Susu merupakan salah satu produk pangan hewani bernilai gizi tinggi. Sebagai produk tinggi protein, jenis dan komposisi protein susu menentukan kualitas tidak hanya sebagai zat gizi, tetapi juga sifat fungsionalnya. Beberapa protein, seperti lisozim dan laktoferin, merupakan salah satu dari sistem antimikroba alami asal susu (Uniacke-Lowe et al. 2010; Salimei dan Fantuz 2012). Protein lainnya, seperti kasein, merupakan prekursor peptida bioaktif dengan beragam sifat fungsional. Tidak hanya itu, informasi komposisi protein juga
diperlukan untuk menduga potensi alergenitasnya. Kasein dan -laktoglobulin ialah beberapa contoh protein alergen mayor yang terdapat pada susu, khususnya sapi (Uniacke-Lowe et al. 2010; Salimei dan Fantuz 2012). Oleh sebab itu, informasi profil protein susu khususnya dari susu non-ASI sangat diperlukan untuk menduga potensi dan juga sifat alergenitasnya.
Hasil SDS-PAGE susu skim, kasein ataupun whey (Gambar 6 lajur S, K, dan W) menunjukkan pola pita protein yang mirip dengan beberapa penelitian sebelumnya (Gambar 6 lajur A dan B). Secara garis besar, pola migrasi protein susu di dalam gel SDS-PAGE dapat dibagi menjadi 3, yaitu area whey ber-BM tinggi, area kasein, dan area whey ber-BM rendah (Gambar 6). Bila dibandingkan dengan penelitian lain, pita 5 merupakan area kasein (Gambar 6 lajur S).
Kasein susu kuda merupakan produk dari 4 gen utama, yaitu αs1, αs2, , dan (Uniacke-Lowe et al. 2010). Pada penelitian ini, hasil SDS-PAGE memang
belum dapat membedakan dengan jelas antara αs1, αs2, , dan -kasein. Hal ini mungkin disebabkan oleh BM kasein susu kuda yang sangat berdekatan. Selain itu, masing-masing tipe kasein dapat memiliki sub-sub tipe atau fragmen-fragmen yang dapat saling tumpang tindih. Hal ini didukung oleh hasil karakterisasi kasein kuda poni yang dilakukan oleh Miranda et al. (β004). Walaupun αs1, , dan -kasein terdapat pada satu area yang berdekatan, -kasein memiliki BM berturut-turut αs1> > (Egito et al. 2003).
Kesamaan profil SDS-PAGE dengan beberapa penelitian terdahulu (Gambar 6 lajur A dan B) menunjukkan bahwa whey susu kuda pada penelitian ini disusun oleh protein-protein utama, antara lain: α-laktalbumin/α-Lac (pita 1), lisozim (pita 2), -laktoglobulin/ -LG I dan II (pita 3 dan 4), imunoglobulin rantai berat/IgHC (pita 6), serum albumin/SA (pita 7), dan laktoferin/LF (pita 8) (Gambar 6 lajur W). Profil ini tidak jauh berbeda dengan profil whey susu sapi dan ASI, walaupun pada susu kuda jumlah lisozimnya lebih banyak (0.5–1.33 g L-1), sedangkan -LG
23 tidak ditemukan pada ASI (Claeys et al. 2014) (Gambar 6 lajur C dan D). Selain itu, ditemukan pula pita-pita polipeptida lain yang belum teridentifikasi seperti pita 9 dan 10 (Gambar 6 lajur W). Kedua pita tersebut diduga kuat merupakan hasil hidrolisis parsial oleh enzim-enzim proteolitik di dalam susu kuda.
Penelitian sebelumnya telah menunjukkan adanya aktivitas dari enzim proteolitik indigenus asal susu kuda. Dengan menggunakan teknik elektroforesis 2 dimensi (2D) –yaitu kombinasi antara metode isoelectric focusing (IEF) dan SDS-PAGE, Hinz et al. (2012) berhasil memisahkan polipeptida-polipeptida berukuran 15.4 dan 21.1 kDa. Hasil analisis sekuen asam amino terhadap polipeptida-polipeptida tersebut menunjukkan derajat kesaamaan yang tinggi terhadap sekuen
asam amino αs1 dan -kasein susu kuda. Oleh sebab itu, polipeptida-polipeptida tersebut diduga berasal dari proteolisis αs1dan -kasein oleh plasmin (Hinz et al. 2012). Selain ditentukan oleh faktor genetik, profil protein susu kuda juga ditentukan oleh aktivitas proteolitik enzim-enzim indigenus.
Gambar 6 Perbandingan antara profil SDS-PAGE susu kuda dari Indonesia dan beberapa studi terdahulu, serta susu sapi dan ASI. Gambar A, protein susu skim dari kuda poni pada gel 12% (Miranda et al. 2004); B, susu kuda skim pada gel 15% (Inglingstad et al. 2010); S, K, dan W = susu skim, kasein 10% (b/v), dan konsentrat whey; C dan D, susu sapi dan ASI pada gel 15% (Inglingstad et al. 2010).
Indonesia memiliki banyak jenis kuda lokal dengan ciri fenotipe dan genotipe yang khas. Jenis-jenis kuda di Indonesia antara lain: kuda jawa, kuda timor, kuda batak, kuda padang, kuda flores, kuda sumba dan kuda sumbawa. Hasil analisis SDS-PAGE menunjukkan bahwa profil protein susu kuda keturunan sumbawa pada penelitian ini mirip dengan kuda jenis poni dan kuda lain dari Eropa. Meskipun demikian, perbedaan mungkin ditemukan pada kadar komposisi susunya. Menurut Uniacke-Lowe et al. (2010), selain dipengaruhi oleh faktor genetik, komposisi susu kuda juga dipengaruhi oleh faktor lingkungan (jenis kuda, cara pemeliharaan, waktu laktasi) walau mungkin terdapat batasan komposisi genetik yang tidak dapat dilampaui.
Selain faktor genetik, lingkungan (nutrisi), dan aktivitas enzim-enzim protease indigenus. Profil susu kuda nampaknya juga dibentuk oleh peran mikroorganisme, yaitu bakteri-bakteri asam laktat (BAL) indigenus. Enzim-enzim protease ekstraseluler yang dihasilkan oleh BAL selama fermentasi turut serta membentuk profil protein susu kuda secara keseluruhan. Perbedaan kecil (minor) yang ditemukan pada profil protein susu kuda dari berbagai penelitian, dapat disebabkan oleh komposisi mikroflora yang berbeda dan unik bagi tiap spesies atau breeding. Shi et al. (2012) berhasil mengisolasi 25 isolat Lactobacillus rhamnosus dan 2 isolat Lactobacillus fermentum asal susu kuda sumbawa autofermentasi. Keberagaman faktor-faktor di atas mungkin tidak hanya berimplikasi terhadap profil protein susu kuda, tetapi juga karakter fungsionalnya.
Profil Hidrolisat Kasein dan Whey Susu Kuda
Sebanyak 100 mg mL-1 protein terlarut kasein dan whey susu kuda dihidrolisis oleh 10 U mL-1 bromelin dan protease F11.4 sehingga diperoleh hidrolisat dengan profil SDS-PAGE yang bervariasi (Gambar 7 dan 9). Profil SDS-PAGE hidrolisat kasein menunjukkan bahwa bromelin sangat efektif menghidrolisis semua tipe kasein susu kuda. Hidrolisis ini menghasilkan pita baru (pita Y) dengan BM tidak jauh berbeda dari protein asalnya (Gambar 7A). Uniknya, pola hidrolisis ini sangat mirip dengan pola hidrolisis kasein kuda yang dilaporkan oleh Egito et al. (2001) (Gambar 8). Egito et al. (2001) menggunakan protease aspartat, yaitu kimosin (EC. 3.4.23.4) yang menghasilkan pita a, b, dan e (Gambar 8). Hasil sekuensing mengonfirmasi bahwa pita a (BM prediksi 22 kDa) merupakan fragmen N-teminal dari -kasein (f1-190). Pola migrasi pita a mirip dengan pita Y pada penelitian ini (Gambar 7A). Hasil analisis menunjukkan
kimosin memotong -kasein pada Leu190–Tyr191 (Egito et al. 2001). Oleh sebab itu, diduga kuat bahwa bromelin memiliki titik potong yang hampir mirip dengan kimosin sehingga dihasilkan fragmen dengan BM dan pola migrasi yang hampir serupa. Meskipun demikian, dibutuhkan studi lebih lanjut untuk mengonfirmasi hal tersebut.
Dibandingkan bromelin, protease F11.4 menghidrolisis protein kasein susu kuda secara lebih spesifik (tanda panah, Gambar 7B). Hidrolisis kasein oleh protease F11.4 diduga menghasilkan peptida dengan berat molekul sangat kecil (< 4.6 kDa) sehingga tidak tampak pada gel elektroforesis. Fenomena serupa juga ditemukan pada hasil penelitian Inglingstad et al. (2010) dengan menggunakan enzim gastrointestinal.
Sama halnya terhadap kasein, enzim bromelin dan protease F11.4 memiliki efektifitas hidrolisis yang berbeda terhadap protein whey susu kuda. Profil SDS-PAGE hidrolisat whey-bromelin menunjukkan bahwa bromelin efektif menghidrolisis laktoferin, protein nomor 9 dan 10 (Gambar 9A). Hidrolisis ini menghasilkan pita baru, yaitu pita X yang ber-BM cukup tinggi (Gambar 9A).
Selain itu, terjadi penebalan pita -laktoglobulin I (pita Y, Gambar 1E). Hal ini mungkin disebabkan adanya ikatan silang antara -laktoglobulin I dengan peptida-peptida ber-BM lebih rendah, misalnya melalui jembatan disulfida, seperti yang telah dilaporkan oleh Inglingstad et al. (2010).
25
Gambar 7 Pengaruh hidrolisis terhadap profil protein kasein susu kuda oleh enzim bromelin (A) dan protease F11.4 (B). Pita protein yang terhidrolisis ditunjukkan oleh tanda panah. Pita protein baru ditunjukkan oleh tanda panah dan abjad. M1 dan M2 ialah penanda protein ber-BM tinggi dan rendah. Gel diwarnai dengan perak nitrat.
Gambar 8 Hidrolisis kasein oleh kimosin pada gel poliakrilamida 15%. Keterangan: eCN, kasein kuda; bGMP, glikomakropeptida sapi. Fragmen a, b dan e ialah hasil hidrolisis kasein kuda. Sumber: Egito et al. 2001.
Berbeda halnya dengan bromelin, protease F11.4 aktif menghidrolisis -laktoglobulin I, lisozim, pita protein no. 9 dan 10 (Gambar 9B). Sama halnya dengan kasein, pita peptida baru tidak teramati pada gel hidrolisat whey-F11.4. Peptida yang dihasilkan diduga kuat berbobot molekul sangat kecil (< 4.6 kDa).
Protein -laktoglobulin merupakan salah satu protein alergen utama pada susu. Oleh sebab itu, karakter digestibilitas protein ini menentukan potensi alergenitas-nya. Bila dibandingkan dengan sapi dan kambing, -laktoglobulin kuda dilaporkan lebih cepat terhidrolisis oleh enzim-enzim intestinal, sedangkan lisozimnya lebih resisten (Inglingstad et al. 2010). Susu kuda telah digunakan sebagai pengganti susu sapi pada anak-anak dengan hipersensitifitas (alergi) (Uniacke-Lowe et al. 2010, Salimei dan Fantuz 2012). Hasil uji klinis menunjukkan bahwa susu kuda menunjukkan persentase tolerabilitas yang tinggi, yaitu 96% dari 25 responden anak-anak dengan penyakit alergi IgE susu sapi akut (Salimei dan Fantuz 2012). Karaker hipoalergenik susu kuda tersebut mungkin dapat ditingkatkan dengan aplikasi enzim protease F11.4 asal B. licheniformis dari penelitian ini. Walau demikian, karakter alergenitas bukan merupakan ruang lingkup penelitian ini, sehingga diperlukan penelitian lebih lanjut. Disisi lain hidrolisis lisozim susu kuda oleh protease F11.4 mungkin akan berpengaruh terhadap karakter antimikrobanya.
Gambar 9 Pengaruh hidrolisis terhadap profil protein whey susu kuda oleh enzim bromelin (A) dan protease F11.4 (B). Pita protein yang terhidrolisis ditunjukkan oleh tanda panah. Pita protein baru ditunjukkan oleh tanda panah dan abjad. M1 dan M2 ialah penanda protein ber-BM tinggi dan rendah. Gel diwarnai dengan CBB R-250.
Studi digestibilitas terhadap protein susu sapi, kambing, ASI, dan kuda menunjukkan bahwa kasein susu kuda didegradasi sangat cepat dan efektif oleh enzim lambung (Inglingstad et al. 2010). Berdasarkan analisis kadar protein dan gel elektroforesis, kasein susu kuda juga dihidrolisis secara efektif oleh enzim bromelin dan protease F11.4 (Lampiran 11). Seperti yang telah diulas oleh
27 Inglingstad et al. (β010), hal ini berkorelasi dengan jumlah -kasein susu kuda yang lebih sedikit dibandingkan dengan sapi atau kambing (Tabel 2). Ukuran misel kasein kuda yang berukuran 1.5 kali lebih besar (255 nm) dari sapi (182 nm) menjadikan rasio luas permukaan kasein dan volume menjadi lebih kecil,
sehingga jumlah -kasein lebih sedikit (Egito et al. 2001).
Kasein memiliki bentuk supramolekul yang terdiri atas sub-sub misel αs, , dan -kasein (Gambar 10). Bentuk ini distabilkan oleh ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik pada inti, nanocluster Ca-P, dan -kasein (Fox dan Brodkorb β00κ). -Kasein merupakan lapisan terluar misel kasein yang berfungsi meningkatkan kestabilan struktur misel melalui interaksi elektrostatik, meningkatkan resistensi terhadap suhu tinggi, dan enzim-enzim proteolitik (Uniacke-Lowe et al. 2010).
Ukuran misel kasein susu kuda yang besar dan rendahnya jumlah -kasein menjadikan misel kasein susu kuda lebih rentan terhadap aktivitas proteolitik enzim (Inglingstad et al. 2010). Selain itu, kerentanan kasein susu kuda juga dipengaruhi oleh faktor-faktor lain, antara lainμ tingkatan glikosilasi -kasein, kadar kalsium fosfor, dan struktur misel (Uniacke-Lowe et al. 2010). Kerentanan proteolitik kasein susu kuda berimplikasi terhadap potensi besarnya sebagai sumber peptida bioaktif.
Gambar 10 Supramolekul kasein distabilkan oleh -kasein dan nanokluster Ca-P. Gambar A, model McMahon dan Oommen (2008) berdasarkan hasil TEM; dan B, model Walstra (1999) di dalam Phadungath (2005).
Aktivitas Antioksidan Susu Kuda dan Hidrolisatnya
Radical scavenging merupakan salah satu mekanisme utama antioksidan yang telah terbukti menghambat oksidasi dan peroksidasi lipida, baik pada sistem pangan ataupun tubuh manusia. Pada penelitian ini, kemampuan peptida-peptida hidrolisat untuk meredam radikal bebas dianalisis dengan metode DPPH∙ radical scavenging assay menurut Escudero et al. (2012). Senyawa radikal DPPH∙ ialah senyawa organik radikal yang memiliki elektron terdesentralisasi sehingga
berwarna ungu tua dan diserap kuat pada 517 nm (Al-Temimi dan Choudhary 2013). Dibandingkan radikal lainnya, DPPH∙ bersifat lebih stabil. Ketika DPPH∙
menerima elektron atau H dari pendonor (antioksidan), maka akan terjadi penurunan intensitas warna (Al-Temimi dan Choudhary 2013).
Aktivitas antioksidan dari susu non-sapi, seperti kambing, unta, dan keledai, beserta peptida-peptida turunannya memang telah diteliti dan dilaporkan (Ahmed et al. 2015; Jrad et al. 2014; Piovesana et al. 2015). Sejauh ini, aktivitas antioksidan dari susu kuda dan peptida-peptidanya belum pernah dilaporkan. Hanya aktivitas DPPH∙ radical scavenging dari peptida asal susu keledai, yang memiliki kekerabatan terdekat dengan kuda, yang pernah dilaporkan (Piovesana et al. 2015). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa kasein dan whey susu kuda memiliki aktivitas total radical scavenging yang setara dengan 22.80±0.56 dan 29.82±3.16 ppm asam askorbat, pada konsentrasi protein 46.79 dan 52.79 mg mL
-1
(Gambar 11A). Hal ini mengindikasikan peran komponen susu kuda sebagai pendonor elektron kepada molekul radikal DPPH∙.
Selain aktivitas DPPH∙ radical scavenging, aktivitas reducing power juga dimiliki oleh kasein dan whey susu kuda (Gambar 11B). Kapasitas total reducing power kasein (3.3±1.23) lebih kecil bila dibandingkan dengan whey -nya (28.68±1.25) (Gambar 11B). Aktivitas whey-nya hampir setara dengan aktivitas
standar asam askorbat 100 M (~17.61 ppm). Standar ini merepresentatifkan nilai
20% angka kecukupan gizi (AKG) vitamin C dalam 1 liter. Hal ini menunjukkan bahwa whey susu kuda cukup kaya akan komponen antioksidan (terutama hidrofilik) sebagai pendonor elektron atau atom H untuk mereduksi ion-ion logam transisi seperti Fe3+. Ion-ion logam transisi berperan penting dalam pembentukan radikal hidroksil yang sangat reaktif (Elias et al. 2008). Oleh sebab itu, kemampuan reducing power merupakan indikator penting kapasitas antioksidan untuk mencegah propagasi reaksi berantai radikal (Sarmadi dan Ismail 2010).
Suatu protein dapat bertindak sebagai antioksidan karena struktur terluarnya yang disusun oleh beberapa asam-asam amino hidrofilik yang rentan terhadap oksidasi. Akan tetapi aktivitasnya dibatasi oleh aksesibilitas radikal yang merupakan fungsi dari jarak, hidrofobisitas, dan struktur protein (Elias et al. 2008).
Proses hidrolisis dapat mengatasi hal tersebut dengan ‗membuka‘ struktur protein,
memaparkan bagian dalam protein (yang bersifat lebih hidrofobik) terhadap radikal, dan membebaskan peptida-peptida baru dengan sekuen yang spesifik. Hal ini sangat ditentukan oleh kondisi hidrolisis antara lain: kerentanan protein, efektivitas dan selektivitas enzim, dan faktor lingkungan (pH, suhu).
Gambar 12A dan B menunjukkan pengaruh hidrolisis kasein dan whey susu kuda oleh bromelain dan protease F11.4 terhadap aktivitas antioksidan. Peningkatan aktivitas antioksidan tertinggi dan signifikan (P < 0.05) ditemukan pada hidrolisat kasein (Gambar 12A dan B). Enzim bromelin dan F11.4 dapat menghasilkan peptida antiradikal dari kasein susu kuda secara signifikan pada menit ke-60 (CB) dan 90 (CF), dengan aktivitas setara dengan 124.21±7.36 (CB) dan 149.58±20.93 (CF) ppm asam askorbat per 25 mg protein terlarut (Gambar 12A) (Lampiran 11 dan 12). Pada menit yang sama (90), kedua jenis enzim juga menghasilkan peptida-peptida hidrolisat kasein dengan reducing power spesifik tertinggi sebesar 113.32±14.14 (protease F11.4) dan 71.13±0.37 (bromelin) per 10 mg protein terlarut (Gambar 12B) (Lampiran 13). Nilai ini lebih tinggi 3–4 kali
29
Gambar 11 Aktivitas antioksidan DPPH∙ radical scavenging (A) dan Fe reducing power (B) dari kasein dan whey susu kuda.
Hasil SDS-PAGE mengindikasikan bahwa peningkatan aktivitas DPPH∙ radical scavenging dan Fe reducing power disebabkan oleh terlepasnya peptida-peptida kecil dengan BM rendah. Peptida-peptida-peptida tersebut dapat berasal dari
kasein tipe αs, , dan , walaupun pada hidrolisat kasein-F11.4 mungkin lebih
spesifik berasal dari tipe . Peptida-peptida tersebut diduga mengandung asam-asam amino reaktif (labil oksidatif) seperti asam-asam-asam-asam amino bersulfur (Cys, Met), aromatik (Trp, Tyr, Phe), dan mengandung gugus imidazol (His). Asam-asam amino tersebut dikenal mudah mendonasikan elektron dan atom H nya (Elias et al. 2008; Samarayanaka dan Li-Chan 2011). Sementara itu, aktivitas antioksidan whey susu kuda mungkin lebih disebabkan oleh komposisi alamiahnya.
Gambar 12 Pengaruh hidrolisis terhadap aktivitas spesifik DPPH∙ radical scavenging (A) dan Fe reducing power (B) dari kasein dan whey susu kuda. Keterangan: CB, kasein + bromelin; CF, kasein + protease F11.4; WB, whey + bromelin; dan WF, whey + protease F11.4.
Aktivitas Penghambatan ACE oleh Susu Kuda dan Hidrolisatnya Selain memiliki aktivitas antioksidan, kasein dan whey susu kuda juga mampu menghambat ACE dengan aktivitas total yang relatif tinggi, yaitu 93.66±4.97 (kasein) dan 81.07±2.62%, pada kadar protein berturut-turut 0.94 dan 1.06 mg (Gambar 13) dan sedikit lebih tinggi dari hidrolisat kasein Yak (Bos grunniens) (79.05±0.051%) beserta fraksi berbobot rendahnya (< 6 kDa) (85.4±1.37%) (Mao et al. 2007). Aktivitas ini diduga berasal dari peptida-peptida indigenus ber BM rendah yang mungkin banyak terdapat pada fraksi kasein susu kuda. Hal ini didukung fakta bahwa kebanyakan peptida-peptida dengan aktivitas penghambatan ACE yang tinggi merupakan peptida berantai pendek (3-13 asam amino) dengan BM rendah (< 3 kDa) (Erdmann et al. 2008; Korhonen dan Pihlanto 2006). Walaupun belum diketahui secara pasti, peptida-peptida tersebut
31 mungkin dihasilkan oleh aktivitas protease indigenus, seperti plasmin, seperti yang telah dibahas sebelumnya.
Gambar 14 menunjukkan adanya peningkatan signifikan aktivitas spesifik pada hidrolisat kasein, seiring bertambahnya waktu hidrolisis. aktivitas spesifik penghambatan ACE tertinggi dicapai oleh kedua enzim setelah 90 menit inkubasi, dengan nilai aktivitas 84.75±0.71% (CB) dan 7λ.16±1.51% (CF) per 50 g protein
terlarut (Lampiran 14). Aktivitas tersebut sedikit lebih rendah dari Captopril 1 mg mL-1 (97.38%) dan fraksi III (< 3 kDa) Koumiss (55.29±3.76% pada konsentrasi peptida 0.245±0.003 mg mL-1), tetapi masih lebih tinggi dari fraksi I (> 10 kDa) nya (30.59±1.13% pada konsentrasi peptida 0.539±0.013 mg mL-1) (Chen et al. 2010). Di sisi lain, hidrolisat whey-nya hampir tidak menunjukkan peningkatan aktivitas (Gambar 14).
Gambar 13 Aktivitas penghambatan ACE dari kasein dan whey susu kuda. Beberapa peptida inhibitor ACE asal susu dengan aktivitas sedang dan tinggi telah terbukti tidak hanya mampu menghambat ACE secara in vitro, tetapi juga menurunkan tekanan darah secara in vivo dan uji klinis (Korhonen dan Pihlanto 2006; Hernandez-Ledesma et al. 2011; Nongonierma dan FitzGerald 2015). Peptida-peptida potensial tersebut secara umum memiliki ciri-ciri: berantai pendek (3-13 asam amino), BM kecil (< 3 kDa), memiliki asam amino hidrofobik (Pro, Lys, Arg) pada ujung karboksil (C) nya (Erdmann et al. 2008). Selain itu, peptida-peptida tersebut mungkin memiliki proporsi asam amino hidrofobik yang tinggi, seperti yang telah dilaporkan oleh Chen et al. (2010). Berdasarkan data SDS-PAGE, peningkatan aktivitas penghambatan ACE dari hidrolisat kasein mungkin disebabkan oleh terlepasnya peptida-peptida inhibitor ACE berukuran
kecil dari αs, , atau -kasein dengan karakter yang telah dijelaskan di atas. Asam-asam amino hidrofobik, khususnya yang terletak pada ujung C sekuen tripeptida dilaporkan memiliki afinitas yang kuat terhadap sisi katalitik ACE (Wilson et al. 2011).
Agar dapat memberikan efek fungsional secara in vivo, peptida-peptida bioaktif harus memiliki bioavailabilitas yang tinggi. Peptida-peptida tersebut harus dapat bertahan dari serangan enzim-enzim gastrointestinal dan mudah
diserap, sehingga dapat berinteraksi secara spesifik dengan enzim ACE di endotelial vaskular ataupun radikal-radikal. Beberapa penelitian telah membuktikan bahwa peptida bioaktif dapat bertahan dari aktivitas proteolitik enzim-enzim protease gastrointestinal dan ditemukan di dalam plasma darah. Peptida-peptida inhibitor ACE di- atau tri- seperti Leu-Trp, Phe-Tyr, Tyr, Ile-Trp, Ala-Ile-Trp, Val-Tyr, Leu-Pro-Pro and Ile-Pro-Pro berhasil dideteksi pada sistem pembuluh darah pasca mengkonsumsi yogurt (Foltz et al. 2007). Ukuran dan BM nya yang kecil berperan membentuk sifat resistensi pada peptida-peptida tersebut (Nongonierma dan FitzGerald 2015). Selain ditentukan oleh ukurannya, bioavailabilitas peptida juga ditentukan oleh sekuen asam amino. Peptida-peptida dengan sekuen asam amino Pro atau hidroksil-Pro pada ujung C karboksil cenderung bersifat resisten terhadap enzim-enzim gastrointestinal (Nongonierma dan FitzGerald 2015; Phelan et al. 2009).
Gambar 14 Pengaruh hidrolisis terhadap aktivitas spesifik penghambatan ACE dari kasein dan whey susu kuda. Keterangan: CB, kasein + bromelin; CF, kasein + protease F11.4; WB, whey + bromelin; dan WF, whey + protease F11.4.
Walaupun kebanyakan peptida-peptida bioaktif potensial yang dilaporkan merupakan peptida-peptida berukuran kecil. Peptida berukuran besar seperti kasein makro peptida (64 asam amino) ternyata juga dapat ditemukan pada plasma darah. Hal ini mengindikasikan pengaruh dari faktor lain, seperti sifat permeabilitas peptida (Nongonierma dan FitzGerald 2015). Peptida-peptida dapat diserap masuk dari sistem pencernaan kedalam sistem pembuluh darah melalui beberapa mekanisme, yaitu melalui jalur transpor terfasilitasi (protein transporter), paraseluler –yaitu difusi pasif melalui celah sempit antar sel, endositosis, atau sistem limfatik (Power 2013; Sarmadi dan Ismail 2010). Jalur yang ditempuh setiap peptida tidak selalu sama dan ditentukan oleh karakteristik fisik dan kimianya (Gambar 15). Karakter tersebut ditentukan oleh ukuran molekul (BM), sekuen asam amino, muatan, ikatan hidrogen, dan hidrofobisitas (Phelan et al. 2009; Power 2013; Sarmadi dan Ismail 2010). Peptida-peptida hidrolisat kasein susu kuda berukuran kecil (<4 kDa) seperti CF dan CB, yang diduga kaya akan
33 asam-asam amino hidrofobik khususnya Val, Ile, Leu, Pro, Tyr, dan Ala dapat diserap melalui protein transporter pada membran basolateral intestinal atau melalui difusi pasif (Sarmadi dan Ismail 2010) (Gambar 15). Di lain pihak, peptida Y (dari hidrolisat CB) yang berukuran besar (23–25 kDa) dapat masuk kedalam sirkulasi darah melalui difusi pasif pada celah antarsel (paraseluler) atau endositosis (Sarmadi dan Ismail 2010) (Gambar 15).
Gambar 15 Mekanisme absorbsi peptida bioaktif. Sumber: Wada dan Lönnerdal (2014).
Menurut Muchtadi (2012), pangan fungsional harus memiliki tiga fungsi dasar, yaitu (1) bersifat nutrisional atau bernilai gizi tinggi, (2) memiliki fungsi fisiologis, dan (3) memiliki aspek sensori yang dapat diterima (warna, penampilan, dan citarasa yang menarik). Pemanfaatan peptida-peptida bioaktif hidrolisat kasein susu kuda sebagai ingredien pangan fungsional sangat mungkin dilakukan. Melalui ketersediaan teknik-teknik pemurnian seperti membran ultrafiltrasi dan kromatografi, peptida-peptida tersebut dapat dimurnikan. Meski demikian, aspek biaya yang relatif mahal mungkin menjadi salah satu kendala yang harus diatasi. Selain itu, sifat interaksi peptida-peptida murni dengan komponen fungsional lainnya juga perlu dikaji dan dipertimbangkan. Di sisi lain, pemanfaatan ekstrak hidrolisat kasar kasein susu kuda sebagai ingredien pangan fungsional memang dinilai lebih ekonomis. Akan tetapi, pemanfaatannya harus mempertimbangkan aspek sensori dan efikasi sehingga diperlukan teknik formulasi atau studi lebih lanjut.
5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Profil SDS-PAGE protein susu kuda asal Indonesia menunjukkan kemiripan dengan profil protein susu kuda dari Eropa. Profil protein kasein dan whey susu kuda menunjukkan perbedaan yang jelas. Sebagian besar protein mayor susu kuda
terdeteksi pada penelitian ini, antara lainμ α-laktalbumin/α-Lac, lisozim,
-laktoglobulin/ -LG I, kasein (αs, , ), imunoglobulin rantai berat/IgHC, serum
albumin/SA, dan laktoferin. Selain itu, ditemukan dua protein minor yang belum teridentifikasi. Kedua protein minor tersebut diduga berasal dari aktivitas protease indigenus asal susu kuda Indonesia.
Susu kuda memiliki aktivitas antioksidan yang moderat, jika dibandingkan dengan standar asam askorbat 100 M. Ketika dihidrolisis, aktivitas spesifik
antioksidan kaseinnya meningkat. Peningkatan aktivitas DPPH∙ radical scavenging dan Fe reducing power tertinggi ditemukan pada hidrolisat kasein-bromelin dan F11.4. Pada 25 mg protein, aktivitas antiradikalnya setara dengan 120–150 ppm asam askorbat, sedangkan reducing power nya 3–4 kali lebih tinggi dari asam askorbat 100 M (~17.6 ppm). Susu kuda menunjukkan aktivitas
penghambatan ACE yang tinggi, hampir setara dengan 1 mg mL-1 Captopril. Jika dibandingkan dengan aktivitas whey-nya, kasein ialah bagian yang paling kaya dengan ACE inhibitor. Ketika dihidrolisis, terjadi peningkatan signifikan aktivitas