Teknik multipleks PCR diaplikasikan dalam penelitian ini sehingga primer yang digunakan terdiri atas satu primer forward dengan tujuh primer reverse
untuk tujuh jenis hewan yang digunakan. Primer forward yang sama untuk semua jenis hewan mengacu pada Matsunaga et al. (1999). Primer reverse setiap jenis hewan dirancang pada daerah spesifik dalam runutan nukleotida cyt b. Primer
reverse tikus dalam penelitian ini dirancang dengan program MEGA 4.
Sekuen gen cyt b beberapa jenis hewan diperoleh dari NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Sekuen cyt b tikus (Rattus norvegicus)sepanjang 1143 pb (nomor akses GenBank HM222710) disejajarkan (multiple alignment) dan dicari runutan basa yang hanya terdapat pada sekuen cyt b jenis hewan tersebut dibandingkan dengan sekuen cyt b kambing (Capra hircus) sepanjang1140 pb (nomor akses GenBank EU130780), ayam (Gallus gallus) sepanjang 1143 pb (nomor akses GenBank AF195628), sapi (Bos taurus) sepanjang 1140 pb (nomor akses GenBank AF195628), domba (Ovis aries) sepanjang 1140 pb (nomor akses GenBank EU365990), babi (Sus scrofa) sepanjang 1140 pb (nomor akses GenBank AY634188) dan kuda (Equus caballus) sepanjang 1139 pb (nomor akses GenBank AY522328). Fragmen ini terletak di dalam gen cyt b berdekatan dengan gen tRNA Glu. Posisi penempelan primer hasil rancangan ditampilkan pada Gambar 6.
Gambar 6 Situs penempelan primer pada sekuen gen cyt b Rattus norvegicus
(nomor akses GenBank HM222710). Posisi primer forward (warna kuning/cetak tebal bergaris bawah), primer reverse hasil rancangan (warna merah/kotak).
1 atgacaaaca tccgaaaatc tcacccccta ttcaaaatca tcaaccactc ctttatcgac
61 ctccccgccc catctaacat ctcatcatga tgaaacttcg gttctctact aggagtatgc 121 ctcatagtac aaatcctcac aggcttattc ctagcaatac actacacgtc tgataccata 181 acagcattct catcagtcac ccacatctgc cgagacgtaa actacggctg actaatccga 241 tacctacacg ccaacggcgc ctcaatattt ttcatctgcc tattcctcca tgtgggacga 301 ggactatact atggatccta cactttccta gaaacctgaa acattgggat catcctacta 361 tttgcagtca tagcaactgc attcatgggc tatgtactcc catgaggaca aatatcattc 421 tgaggagcta cagtaattac aaacctatta tcagctatcc cttacattgg gactacccta 481 gtcgaatgaa tctgaggagg cttctcagta gacaaagcaa ccctaacacg cttcttcgca 541 ttccacttca tcctcccatt cattatcgcc gcccttgcaa ttgtacatct tcttttcctc 601 cacgaaacag gatcaaataa ccccacagga ttaaactccg acgcagacaa aatcccattc
Situs penempelan primer forward dimulai dari posisi basa ke-58 sampai basa ke-95, sedangkan situs penempelan primer hasil rancangan mulai dari posisi basa ke-660 sampai basa ke-633 pada runutan nukleotida sekuen gen cyt b tikus (Rattus norvegicus). Desain primer sangat penting dan menentukan pada teknik multipleks PCR, karena spesifisitas primer dan temperature melting (Tm) lebih menentukan keberhasilan amplifikasi dibandingkan dengan simpleks PCR. (Matsunaga et al. 1999). Menurut Henegariu et al. (1997) primer yang digunakan dalam multipleks PCR harus memenuhi beberapa syarat seperti panjang primer terdiri atas 18-24 pb atau lebih, kandungan basa GC 35-60% serta memiliki suhu
annealing 55-58oC atau lebih tinggi. Hasil rancangan primer reverse tikus sudah memenuhi syarat sebagai suatu rangkaian primer dan ditampilkan pada Tabel 6. Tabel 6 Kriteria primer tikus hasil rancangan
Kriteria Primertikus
Panjang primer (nukleotida) 28 Kandungan basa GC (%) 42.85 Suhu annealing (oC) 60 Panjang produk PCR (pb) 603
Derajat Kesamaan Primer Spesifik
Uji homologi primer spesifik terhadap tujuh jenis hewan dalam penelitian ini dilakukan melalui perhitungan persentase kesamaan runutan basa dari setiap jenis hewan yang diuji, sehingga diketahui tingkat kespesifikan dari suatu runutan DNA. Uji homologi penentuan spesifisitas menggunakan genetic information processing software GENETYX-WIN versi 4.0. Hasil uji homologi primer spesifik pada sekuen cyt b tujuh jenis hewan disajikan pada Tabel 7.
Tabel 7 Derajat kesamaan primer spesifik pada tujuh jenis hewan
Primer Spesifik % Homologi
Kambing Ayam Sapi Domba Babi Kuda Tikus
Forward (38 pb) 92.1 89.5 89.5 92.1 92.1 86.8 89.5 Kambing (26 pb) - 57.7 60.8 60.8 72.2 79.2 66.7 Ayam (27 pb) 66.7 - 61.1 53.8 75.0 73.0 77.8 Sapi (29 pb) 81.5 60.8 - 66.7 61.5 79.3 72.2 Domba (26 pb) 95.0 73.7 66.7 - 75.0 55.6 66.7 Babi (27 pb) 58.8 64.7 72.7 52.0 - 66.7 58.8 Kuda (26 pb) 84.0 64.7 76.0 80.0 76.0 - 75.0 Tikus (28 pb) 82.6 63.6 88.0 80.0 78.2 72.7 -
Hasil penelitian menunjukkan bahwa primer forward memiliki persentase kesamaan yang relatif tinggi terhadap sekuen kambing, ayam, sapi, domba, babi, kuda dan tikus, yaitu berkisar antara 86.8 - 100% dari runutan 38 basa. Runutan primer reverse memiliki persentase kesamaan yang tinggi pada satu jenis hewan tertentu dan rendah pada jenis hewan lainnya, sehingga dapat dikatakan primer
reverse tersebut bersifat spesifik untuk satu jenis hewan tertentu. Sekuen primer
reverse ayam memiliki persentase kesamaan 100% dengan sekuen gen cyt b ayam dari runutan 27 basa, tetapi persentase kesamaan dengan jenis hewan lain adalah rendah, begitu pula dengan sekuen primer reverse sapi, domba, babi dan kuda. Hasil tersebut sesuai dengan penelitian Matsunaga et al. (1999) yaitu rasio ketidakcocokan antara primer spesifik dengan sekuen jenis hewan lain lebih dari 15% kecuali rangkaian sepasang primer kambing dan domba. Ketidaksesuaian lebih dari 15% menurunkan melting temperature (Tm) lebih dari 15oC dan membuat primer reverse menempel hanya untuk sekuen spesifik jenis hewan tertentu dalam multipleks PCR.
Menurut Matsunaga et al. (1999), runutan nukleotida primer forward tidak sama dengan runutan nukleotida sekuen cyt b enam jenis hewan yaitu sekitar 3-5 basa dengan panjang sekuen 38 pb. Setiap 1% ketidakcocokan dari basa dalam DNA untai ganda (double-stranded DNA) mengurangi melting temperature (Tm) 1-1.5oC (Sambrook et al. 1989). Ketidaksesuaian dari primer forward akan menurunkan Tm dari cetakan primer DNA untai ganda sekitar 10-15oC, sehingga primer forward dirancang lebih panjang (38 pb) dari primer spesifik setiap jenis hewan (26-29 pb). Situs penempelan primer pada sekuen gen cyt b kambing, ayam, sapi, domba, babi, kuda dan tikus disajikan pada Gambar 7.
10 20 30 40 50 60 70 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| Kambing gacctcccaa ccccatcaaa catctcatca tgatgaaact ttggatccct cctaggaatt tgcctaatct Ayam gacctcccag ccccatccaa catctctgct tgatgaaatt tcggctccct attagcagtc tgcctcatga
Sapi gaccttccag ccccatcaaa catttcatca tgatgaaatt tcggttccct cctgggaatc tgcctaatcc
Domba gatctcccag ctccatcaaa tatttcatca tgatgaaact ttggctctct cctaggcatt tgcttaattt Babi gacctcccag ccccctcaaa catctcatca tgatgaaact tcggttccct cttaggcatc tgcctaatct Kuda gacctaccag ccccctcaaa catttcatca tgatgaaact tcggctccct cctaggaatc tgcctaatcc
Tikus gacctccccg ccccatctaa catctcatca tgatgaaact tcggttctct actaggagta tgcctcatag Primer GACCTCCCAG CTCCATCAAA CATCTCATCT TGATGAAA-- --- --- ---
80 90 100 110 120 130 140 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| Kambing tacaaatcct aacaggccta ttcctagcaa tacactatac atccgacaca ataacagcat tttcctctgt Ayam cccaaatcct caccggccta ctactagcca tgcactacac agcagacaca tccctagcct tctcctccgt Sapi tacaaatcct cacaggccta ttcctagcaa tacactacac atccgacaca acaacagcat tctcctctgt Domba tacagattct aacaggccta ttcctagcaa tacactatac acctgacaca acaacagcat tctcctctgt Babi tgcaaatcct aacaggcctg ttcttagcaa tacattacac atcagacaca acaacagctt cctcatcagt Kuda tccaaatctt aacaggccta ttcctagcca tacactacac atcagacacg acaactgcct tctcatccgt Tikus tacaaatcct cacaggctta ttcctagcaa tacactacac gtctgatacc ataacagcat tctcatcagt Primer --- --- --- --- --- --- -TCCCTCTGT 150 160 170 180 190 200 210 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| Kambing aactcacatt tgtcgagatg taaattatgg ctgaattatc cgatacatac acgcaaacgg agcatcaata Ayam agcccacact tgccggaacg tacaatacgg ctgactcatc cggaatctcc acgcaaacgg cgcctcattc Sapi tacccatatc tgccgagacg tgaactacgg ctgaatcatc cgatacatac acgcaaacgg agcttcaatg Domba aacccacatt tgccgagacg taaactatgg ctgaattatc cgatatatac acgcaaacgg ggcatcaata Babi tacacacatc tgtcgagacg taaattacgg atgaattatt cgctacctac atgcaaacgg agcatccatg Kuda cactcacatc tgccgagacg ttaactacgg atgaattatt cgctacctcc atgccaacgg agcatcaata Tikus cacccacatc tgccgagacg taaactacgg ctgactaatc cgatacctac acgccaacgg cgcctcaata Primer AACTCACATT TGTCGAG--- --- --- --- --- CGCCTCATTC 220 230 240 250 260 270 280 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| Kambing ttctttatct gcctattcat acatatcgga cgaggtctat attatggatc atataccttt ctagaaacat Ayam ttcttcatct gtatcttcct tcacatcgga cgaggcctat actacggctc ctacctctac aaggaaacct Sapi ttttttatct gcttatatat gcacgtagga cgaggcttat attacgggtc ttacactttt ctagaaacat Domba ttttttatct gcctatttat gcatgtagga cgaggcctat actatggatc atataccttc ctagaaacat Babi ttctttattt gcctattcat ccacgtaggc cgaggcctat actacggatc ctatatattc ctagaaacat Kuda ttttttatct gcctcttcat tcacgtagga cgcggcctct actacggctc ttacacattc ctagagacat Tikus tttttcatct gcctattcct ccatgtggga cgaggactat actatggatc ctacactttc ctagaaacct Primer TTCTTCATCT GTATCTT--- --- ---CTTAT ATTACGGGTC TTACACTTTT CTAG--- 290 300 310 320 330 340 350 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| Kambing gaaacattgg agtaatcctc ctgctcgcaa caatggctac agcattcata ggctatgttt taccatgagg Ayam gaaacacagg agtaatcctc ctcctcacac tcatagccac cgcctttgtg ggctatgttc tcccatgggg Sapi gaaatattgg agtaatcctt ctgctcacag taatagccac agcatttata ggatacgtcc taccatgagg Domba gaaacatcgg agtaatcctc ctatttgcga caatagccac agcattcata ggctatgttt taccatgagg Babi gaaacattgg agtagtccta ctatttaccg ttatagcaac agccttcata ggctacgtcc tgccctgagg Kuda gaaacattgg aatcatccta cttttcacag ttatagctac agcattcatg ggctatgtcc taccatgagg Tikus gaaacattgg gatcatccta ctatttgcag tcatagcaac tgcattcatg ggctatgtac tcccatgagg Primer --- --- ---TGCGA CAATAGCCAC AGCATTCATA G--- --- 360 370 380 390 400 410 420 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| Kambing acaaatatca ttttgagggg caacagtcat cactaatctt ctttcagcaa tcccatatat tggcacaaac Ayam ccaaatatca ttctgagggg ccaccgttat cacaaaccta ttctcagcaa ttccctacat tggacacacc Sapi acaaatatca ttctgaggag caacagtcat caccaacctc ttatcagcaa tcccatacat cggcacaaat Domba acaaatatca ttctgaggag caacagttat taccaacctc ctttcagcaa ttccatatat tggcacaaac Babi acaaatatca ttttgaggag ctacggtcat cacaaatcta ctatcagcta tcccttatat cggaacagac Kuda ccaaatatcc ttttgaggag caacagtcat cacgaacctc ctatcagcaa ttccctacat cggtactacc Tikus acaaatatca ttctgaggag ctacagtaat tacaaaccta ttatcagcta tcccttacat tgggactacc Primer --- --- -TACGGTCAT CACAAATCTA CTATCAGC-- --- ---TACTACC 430 440 450 460 470 480 490 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| Kambing ctagtcgaat gaatctgagg gggattctca gtagacaaag ccactctcac ccgattcttc gccttccact Ayam ctagtagagt gagcctgagg gggattttca gtcgacaacc caacccttac ccgattcttc gctttacact Sapi ttagtcgaat gaatctgagg cggattctca gtagacaaag caacccttac ccgattcttc gctttccatt Domba ctagtcgaat gaatctgggg aggattctca gtagacaaag ctaccctcac ccgatttttc gcctttcact Babi ctcgtagaat gaatccgagg gggcttttcc gtcgacaaag caaccctcac acgattcttc gcctttcact
Kuda ctcgtcgagt gaatctgagg tggattctca gtagacaaag ccacccttac ccgatttttt gctttccact Tikus ctagtcgaat gaatctgagg aggcttctca gtagacaaag caaccctaac acgcttcttc gcattccact Primer CTCGTCGAGT GAATCTGAG- --- --- --- --- --- 500 510 520 530 540 550 560 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| Kambing ttatcctccc attcatcatc acagctctcg ccatagtcca cctgcttttc ctccacgaaa caggatcgaa Ayam tactcctccc ctttgcaatc gcaggtatta ctatcatcca cctcaccttc ctacacgaat caggctcaaa Sapi ttatccttcc atttatcatc atagcaattg ccatagtcca cctactattc ctccacgaaa caggctccaa Domba ttattttccc attcatcatc gcagccctcg ccatagttca cctactcttc ctccacgaaa caggatccaa Babi ttatcctgcc attcatcatt accgccctcg cagccgtaca tctcctattc ctgcacgaaa ccggatccaa Kuda tcatcctacc cttcatcatc acagccctgg tagtcgtaca tttactattt cttcacgaaa caggatccaa Tikus tcatcctccc attcattatc gccgcccttg caattgtaca tcttcttttc ctccacgaaa caggatcaaa Primer --- --- --- --- --- --- --- 570 580 590 600 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ... Kambing caaccccaca ggaattccat cagacacaga taaaatccca ttt Ayam caacccccta ggcatctcat ccgactctga caaaattcca ttt Sapi caacccaaca ggaatttcct cagacgtaga caaaatccca ttc Domba caaccccaca ggaattccat cagacacaga taaaattccc ttc Babi caaccctacc ggaatctcat cagacataga caaaattcca ttt Kuda taacccctca ggaatcccat ccgatatgga caaaatccca ttc Tikus taaccccaca ggattaaact ccgacgcaga caaaatccca ttc Primer --- ---AAACT CCAACGCAGA CAAAATCCCA TTC
Gambar 7 Situs penempelan primer pada sekuen DNA mitokondria daerah cyt b
tujuh jenis hewan. Situs penempelan primer forward (warna kuning/garis bawah), situs penempelan primer reverse (warna merah/kotak).
DNA Total
Beragamnya sumber DNA yang digunakan dalam penelitian ini menyebabkan adanya perbedaan teknik pada saat isolasi dan ekstraksi sampel. Perbedaan tersebut terdapat pada saat preparasi sampel, lama inkubasi dan volume bahan yang digunakan sesuai dengan jenis sampel yang diekstraksi.
Secara umum teknik isolasi dan ekstraksi DNA dari darah lebih mudah dilakukan dibandingkan dengan daging atau produk olahan karena tidak mengandung bahan-bahan lain yang digunakan sebagai campuran, seperti pada produk olahan sehingga untuk mendapatkan sel sebagai target ekstraksi lebih mudah didapat. Penghancuran sel dilakukan dengan larutan lysis buffer untuk merusak membran sel. Lama waktu pelisisan sel tergantung pada bentuk produk yang diekstrak, semakin beragam campuran dan tekstur produk maka semakin lama waktu yang diperlukan. Waktu yang diperlukan untuk pelisisan sel yang berasal dari abon relatif lebih lama dibandingkan dengan bakso, daging dan darah.
Produk olahan menggunakan bahan utama berupa daging dan bahan tambahan sebagai campuran seperti tepung dan bumbu-bumbu. Produk olahan daging yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakso dan abon yang memiliki
perbedaan perlakuan pada saat proses pengolahan. Beberapa perlakuan dalam pembuatan produk tersebut dapat menjadi penyebab kesulitan pada saat isolasi dan ekstraksi DNA. Tahapan penting yang mempengaruhi isolasi DNA dari bakso dan abon yaitu (1) proses pengolahan secara mekanik diantaranya yaitu pencacahan dan penggilingan daging pada bakso, daging diremah atau disuwir- suwir dan ditumbuk halus serta pengepresan atau pengeluaran minyak pada abon. Beberapa proses tersebut menyebabkan terjadinya perubahan ukuran partikel, bentuk dan komposisi protein penyusun daging, sehingga akan mempengaruhi keadaan sel yang di dalamnya mengandung DNA, (2) perlakuan pemanasan dengan suhu dan tekanan tinggi diantaranya yaitu perebusan adonan bakso pada suhu 80oC, perebusan dalam air mendidih (100oC), perebusan dalam panci presto dan penggorengan abon pada suhu 175oC. Proses-proses tersebut selain mengakibatkan protein terdenaturasi juga berpengaruh pada stabilitas DNA, (3) pencampuran bumbu-bumbu dan bahan lain pada bakso yaitu penambahan tepung tapioka, STPP (sodium triposfat) dan bumbu-bumbu (garam, lada, bawang putih) serta penambahan bumbu-bumbu pada abon (garam, ketumbar, lengkuas, gula putih dan bawang merah). Menurut Nuraini (2004), bahan dan bumbu-bumbu yang ditambahkan dalam produk olahan menyebabkan DNA yang diekstraksi masih tercampur dengan senyawa kontaminan seperti oligopeptide, polisakarida, protein dan bahan-bahan organik lainnya.
Diferensiasi jenis hewan terbukti sulit, khususnya dalam sampel dengan komposisi yang beragam dan apabila diberi perlakuan panas (Kesmen et al. 2007). Hasil penelitian Matsunaga et al. (1999) menunjukkan, bahwa DNA dapat diisolasi dari daging yang sudah mengalami pemanasan pada suhu 100oC dan 120oC selama 30 menit. Nuraini (2004) berhasil mengisolasi dan mengamplifikasi DNA yang berasal dari organ tubuh dan produk olahan daging berupa bakso, sosis, kornet, dendeng dan abon, atau dapat dikatakan bahwa pemanasan tidak merusak DNA (Nuraini 2004). Martín et al. (2007) berhasil mengamplifikasi DNA mitokondria daerah 12SrRNA pada sampel DNA daging kucing, anjing dan tikus yang dipanaskan pada suhu 120oC selama 50 menit, 110oC selama 120 menit dan 133oC pada tekanan 300 kPa selama 20 menit. Menurut Kesmen et al. (2007),
amplifikasi DNA tidak dipengaruhi oleh penambahan rempah-rempah atau proses pemasakan.
Pengujian DNA hasil ekstraksi dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif. Penilaian kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarose 1% yang dijalankan pada tegangan 100 volt selama 40 menit. Hasil uji kualitas DNA pada gel agarose 1% disajikan pada Gambar 8 dan 9.
Gambar 8 Visualisasi DNA hasil ekstraksi darah dan daging beberapa jenis hewan pada gel agarose 1%. M: marker 100 pb, 1-2: DNA kambing, 3-4: DNA Ayam, 5-6: DNA sapi, 7-8: DNA domba, 9-10: DNA babi, 11-12: DNA kuda dan 13-14: DNA tikus.
Gambar 9 Visualisasi DNA hasil ekstraksi produk olahan (bakso dan abon) pada gel agarose 1%. M: marker 100 pb, 1-6: DNA bakso, 7-11: DNA abon.
Hasil ekstraksi daging yang diberi perlakuan panas dengan suhu tinggi menunjukkan terjadinya degradasi asam nukleat dan memiliki berat molekul yang sangat rendah dibandingkan dengan sampel DNA yang diekstraksi dari bahan mentah yang ditunjukkan dengan pola pita smear pada gel elektroforesis. Meskipun lebih stabil daripada bentuk protein, DNA juga terdegradasi oleh aksi radikal dan panas. Perlakuan progresif dan pengolahan tingkat tinggi pada produk
daging akan meningkatkan degradasi DNA dan kesulitan recovery DNA yang dianalisa (Martín et al. 2007).
Secara kuantitatif hasil pengukuran konsentrasi DNA dilakukan dengan spektrofotometer. Pengukuran jumlah DNA dengan spektrofotometer didasarkan pada prinsip iradiasi sinar ultraviolet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam larutan. Analisis asam nukleat umumnya dilakukan untuk penentuan konsentrasi rata-rata dan kemurnian DNA yang terdapat dalam sampel. Jumlah dan kemurnian tertentu diperlukan untuk kinerja optimal sampel DNA yang digunakan. Asam nukleat menyerap sinar ultraviolet dengan pola tertentu. Sampel ditembus sinar ultraviolet dan fotodetektor cahaya pada 260 nm, semakin besar cahaya yang diserap sampel, maka semakin tinggi konsentrasi asam nukleat dalam sampel (Sambrook & Russel 2001).
Sampel asam nukleat dapat terkontaminasi dengan molekul lain seperti protein, senyawa organik dan lain-lain. Spektrofotometer dapat digunakan untuk penentuan tingkat kemurnian DNA yang berkorelasi dengan kualitas DNA yaitu dengan melihat rasio absorbansi pada panjang gelombang 260 dan 280 nm (A260/280). Rasio absorbansi pada 260 nm dan 280 nm umumnya digunakan untuk menilai kontaminasi DNA oleh protein karena protein menyerap cahaya pada panjang gelombang 280 nm. Nilai absorbansi pada 260/280 nm untuk DNA murni adalah sekitar 1.8 (~1.8). Rasio 260/280 nm memiliki sensitifitas yang tinggi untuk menilai kontaminasi DNA oleh protein. Semakin tinggi kandungan asam nukleat dalam sampel, maka semakin rendah rasio nilai absorbansi pada 260/280 nm, begitu pula sebaliknya. Nilai negatif dapat terjadi jika pelarut yang digunakan dalam sampel dan blanko berbeda atau karena terdapatnya pewarna fluoresens dalam larutan (Tataurov et al. 2008).
Konsentrasi DNA yang digunakan dalam penelitian ini yaitu 50 µg/ml, adapun untuk sampel yang memiliki konsentrasi DNA di atas 50 µ g/ml dilakukan pengenceran dengan menambahkan air destilata. Penggunaan sampel dengan konsentrasi DNA yang sama dilakukan agar keberhasilan amplifikasi seragam. Hasil pengukuran kuantitas DNA disajikan pada Tabel 8.
Tabel 8 Hasil pengukuran konsentrasi DNA total No. Sampel A 260 (nm) A 280 (nm) A 260/280 (nm) Konsentrasi (µg/ml) 1. Kambing 1 (darah) 0.013 0.010 1.3 130 2. Kambing 2 (darah) 0.011 0.009 1.222 110 3. Ayam 1 (darah) 0.08 0.040 1.7 680 4. Ayam 2(darah) 0.018 0.014 1.286 180 5. Sapi 1(darah) 0.011 0.009 1.222 110 6. Sapi 2(darah) 0.023 0.016 1.438 230 7. Domba 1 (darah) 0.007 0.005 1.4 70 8. Domba 2 (darah) 0.012 0.010 1.2 120 9. Babi 1 (daging) 0.020 0.017 1.176 200 10. Babi 2(daging) 0.121 0.072 1.681 1210 11. Kuda 1 (darah) 0.006 0.004 1.500 60 12. Kuda 2 (darah) 0.007 0.006 1.167 70
13. Tikus putih 1(darah) 0.029 0.019 1.526 290 14. Tikus putih 2(darah) 0.020 0.016 1.25 200 15. Tikus got (daging) 0.031 0.022 1.409 310 16. Tikus rumah (daging) 0.011 0.008 1.375 110
15. Mencit 1 (darah) 0.009 0.007 1.286 90 16. Mencit 2 (darah) 0.006 0.003 2.00 60 17. Marmut 1 (darah) 0.008 0.007 1.143 80 18. Marmut 2 (darah) 0.008 0.007 1.143 80 19. Bakso 1% 1 0.089 0.063 1.143 890 20. Bakso 1% 2 0.027 0.014 1.929 270 21. Bakso 1% 3 0.034 0.018 1.889 340 22. Bakso 1% 4 0.028 0.015 1.867 280 23. Bakso 2.5% 1 0.022 0.008 2.750 220 24. Bakso 2.5% 2 0.019 0.006 3.167 190 25. Bakso 2.5% 3 0.028 0.015 1.867 280 26. Bakso 2.5% 4 0.027 0.016 1.688 270 27. Bakso 5% 1 0.030 0.016 1.875 300 28. Bakso 5% 2 0.009 0.006 1.5 90 29. Bakso 5% 3 0.033 0.019 1.737 330 30. Bakso 5% 4 0.014 0.010 1.4 140 31. Bakso 7.5% 1 0.055 0.025 2.2 550 32. Bakso 7.5% 2 0.047 0.020 2.350 470 33. Bakso 7.5% 3 0.157 0.084 1.869 1570 34. Bakso 7.5% 4 0.096 0.191 1.055 960 35. Bakso 10% 1 0.046 0.020 2.3 460 36. Bakso 10% 2 0.014 0.009 1.556 140 37. Bakso 10% 3 0.039 0.010 2.438 390 38. Bakso 10% 4 0.023 0.013 1.769 230 39. Bakso 15% 1 0.007 0.004 1.750 70 40. Bakso 15% 2 0.010 0.007 1.429 100 41. Bakso 15% 3 0.040 0.022 1.818 400 42. Bakso 15% 4 0.014 0.008 1.750 140 43. Bakso 20% 1 0.010 0.007 1.429 100 44. Bakso 20% 2 0.022 0.012 1.833 220 45. Bakso 20% 3 0.006 0.004 1.5 60
Tabel 8 Lanjutan No. Sampel A 260 (nm) A 280 (nm) A 260/280 (nm) Konsentrasi (µg/ml) 46. Bakso 20% 4 0.023 0.020 1.150 230 47. Bakso 25% 1 0.010 0.007 1.429 100 48. Bakso 25% 2 0.022 0.015 1.467 220 49. Bakso 25% 3 0.037 0.024 1.542 370 50. Bakso 25% 4 0.044 0.028 1.571 440 51. Abon 1% 1 0.140 0.075 1.867 1400 52. Abon 1% 2 0.178 0.094 1.894 1780 53. Abon 1% 3 0.082 0.044 1.864 820 54. Abon 1% 4 0.066 0.036 1.833 660 55. Abon 2.5% 1 0.208 0.107 1.944 2080 56. Abon 2.5% 2 0.176 0.091 1.934 1760 57. Abon 2.5% 3 0.156 0.114 1.368 1560 58. Abon 2.5% 4 0.091 0.049 1.857 910 59. Abon 5% 1 0.200 0.104 1.923 2000 60. Abon 5% 2 0.126 0.064 1.969 1260 61. Abon 5% 3 0.054 0.028 1.929 540 62. Abon 5% 4 0.071 0.039 1.821 710 63. Abon 7.5% 1 0.199 0.102 1.951 1990 64. Abon 7.5% 2 0.158 0.079 2.000 1580 65. Abon 7.5% 3 0.105 0.055 1.909 1050 66. Abon 7.5% 4 0.107 0.056 1.911 1070 67. Abon 10% 1 0.046 0.020 2.3 460 68. Abon 10% 2 0.039 0.010 2.438 390 69. Abon 10% 3 0.010 0.005 2.000 100 70. Abon 10% 4 0.003 0.013 1.769 230
Konsentrasi DNA hasil ekstraksi bervariasi antara 50 sampai 2080 µg/ml. Hal ini disebabkan sampel yang diekstraksi berasal dari sumber yang berbeda yaitu darah dan produk olahan (bakso dan abon). Adanya bahan campuran yang berbeda pada produk mempengaruhi konsentrasi DNA yang diperoleh. Hasil pengukuran rasio absorbansi pada panjang gelombang 260/280 nm sangat beragam tergantung pada sumber DNA yang diperoleh. DNA yang diekstraksi dari darah dan daging rata-rata memiliki rasio nilai absorbansi lebih rendah daripada DNA yang diekstraksi dari produk olahan. Hasil tersebut menunjukkan tingkat kemurnian DNA dari darah dan daging lebih tinggi daripada DNA yang berasal dari produk olahan. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh adanya kontaminasi protein dan bahan campuran lain yang digunakan dalam produk olahan, namun secara umum DNA hasil ekstraksi dari seluruh sampel dapat digunakan untuk proses amplifikasi.
Pengujian Primer Spesifik
Amplifikasi Fragmen DNA Cyt b Spesifik pada Beberapa Jenis Hewan
Teknik multipleks PCR digunakan dalam penelitian ini untuk amplifikasi sampel DNA oleh primer spesifik dengan pencampuran delapan primer (satu
forward dan tujuh reverse) secara bersamaan dalam satu reaksi. Amplifikasi daerah gen cyt b DNA mitokondria berhasil dilakukan pada kambing, ayam, sapi, domba, babi dan kuda menggunakan primer yang mengacu pada Matsunaga et al.
(1999) dan amplifikasi tikus menggunakan primer reverse hasil rancangan dengan
software MEGA 4. Tujuh jenis hewan berhasil diidentifikasi berdasarkan panjang pita atau produk PCR yang dihasilkan dengan tidak terjadinya reaksi silang. Keberhasilan amplifikasi gen cyt b tersebut ditunjukkan dengan panjang fragmen teramplifikasi berbeda-beda antar hewan yang berarti terdapat kespesifikan sekuen gen cyt b pada setiap jenis hewan.
Panjang fragmen hasil amplifikasi ruas gen cyt b kambing, ayam, sapi, domba, babi dan kuda sesuai dengan hasil yang diperoleh Matsunaga et al. (1999) yaitu berturut-turut 157 pb, 227 pb, 274 pb, 331 pb, 398 pb dan 439 pb, sedangkan untuk tikus teramplifikasi sepanjang 603 pb. Hasil amplifikasi ruas gen cyt b
ketujuh jenis ternak divisualisasikan pada gel agarose 2% yang dapat dilihat pada Gambar 10.
Gambar 10 Visualisasi hasil amplifikasi fragmen DNA spesifik tujuh jenis hewan. M: marker 100 pb, 1-2: kambing, 3-4: ayam, 5-6: sapi, 7-8: domba, 9- 10: babi, 11-12: kuda dan 13-14: tikus.
Ukuran produk PCR yang dihasilkan sangat tepat dengan tidak adanya fragmen tambahan dari setiap target. Hasil tersebut menunjukkan primer spesifik
untuk setiap jenis hewan teramplifikasi hanya pada satu ukuran untuk setiap target (Matsunaga et al. 1999). Gambar 9 menunjukkan bahwa hasil multipleks PCR berupa pita tunggal pada ukuran target dari satu jenis hewan dan tidak dihasilkan fragmen pada amplifikasi yang tidak spesifik.
Amplifikasi Fragmen DNA Cyt b pada Beberapa Jenis Tikus
Pengujian primer tikus hasil rancangan dilakukan pada beberapa jenis tikus untuk mengetahui perbedaannya jika sampel yang digunakan berasal dari jenis tikus yang berbeda. Tikus yang digunakan yaitu tikus rumah hitam (Rattus rattus), tikus got (Rattus norvegicus), tikus putih (Rattus norvegicus), mencit (Mus musculus) dan tikus hutan (Maxomys hellwaldii). Hasil amplifikasi divisualisasikan pada gel elektroforesis 2% dan ditampilkan pada Gambar 11 dan 12.
Gambar 11 Visualisasi hasil amplifikasi fragmen DNA tikus. M: marker 100 pb, 1-3: tikus got, 4-6: tikus putih, 7-8: tikus rumah, 9: mencit.
Gambar 12 Visualisasi hasil amplifikasi fragmen DNA tikus hutan. M: marker 100 pb, 1-4: tikus hutan (Maxomys hellwaldii).
Tikus hutan (Maxomys hellwaldii) yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari Sulawesi Utara. Maxomys hellwaldii disebut juga tikus berduri atau tikus hutan ekor putih, hidup di hutan hujan tropis dan hanya ditemukan di Indonesia. Maxomys awalnya digolongkan sebagai subgenus dari Rattus, tetapi oleh Musser et al. (1979) tikus ini digolongkan menjadi genus tersendiri dan dimasukan ke dalam famili Muridae dan sub famili Murinae sama seperti Rattus.
Hasil menunjukkan bahwa DNA cyt b pada kelima jenis tikus dapat teramplifikasi menggunakan primer tikus hasil rancangan. Jika dilihat