Hasil analisis dinyatakan memiliki reprodusibilitas yang baik apabila nilai CV kurang dari ≤ 2% (USP, 2009).
HASIL DAN PEMBAHASAN Pemilihan fase gerak
Pada penelitian ini fase gerak yang akan digunakan untuk optimasi fase gerak adalah metanol, asetonitril, aquabidest dan asam ortofosfat. Pemilihan metanol dan asetonitril sebagai campuran fase gerak dikarenakan memiliki nilai viskositas yang relatif rendah yaitu berturut-turut 0,54 cP dan 0,34 cP (Hendayana, 2010), sehingga dapat menurunkan tekanan di dalam kolom. Nilai viskositas yang tinggi dapat menyebabkan laju difusi yang berkurang dan menghasilkan pelebaran puncak serta tekanan balik yang terlalu tinggi dalam kolom. Metanol dan asetonitril juga memiliki kekuatan eluen yang relatif besar, sehingga dapat mempercepat waktu elusi. Campuran fase gerak juga biasanya ditambahkan dengan asam atau basa. Penggunaan asam pada campuran fase gerak seperti asam trifluoasetat bertujuan untuk meningkatkan nilai resolusi dan menurunkan nilai tailing factor pada senyawa yang bersifat asam sehingga didapatkan nilai resolusi dan tailing factor yang memenuhi syarat (Chao et al.
2018).
Fase gerak yang digunakan untuk analisis menggunakan HPLC harus murni, sehingga digunakan metanol dan asetonitril HPLC grade (Hendayana, 2010), sedangkan untuk aquabidest dan asam ortofosfat harus disaring terlebih dahulu sebelum digunakan. Semua fase gerak yang akan digunakan harus di ultrasonikasi selama kurang lebih 15 menit untuk menghilangkan gelembung udara. Hal penting yang perlu diperhatikan adalah fase gerak air hanya bisa
8
digunakan selama 3 hari sedangkan untuk fase gerak yang mengandung <15%
solven organik dapat digunakan selama 1 bulan (Meyer, 2004).
Penentuan panjang gelombang pengamatan piperin
Pada penelitian ini dilakukan penentuan panjang gelombang pengamatan untuk piperin. Penentuan panjang gelombang pengamatan piperin dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Syarat suatu senyawa dapat dideteksi dengan spektrofotometer UV-Vis yaitu memiliki gugus kromofor dan auksokrom. Piperin memiliki gugus kromofor dan auksokrom seperti yang ditunjukkan pada gambar 1.
Gambar 1. Gugus kromofor dan auksokrom piperin
Berdasarkan struktur piperin diatas (Gambar 1.), piperin memiliki gugus kromofor yang merupakan gugus tak jenuh (pada ikatan kovalen) yang bertanggung jawab terhadap terjadinya absorbsi elektronik, sedangkan auksokrom gugus fungsi yang memiliki elektron bebas, dimana jika gugus ini bergabung dengan kromofor akan mempengaruhi panjang gelombang dan intensitas absorban (Dachriyanus, 2004).
Penentuan panjang gelombang pengamatan piperin dilakukan dengan mengukur serapan piperin dalam pelarut metanol dan dengan menggunakan larutan piperin dengan 3 seri konsentrasi yaitu 1, 2 dan 8 ppm. Penggunaan 3 seri konsentrasi bertujuan untuk memastikan apakah dengan adanya perbedaan konsentrasi dapat mempengaruhi panjang gelombang piperin yang akan dihasilkan. Menurut Sigma-Aldrich (2019) panjang gelombang piperin di dalam pelarut metanol menghasilkan serapan maksimal berada pada 343 nm, sehingga pembacaan panjang gelombang maksimum dilakukan pada rentang 300-400 nm.
Keterangan Kromofor : Auksokrom :
9
Hasil pembacaan spektra panjang gelombang pengamatan piperin disajikan pada gambar 2.
Gambar 2. Pembacaan spektrum piperin konsentrasi 1, 2 dan 8 ppm dengan pelarut metanol dengan menggunakan spektrofotometer UV
Tabel II. Panjang gelombang maksimum dari seri konsentrasi Piperin
Konsentrasi Piperin (ppm) Panjang Gelombang
Maksimum (nm) Absorbansi
1 343,00 0,213
2 343,00 0,427
8 343,00 0,891
Menurut Farmakope Indonesia (2014), hasil pengamatan panjang gelombang maksimum dapat digunakan jika tidak menyimpang lebih dari 1 nm dari panjang gelombang teoritis. Pada tabel II. diperoleh nilai panjang gelombang maksimum 343,00 nm pada semua konsentrasi yaitu 1, 2 dan 8 ppm. Berdasarkan hasil tersebut, adanya perbedaan konsentrasi tidak menyebabkan terjadinya pergeseran panjang gelombang maksimum. Dari hasil pengamatan, panjang gelombang maksimum yang diperoleh tidak berbeda dari panjang gelombang
Piperin 2 ppm Piperin 8 ppm
Piperin 1 ppm
10
maksimum, sehingga hasil yang diperoleh dapat diterima dan digunakan sebagai panjang gelombang maksimum untuk analisis piperin dengan metode HPLC.
Penentuan panjang gelombang pengamatan juga dapat digunakan untuk menentukan panjang gelombang optimum yang dapat digunakan untuk analisis campuran ekstrak, misalnya penentuan panjang gelombang pengamatan untuk piperin dan kurkumin yang dapat digunakan untuk standarisasi campuran ekstrak Piper nigrum Linn. dan ekstrak rimpang kunyit. Panjang gelombang teoritis kurkumin adalah 425 nm (Farmakope Herbal Indonesia, 2008). Penelitian ini merupakan bagian dari rangkaian penelitian analisis produk sediaan farmasi yang mengandung kurkumin dan piperin dalam campuran ekstrak Piper nigrum Linn.
dan ekstrak rimpang kunyit dengan perbandingan 1:3 menggunakan HPLC fase terbalik dengan tujuan untuk standarisasi suatu ekstrak. Oleh karena itu, pengamatan panjang gelombang optimum piperin kurkumin dilakukan pada rentang 300-450 nm. Pengamatan panjang gelombang optimum bertujuan untuk mendapatkan panjang gelombang yang digunakan untuk mendeteksi piperin dan kurkumin secara optimum.
Gambar 3. Pembacaan spektrum piperin kurkumin dengan pelarut metanol dengan menggunakan spektrofotometer UV
Hasil pembacaan spektrum overlap piperin dan kurkumin oleh spektrofotometer UV-Vis disajikan pada gambar 3. Berdasarkan gambar 3. daerah spektrum panjang gelombang serapan overlap piperin dan kurkumin yaitu kurang
Piperin 2 ppm
Kurkumin 12 ppm
353 nm
11
lebih pada rentang 300-380 nm, kemudian dipilih panjang gelombang yang memberikan serapan optimum untuk piperin dan kurkumin dengan perbandingan konsentrasi 1:3 yaitu pada 353 nm. Pemilihan panjang gelombang pada analisis menggunakan metode HPLC dapat mempengaruhi sensitivitas alat untuk mendeteksi suatu analit namun tidak akan mempengaruhi nilai tR, Rs, dan N, sehingga tidak masalah jika tidak menggunakan panjang gelombang maksimum.
Optimasi Fase Gerak
Metode HPLC yang digunakan pada penelitian ini adalah HPLC fase terbalik dimana fase diam yang digunakan lebih cenderung nonpolar dari pada fase geraknya. Fase diam yang digunakan adalah oktadesilsilan (C18) dengan fase gerak metanol (IP= 5,1), asetonitril (IP=5,8), aquabidest (IP= 10,2) dan penambahan asam ortofosfat (Snyder et al., 2010). Sistem HPLC yang digunakan adalah isokratik dimana tidak ada pergantian rasio atau komposisi fase gerak saat analisis berlangsung.
Pemisahan suatu senyawa di dalam kolom dipengaruhi oleh interaksinya dengan fase diam dan fase gerak. Jika suatu senyawa berinteraksi kuat dengan kolom akan menyebabkan waktu retensi menjadi lama dan sebaliknya jika suatu senyawa cenderung berinteraksi dengan fase geraknya akan menyebabkan waktu retensi menjadi cepat.
Senyawa piperin merupakan senyawa yang memiliki bagian-bagian yang bersifat nonpolar yang dapat berinteraksi dengan fase diam oktadesilsilan (C18) yaitu dengan interaksi van der waals. Adanya interaksi antara piperin dan fase diam menyebabkan piperin dapat tertahan dikolom. Selain memiliki bagian nonpolar, piperin juga memiliki bagian yang bersifat polar, sehingga dapat berinteraksi dengan fase geraknya. Adanya interaksi dengan fase gerak ini kemudian akan mengelusi piperin untuk keluar dari kolom. Keluarnya piperin dari kolom juga dapat dibantu dengan adanya kecepatan alir fase gerak. Kemungkinan interaksi piperin dengan fase diam dan fase gerak dapat dilihat pada gambar 4 dan 5.
12
Gambar 4. Kemungkinan interaksi piperin dengan fase diam (interaksi van der waals)
Gambar 5. Kemungkinan interaksi piperin dengan fase gerak (interaksi Hidrogen)
Fase gerak yang digunakan pada penelitian ini mengacu pada metode Sethi, et al (2009) yang menggunakan fase gerak asetonitril:metanol:aquabidest:asam trifluoroasetat (17,6:35,3:47:0,1), dengan laju alir 2,5 ml/menit dan fase diam C18, diperoleh waktu retensi untuk piperin adalah 2,5 menit. Pada penelitian ini akan digunakan laju alir 1 mL/menit untuk memperlambat waktu retensi hal ini dikarenakan pada menit sekitar 1 sampai dengan 3 terdapat peak kecil yang muncul dan dapat mempengaruhi hasil analisis.
Selain itu, peneliti melakukan modifikasi pada komposisi fase gerak dan
13
melakukan penggantian asam trifluoroasetat menjadi asam ortofosfat. Hal ini dikarenakan menurut Meyer (2004) asam trifluoroasetat memiliki nilai pKa yang rendah yaitu 0,2 yang bersifat korosif, sedangkan asam orthofosfat memiliki nilai pKa 2. Modifikasi komposisi fase gerak yang digunakan juga memperhatikan nilai pH akhir dari campuran fase gerak, dimana diharapkan nilai pH > 3 yang bertujuan untuk mencegah kerusakan kolom akibat penggunaan fase gerak yang terlalu asam. Selanjutnya dilakukan beberapa perubahan komposisi fase gerak untuk mendapatkan pemisahan yang baik.
Parameter optimasi metode dilihat dari bentuk peak yang memiliki nilai tailing factor (TF) 0,8-1,5 (USP, 2009) yang menunjukkan analit dapat keluar dari kolom secara serentak. Waktu retensi efektif yang diharapkan adalah kurang dari 10 menit (Kazakevich dan LoBrutto, 2007), namun waktu retensi diharapkan tidak berada pada kisaran menit ke-1 sampai dengan ke-3, hal ini dikarena pada menit tersebut umumnya akan muncul peak kecil yang dapat menganggu hasil analisis.
Nilai resolusi (Rs) yang diharapkan yaitu memiliki nilai lebih dari 1,5 yang menandakan pemisahan puncak yang baik (Meyer, 2010). Parameter optimasi lainnya yang mengukur efisiensi kolom adalah jumlah lempeng teoritis (N), dimana nilai rekomendari dari FDA (1994) nilai N adalah lebih dari 2000.
Nilai resolusi yang dihasilkan merupakan jarak kromatogram piperin dengan peak kecil yang ada didepannya. Perbandingan komposisi fase gerak yang pertama kali akan diuji adalah asetonitril:metanol:aquabidest:asam ortofosfat 0,1% (20:30:47,5:2,5 v/v/v/v), nilai tR, Rs, TF dan N disajikan pada tabel II.
Penggunaan fase gerak tersebut menghasilkan kromatogram seperti pada gambar 6. Pada gambar 6. tampak bahwa tidak adanya kromatogram piperin yang terdeteksi sehingga dilakukan modifikasi fase gerak yaitu dengan meningkatkan komposisi asetonitril untuk meningkatkan kekuatan eluent, sehingga diperoleh komposisi fase gerak asetonitril:aquabidest:asam ortofosfat 0,1% (50:47,5:2,5 v/v/v).
14
Tabel III. Hasil optimasi rasio fase gerak
Meto
15
Gambar 6. Kromatogram piperin dengan komposisi fase gerak
asetonitril:metanol:aquabidest:asam ortofosfat 0,1% (20:30:47,5:2,5 v/v/v/v) laju alir 1 mL/menit
Perbandingan komposisi fase gerak asetonitril:aquabidest:asam ortofosfat 0,1% (50:47,5:2,5 v/v/v) memiliki nilai pH ±4. Berdasarkan hasil optimasi fase gerak (tabel II.) yang telah dilakukan dengan fase gerak tersebut menyebabkan piperin keluar terlalu cepat yaitu pada menit ke 0,516 menit (Gambar 7.), sehingga tidak dapat digunakan karena pada rentang waktu 1 sampai dengan 3 menit pada umumnya akan muncul peak atau kromatogram kecil dari pelarut metanol yang digunakan (Gambar 8.), dan dapat mengganggu kromatogram hasil analisis piperin yang diperoleh.
Gambar 7. Kromatogram piperin dengan komposisi fase gerak
asetonitril:aquabidest:asam ortofosfat 0,1% (50:47,5:2,5 v/v/v) laju alir 1 mL/menit
16
Gambar 8. Kromatogram blanko berupa metanol dengan fase gerak asetonitril:metanol:aquabidest (30:45:25 v/v/v) dengan laju alir 1 mL/menit
Optimasi selanjutnya dilakukan untuk menurunkan kekuatan eluent fase gerak sebelumnya, sehingga dilakukan penurunan jumlah asetonitril dan menambah jumlah metanol dan asam ortofosfat. Komposisi fase gerak yang akan diuji adalah asetonitril:metanol:asam ortofosfat 0,1% (20:30:50 v/v/v) dengan laju alir 1 mL/menit diperoleh hasil yang disajikan pada gambar 9.
Gambar 9. Kromatogram piperin dengan komposisi fase gerak
asetonitril:metanol:asam ortofosfat 0,1% (20:30:50 v/v/v) laju alir 1 mL/menit
Berdasarkan hasil optimasi dan penelususan pustaka, penggunaan asam pada fase gerak menyebabkan piperin keluar terlalu cepat, bahkan menyebabkan tidak munculnya kromatogram dari piperin. Menurut Guan dan Palmer (2006), penambahan asam pada fase gerak untuk analisis analit yang bersifat basa dapat menyebabkan analit terprotonasi (Gambar 10.) dan membentuk kompleks chaotropic anion-associated atau pembentukan pasangan ion melalui interaksi ionik yang menyebabkan peningkatan tingkat kelarutan di dalam pelarut polar (Gambar 11.). Pada penelitian ini, piperin merupakan salah satu senyawa yang bersifat basa lemah, sehingga penambahan asam pada fase gerak menyebabkan
17
piperin terprotonasi dan meningkatkan kelarutannya di dalam air atau pada fase gerak yang cenderung bersifat polar. Pada analisis menggunakan HPLC fase terbalik, fase gerak yang digunakan cenderung bersifat polar, sehingga dapat disimpulkan bahwa penggunaan asam menyebabkan piperin tidak berinteraksi dengan fase diam C18 dan berinteraksi kuat dengan fase gerak, sehingga piperin dibawa langsung keluar dari kolom oleh fase gerak dan tidak terdeteksi oleh detektor.
Gambar 10. Reaksi antara piperin dan asam ortofosfat yang menyebabkan piperin terprotonasi
Gambar 11. Kompleks chaotropic anion-associated atau pembentukan pasangan ion melalui interaksi ionik
Penggunaan metanol juga dapat mempengaruhi retensi dari piperin, tampak dari hasil kromatogram pada campuran fase gerak metode 2 yang tidak mengandung metanol. Pada metode 2 hanya terdapat campuran fase gerak berupa asetonitril, aquabidest dan OPA 0,1%, sehingga menyebabkan piperin yang terprotonasi sedikit tertahan didalam kolom dan dapat terdeteksi pada menit ke 0,516 menit. Hal ini dikarenakan tidak adanya metanol yang dapat membantu pembentukan pasangan ion melalui interaksi ionik. Penggunaan metanol dapat mempercepat elusi piperin untuk keluar dengan kolom karena metanol dapat berinteraksi dengan piperin terprotonasi dengan membentuk interaksi ionik (gambar. 11) sehingga dapat mengelusi piperin keluar dari kolom terlalu cepat dan
18
tidak terdeteksi oleh detektor seperti hasil optimasi dari campuran fase gerak metode 1 dan 3 (tabel III.)
Fase gerak selanjutnya dimodifikasi dengan menghilangkan komposisi asam. Berdasarkan hasil optimasi pada tabel II. komposisi fase gerak asetonitril:metanol:aquabidest (30:25:45 v/v), dalam waktu 15 menit kromatogram piperin tidak terdeteksi, hal tersebut kemungkinan menandakan senyawa piperin keluar dari kolom dalam waktu lebih dari 15 menit (gambar 12.).
Gambar 12. Kromatogram piperin dengan komposisi fase gerak asetonitril:metanol:aquabidest (30:25:45 v/v/v) laju alir 1 mL/menit
Perubahan komposisi fase gerak selanjutnya adalah dengan mengurangi jumlah air dan meningkatkan jumlah asetonitril dan metanol dengan tujuan untuk meningkatkan eluent strength sehingga dapat mempercepat waktu retensi.
Komposisi fase gerak selanjutnya yaitu asetonitril:metanol:aquabidest (40:30:30 v/v/v) menghasilkan nilai TF dan Rs yang baik, namun nilai tR yang dipeoleh adalah 10,719 menit yang menunjukkan bahwa nilai tersebut belum memenuhi syarat kerena tR>10. Komposisi fase gerak selanjutnya adalah asetonitril:metanol:aquabidest (30:45:25 v/v/v) diperoleh nilai TR pada 8,768 menit, nilai Rs, TF dan N yang sudah memenuhi syarat. Untuk mempercepat waktu retensi dari senyawa piperin kemudian dilakukan peningkatan komposisi asetonitril. Komposisi fase gerak asetonitril:metanol:aquabidest (60:10:30 v/v/v) menghasilkan nilai TR pada 7,844 menit, TF, dan N yang sudah memenuhi syarat.
Optimasi selanjutnya yang dilakukan adalah dengan meningkatkan komposisi asetonitril untuk mempercepat waktu retensi serta memperbaiki nilai Rs, TF dan N dari kromatogram piperin. Berdasarkan hasil optimasi fase gerak
19
asetonitril:metanol:aquabidest (65:5:30 v/v/v) didapatkan waktu retensi yang lebih cepat yaitu 7,499 menit, TF sebesar 1,225, Rs 3,698 dan N sebesar 10497,889.
Jika dibandingkan dengan kromatogram yang diperoleh dengan menggunakan komposisi fase gerak asetonitril:metanol:aquabidest (60:10:30 v/v/v), maka waktu retensi yang diperoleh lebih cepat, serta memiliki nilai Rs dan N yang lebih baik.
Kromatogram hasil analisis piperin dengan menggunakan fase gerak asetonitril:metanol:aquabidest (65:5:30 v/v/v) dapat dilihat pada gambar 13.
Gambar 13. Kromatogram piperin dengan komposisi fase gerak optimum asetonitril:metanol:aquabidest (65:5:30 v/v/v) laju alir 1 mL/menit
Pada penelitian ini dilakukan percobaan dengan peningkatan laju alir menjadi 1,5 mL/menit, namun saat analisis berlangsung tekanan di dalam kolom meningkat, oleh karena itu proses analisis dihentikan, sehingga laju alir yang digunakan untuk analisis piperin di dalam ekstrak Piper nigrum Linn.
menggunakan laju alir 1 mL/menit. Berdasarkan hasil optimasi peningkatan komposisi asetonitril pada fase gerak diharapkan dapat meningkatkan eluent strength dan mempercepat waktu retensi dari piperin, serta dapat meningkatkan nilai resolusi dan jumlah lempeng teoritis, sehingga pada penelitian ini dipilih fase gerak yang optimum adalah asetonitril:metanol:aquabidest (65:5:30 v/v/v).
Tabel IV. Hasil analisis piperin di dalam ekstrak Piper nigrum Linn.
Konsentrasi AUC TR Resolusi TF N
30 ppm 3924770 7,477 3,430 0,925 8298,045
45 ppm 6941896 7,499 3,698 1,225 7917,889
100 ppm 9554382 7,470 3,387 1,045 8323,345
20
Fase gerak optimum yang diperoleh kemudian digunakan untuk analisis piperin di dalam ekstrak Piper nigrum Linn. dengan konsentrasi 30, 45 dan 100 ppm. yang sudah dipurifikasi sehingga memiliki kualitas yang baik dan hanya mengandung senyawa tunggal piperin yang akan dianalisis. Hasil analisis piperin di dalam ekstrak Piper nigrum Linn. disajikan pada tabel IV.
Gambar 14. Kromatogram overlay piperin di dalam ekstrak Piper nigrum Linn.
(konsentrasi 30, 45, dan 100 ppm) dengan komposisi fase gerak optimum asetonitril:metanol:aquabidest (65:5:30 v/v) laju alir 1 mL/menit
Berdasarkan hasil analisis ekstrak Piper nigrum Linn. (tabel IV.), di dalam ekstrak Piper nigrum Linn. yang digunakan baik pada konsentrasi 30, 45 dan 100 ppm terdapat senyawa piperin yang terdeteksi pada menit 7,499 menit; 7,447 menit dan 7,470 menit. Nilai AUC yang diperoleh menunjukkan semakin besar konsentrasi ekstrak maka semakin besar kadar piperin di dalam ekstrak Piper nigrum Linn (Gambar 14.). Nilai Rs yang diperoleh sudah memenuhi syarat >1,5 dan nilai N yang diperoleh sudah memenuhi syarat >2000. Selain itu bentuk peak dari piperin juga memiliki nilai TF yang memenuhi syarat yaitu 0,8-1,5.
Uji Kesesuaian Sistem
Uji kesesuaian sistem bertujuan untuk memastikan sistem HPLC yang digunakan dapat memberikan hasil yang presisi. Tujuan lainnya adalah untuk verifikasi sensitivitas deteksi, resolusi dan reprodusibilitas sistem kromatografi yang baik untuk digunakan dalam analisis. Uji kesesuaian sistem dapat dilakukan terhadap reprodusibilitas waktu retensi, resolusi, tailing factor, dan jumlah
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min
21
lempeng teoritis (Snyder et al. 2010). Syarat untuk uji kesesuaian sistem yang menandakan suatu metode memiliki reprodusibilitas yang baik apabila nilai CV kurang dari ≤ 2% (USP, 2009).
Uji kesesuaian sistem menggunakan ekstrak Piper nigrum Linn. yang sudah melalui tahap purifikasi sehingga sebagian besar ekstrak hanya mengandung piperin didalam. Pada uji kesesuaian sistem ini menggunakan fase gerak optimum yang disudah diperoleh yaitu asetonitril:metanol:aquabidest (65:5:20 v/v). Berikut hasil uji kesesuaian sistem yang disajikan pada tabel V.
Tabel V. Hasil uji kesesuaian sistem
Injeksi AUC tR Resolusi TF N reprodusibilitas sistem kromatogram yang baik untuk digunakan untuk analisis.
KESIMPULAN
Kondisi optimum untuk analisis senyawa piperin dalam ekstrak Piper nigrum Linn. dengan HPLC fase terbalik diperoleh pada perbandingan komposisi fase gerak asetonitril:metanol:aquabidest (65:5:30 v/v/v) dengan kecepatan alir 1 mL/menit menggunkana kolom C18 (250 x 4,6 mm) dan dideteksi pada panjang gelombang 353 nm.
SARAN
Perlu dilakukan tahapan validasi metode analisis setelah optimasi.
22