCTCTTGG ATCTTGCTCA TGCCCCATTC ACTCATACAT CCACTTTTGC AAAAGGCTGG AGTGTCCCAA GTTTGGTGAA GTTTTTAACA CCTACCTCGG GTCTCCAAGG ATACTGGGAT CCATATCCAA TCGATATGGA ATTTAAACCA CCGTGTATTG TTTTATCGAC AATCGGGATA TCAAAACCCG GGAAACTAGA AGGCAAAAGC ACACAGCAGT GTGCAACACA TCTTCATCAA CTCCATGTCT GTTTACCTTC TTCTAAAAAC AAGACAAGAC TTCTATACCG AATGTCACTA GACTTTGCTC CTATATTAAA GAATCTTCCA TTCATGGAAC ATCTGTGGAG ACATTTCGCT GAACAGGTCT TAAACGAAGA TCTACGGCTA GTTTTAGGAC AACAAGAACG GATGTTAAAC GGAGCAAACA TATGGAATTT ACCAGTTGCT TATGACAAGC TCGGAGTTCG GTATAGACTA TGGAGGAACG CAGTAGATCG TGGCGATGAT AAACTACCTT TCTCCGGCTA ACTGAGCTC
Gambar 31. Urutan nukleotida gen CAO dari Arabidopsis thaliana ecotype Columbia
Daun di atas kanopi mendapatkan cahaya yang cukup untuk melakukan proses fotosintesis. Namun tidak demikian dengan daun yang berada dibawah kanopi. Oleh karena itu, laju fotosintesis menjadi berbeda-beda tergantung berapa cahaya yang dapat ditangkap oleh daun sesuai letaknya. Horton (2000) melaporkan pada padi, kontribusi daun bawah terhadap keseluruhan fotosintesis tanaman sangat signifikan meskipun laju fotosintesisnya lebih rendah dibandingkan daun atas yang mendapat cahaya penuh. Pembuangan daun ketiga dan keempat dapat menurunkan laju fotosintesis sampai 45%. Ekspresi gen CAO secara berlebih memungkinkan kita untuk memperbesar antena penangkap cahaya sehingga daun dibawah kanopi dapat menangkap cahaya secara lebih baik. Dengan demikian kontribusi daun bawah kanopi akan menjadi lebih signifikan dalam menyumbangkan fotosintat sehingga mungkin pada akhirnya dapat meningkatkan produksi tanaman.