Kanker serviks merupakan salah satu jenis penyakit dengan angka kematian yang cukup tinggi bagi seluruh wanita di dunia. Menurut data yang disampaikan oleh Yohanes (2008) angka prevalensinya di dunia mencapai 99,7%.
Oleh karena itu penelitian terkait pengobatan kanker serviks terus saja dikembangkan. Salah satunya adalah melalui penelitian bahan alam. Hal ini didukung oleh adanya efek negatif yang ditimbulkan dari penggunaan agen kemoterapi. Sebagaimana disebutkan oleh Wahyuningsih dan Yustina (1999) kebanyakan agen kemoterapi mempunyai efek samping dan komplikasi pada jaringan yang masih sehat.
Salah satu jenis bahan alam yang mulai dikembangkan sebagai senyawa anti kanker adalah Pandanus conoideus Lam. varietas buah kuning. Menurut Pratiwi (2009) sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning yang diujikan secara in vitro pada sel kanker payudara T47D memberikan aktivitas sitotoksik dengan nilai LC50 sebesar 0,25 µl/ml. Selain itu, Wibowo et. al. (2007) dan Astirin (2008) juga menyampaikan bahwa P. conoideus Lam. varietas buah kuning diduga berperan dalam penghambatan pertumbuhan dan toksisitas terhadap sel kanker karena di dalamnya terkandung beberapa komponen diantaranya karoten, β-karoten, tokoferol, dan asam lemak yang memiliki potensi sitotoksis terhadap cell line T47D, MCF7, HT29, Raji, dan HeLa.
Hal tersebut di atas melatarbelakangi dilaksanakannya penelitian ini yang bertujuan untuk mengkaji efek sitotoksik serta profil kandungan kimia bagian P.
conoideus Lam. varietas buah kuning terhadap sel HeLa secara in vitro. Dalam penelitian ini dilakukan uji sitotoksisitas untuk mendapatkan nilai LC50 dari bagian hasil partisi serta uji waktu penggandaan (doubling time) untuk mengetahui aktivitas penghambatan terhadap pertumbuhan sel kanker.
A. Pemisahan Kandungan Senyawa Kimia
Langkah pertama yang dilakukan dalam penelitian ini adalah pemisahan kandungan kimia terhadap sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning yang akan digunakan sebagai bahan uji. Hal ini bertujuan untuk menyederhanakan kandungan senyawa kimia yang ada sehingga akan diperoleh dua bagian dengan aktivitas sitotoksik yang berbeda. Pemisahan dilakukan menggunakan corong pisah dengan melarutkan sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning ke dalam metanol, eter dan KOH 30% (dalam aquades).
Salah satu komponen yang terdapat dalam sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning adalah karotenoid. Karotenoid yang ada ini kemungkinan masih terikat dengan ester (misalnya karotenol ester) sehingga diperlukan tahap penyabunan untuk memisahkannya secara optimal. Dalam penelitian ini penyabunan dilakukan dengan memasukkan sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning ke dalam campuran metanol serta eter yang telah ditambah dengan KOH 30% (dilarutkan dalam aquades).
Setelah dilakukan proses pencampuran dan dilanjutkan dengan penggojogan dalam corong pisah, maka diperoleh dua lapisan. Lapisan atas berwarna kuning keruh sedangkan lapisan bawah berwarna kuning cerah, sebagaimana terlihat pada Gambar 5. Lapisan atas merupakan bagian yang larut dalam eter dan KOH 30% sehingga dimungkinkan mengandung lebih banyak karotenoid karena eter dan KOH 30% memiliki kemampuan untuk menarik karotenoid. Hal ini terlihat dari warna lapisan atas yang tampak lebih keruh. Hasil pemisahan kemudian diuapkan di atas penangas air dengan tujuan untuk mempurifikasi hasil pemisahan dari pelarut yang digunakan.
Gambar 5. Hasil pemisahan terbentuk dua lapisan dengan warna yang berbeda.
(a) bagian atas berwarna coklat kehitaman; (b) bagian bawah berwarna kuning cerah.
Hasil pemisahan yang telah dipurifikasi kemudian dimonitor pemisahannya menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis Preparatif. Fase diam yang digunakan adalah silika : alumina (3:2 b/b) sedangkan fase geraknya adalah wash benzena : eter (1:1 v/v). Modifikasi fase diam bertujuan untuk mengoptimalkan deteksi hasil pemisahan. Hal ini disebabkan karena plat alumina mampu menghasilkan jumlah spot yang lebih banyak daripada plat silika. Namun, plat alumina bersifat sangat rapuh karena tidak menggunakan binder (perekat),
a
b
sedangkan plat silika lebih rekat dan tidak mudah rapuh karena menggunakan binder sehingga dilakukan pencampuran keduanya.
Hasil pemisahan ini dideteksi di bawah sinar UV pada panjang gelombang 354 dan 366 nm serta menggunakan pereaksi semprot Serium (IV) Sulfat. Sinar UV digunakan untuk mendeteksi keberadaan ikatan rangkap terkonjugasi sedangkan Sr (IV) Sulfat untuk mendeteksi keberadaan senyawa organik dalam bagian hasil pemisahan. Hasil deteksi UV terlihat pada Gambar 6. Sedangkan hasil deteksi menggunakan pereaksi semprot Se (IV) Sulfat ditunjukkan pada Gambar 7.
a b
Gambar 6. Hasil deteksi bagian P. conoideus Lam. varietas buah kuning di bawah sinar UV: 254 nm (a), 366 nm (b). Keduanya menunjukkan hasil negatif (tidak muncul peredaman).
Deteksi UV 254 dan 366 nm memberikan reaksi negatif yang ditunjukkan dengan tidak adanya peredaman. Hal ini terjadi karena bagian hasil pemisahan tidak mengandung senyawa yang memiliki ikatan rangkap terkonjugasi.
Sedangkan hasil deteksi dengan pereaksi semprot Se (IV) Sulfat menunjukkan terbentuknya dua spot yang berbeda. Ini menunjukkan bahwa senyawa organik
Bagian atas
Bagian bawah
Bagian atas
Bagian bawah
yang terkandung dalam sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning telah mengalami pemisahan sehingga memunculkan dua bagian yang masing-masing menunjukkan bercak dengan profil yang berbeda. Bagian bawah memberikan nilai Rf sebesar 0,05 sedangkan bagian atas memberikan nilai Rf 1 sebesar 0,03, Rf 2
sebesar 0,24 dan Rf 3 sebesar 0,97.
a b
Gambar 7. Hasil deteksi bagian P. conoideus Lam. varietas buah kuning dengan pereaksi semprot Sr (IV) Sulfat menunjukkan bercak yang berbeda: bagian bawah (a), bagian atas (b). Fase diam : silika alumina (3:2 b/b), Fase gerak : wash benzena dan eter (1:1 v/v).
B. Uji Sitotoksisitas
Setelah diperoleh dua bagian uji hasil pemisahan, yaitu bagian atas dan bawah kemudian dilanjutkan dengan uji sitotoksisitas. Langkah ini bertujuan untuk mengetahui efek sitotoksik dari masing-masing bagian hasil pemisahan terhadap kultur sel HeLa sehingga dapat ditentukan besarnya nilai LC50 dari tiap bagian untuk selanjutnya dijadikan sebagai dasar untuk menentukan bagian teraktif.
Rf
0,05
Rf
0,97
0,24 0,03
Tahap uji sitotoksisitas dan doubling time dilaksanakan dengan menggunakan metode direct counting. Untuk mengetahui jumlah sel digunakan hemasitometer sebagai media hitung dan tryphan blue sebagai counterstain.
Metode ini dipilih karena senyawa uji yang digunakan merupakan senyawa berwarna. Pada beberapa kasus ditemukan bahwa senyawa berwarna akan menimbulkan bias jika menggunakan metode ELISA reader dengan prinsip kerja menggunakan absorbansi. Theiszova et al. (2005) juga menyebutkan bahwa metode direct counting memiliki sensitivitas yang lebih tinggi terhadap penghambatan pertumbuhan sel fibroblast NIH-3T3 dibandingkan dengan pengukuran yang dilakukan menggunakan metode MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Metode MTT merupakan salah satu metode uji sitotoksik yang prinsipnya didasarkan pada kemampuan sel hidup untuk mereduksi garam MTT menjadi kristal formazan.
Menurut Rode et al. (2004) apabila menggunakan metode direct counting sel yang mati akan terpulas biru karena tryphan blue berikatan dengan protein intraseluler pada sel yang rusak akibat permeabilitas membran selnya terganggu (Rode et al., 2004), sedangkan sel hidup masih memiliki membran sel yang utuh sehingga tryphan blue tidak dapat masuk ke dalam sel dan sel tampak transparan.
Menurut Syaifuddin (2007) kultur sel HeLa sering digunakan sebagai model dalam penelitian karena tumbuh lebih cepat sehingga mampu memproduksi lebih banyak sel dalam satu flask dan merupakan sel manusia yang umum digunakan untuk kepentingan kultur sel. Kultur sel HeLa memiliki sifat semi melekat. Hal ini disebabkan karena sel kultur melepas suatu protein matriks
ekstraseluler sehingga menyebabkan sel–sel tersebut menempel satu sama lain dan menempel pada dasar microplate. Oleh karena itu diperlukan penambahan Tripsin untuk melepas sel-sel tersebut dari dasar microplate. Menurut Freshney (2000) Tripsin merupakan protease yang akan mendigesti ekstraselular matriks tersebut sehingga sel dapat terpisah satu sama lain dari dasar microplate. Sel–sel yang telah terlepas dari dasar microplate akan tampak berbentuk bulat–bulat, seperti terlihat pada Gambar 8.
a b
Gambar 8. Sel HeLa sebelum ditambahkan tripsin (a), sel HeLa setelah penambahan tripsin (b). Keterangan: 1a. sel hidup (berbentuk lonjong seperti daun), 2a. sel mati (berbentuk bulat), 1b. Sel hidup (tampak bercahaya), 2b. Sel mati (berbentuk bulat tidak bercahaya)
Uji sitotoksisitas diawali dengan menumbuhkan sel HeLa hingga konfluen pada medium RPMI 1640-serum. Menurut Freshney (2000) dalam medium ini terkandung nutrisi yang cukup untuk pertumbuhan, yaitu asam amino, vitamin, garam-garam anorganik, dan glukosa. Serum yang ditambahkan mengandung hormon-hormon yang mampu memacu pertumbuhan sel. Albumin berfungsi sebagai protein transport, lipid diperlukan untuk pertumbuhan sel, dan mineral berfungsi sebagai kofaktor enzim. Komposisi medium RPMI 1640 secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 1.
1a
2a
1b
2b
Setelah sel yang akan digunakan sebagai model uji jumlahnya cukup kemudian dilakukan pemanenan sel yang dilanjutkan dengan pencucian menggunakan PBS. Hal ini bertujuan untuk membersihkan serum yang terkandung dalam medium RPMI karena serum ini dapat menghambat kerja tripsin. Selanjutnya dilakukan penambahan tripsin untuk melepas sel dari dasar tabung dan dilanjutkan dengan penambahan medium RPMI sehingga diperoleh suspensi sel yang dapat langsung dipindahkan ke dalam microplate.
Setelah sel dalam microplate siap kemudian dilakukan penambahan bagian uji hasil pemisahan dengan konsentrasi yang berbeda. Variasi konsentrasi yang digunakan adalah 10 µl/ml; 5 µl/ml; 2,5 µl/ml; 1,25 µl/ml; 0,625 µl/ml; 0,3125 µl/ml; 0,15625 µl/ml, 0,078125 µl/ml; 0,0390625 µl/ml; 0,01953125 µl/ml;
0,009765625 µl/ml; 0,0048828125 µl/ml; 0,00244140625 µl/ml; 0,001220703125 µl/ml dan 0,0006103515625 µl/ml. Selain itu dibuat pula kontrol negatif berupa kultur sel dalam medium RPMI 1640.
Setelah inkubasi 24 jam dan diamati di bawah mikroskop maka terlihat adanya perubahan dari morfologi sel. Morfologi sel kontrol dan setelah perlakuan dapat dilihat pada Gambar 9. Sedangkan gambar lengkap untuk morfologi sel tiap-tiap perlakuan dapat dilihat pada Lampiran 6. Pengamatan mikroskopis menunjukkan adanya perbedaan morfologi pada sel HeLa kontrol dan perlakuan (Gambar 9). Sel kontrol tampak berbentuk seperti daun, menempel di dasar sumuran, sedangkan sel dengan perlakuan konsentrasi 2,5 µl/ml untuk bagian bawah dan 0,15625 µl/ml untuk bagian atas tampak banyak yang mati. Sel yang mati tampak berubah bentuknya, keruh dan mengapung.
Dari pengamatan terlihat bahwa penambahan konsentrasi bagian uji menyebabkan terjadinya peningkatan jumlah kematian sel. Jumlah sel hidup yang ada pada kontrol jauh lebih banyak jika dibandingkan dengan jumlah sel hidup yang ada pada sumuran dengan penambahan konsentrasi bagian uji. Data hasil penghitungan direct counting jumlah sel yang hidup maupun yang mati disajikan pada Lampiran 2.
a b c
Gambar 9. Kenampakan morfologi sel HeLa pada perbesaran 100x setelah penambahan bagian P. conoideus Lam. varietas buah kuning pada perlakuan (a) kontrol, (b) LC50 bagian atas (konsentrasi 0,15625 µl/ml), (c) LC50 bagian bawah (konsentrasi 2,5 µl/ml).
Keterangan: : sel hidup, : sel mati.
Selanjutnya ditentukan persentase kematian sel dan dihitung nilai rata-ratanya untuk menentukan nilai LC50 dari masing-masing bagian yang diujikan.
LC50 merupakan konsentrasi yang menyebabkan kematian sel sebesar 50% dari populasi sel. Berdasarkan hasil analisa probit maupun direct counting yang dilakukan didapatkan nilai LC50 sebesar 0,15625 µl/ml untuk bagian atas dan 2,5 µl/ml untuk bagian bawah.
Perhitungan probit secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 3. Hasil analisa probit ini diperoleh dengan mengubah persentase kematian menjadi angka probit dengan menggunakan tabel probit (Lampiran 3), kemudian dibuat grafik
persamaan regresi linier probit dan log konsentrasi. Menurut Ueda et al. (2002) ekstrak tanaman yang memiliki LC50 < 100 g/ml berpotensi untuk dikembangkan sebagai agen anti kanker. Dari hasil perhitungan LC50 ini terlihat bahwa bagian atas merupakan bagian yang lebih aktif karena menunjukkan nilai LC50 yang lebih kecil. Hubungan tingkat kematian sel dengan konsentrasi bagian P. conoideus Lam. varietas buah kuning dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Rata-rata persentase kematian sel HeLa setelah perlakuan dengan bagian P. conoideus Lam. varietas buah kuning.
10. 0,01953125 33,90%±0,57 17,51%±0,73
11. 0,009765625 29,67%±0,28 13,11%±0,00
12. 0,0048828125 23,65% ± 0,64 7,52%±0,83
13. 0,00244140625 21,24%±0,83 3,82%±0,89
14. 0,001220703125 21,50%±0,79 3,66%±0,89 15. 0,0006103515625 18,41%±0,86 3,55%±0,86
Dari Tabel 1 terlihat bahwa kenaikan persentase kematian sel HeLa sebanding dengan kenaikan konsentrasi bagian P. conoideus Lam. varietas buah
kuning yang diberikan, peningkatan konsentrasi secara linier juga menyebabkan meningkatnya persentase kematian. Apabila disajikan dalam grafik (Lampiran 3), maka akan diperoleh nilai R2 yang mendekati satu dan menunjukkan kedekatan hubungan antara konsentrasi sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning yang digunakan dengan persentase kematian sel, kematian sel benar-benar disebabkan oleh adanya perlakuan sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning.
Menurut Budi dan Paimin (2005) sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning mengandung senyawa yang diduga memiliki efek sitotoksik pada sel kanker, yaitu karoten, betakaroten, dan α-tokoferol. Ketiga senyawa ini bersifat sebagai antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas. Antioksidan melawan radikal bebas dengan cara memberikan satu elektron untuk menutupi satu elektron yang dibutuhkan radikal bebas.
Hasil penelitian yang dilakukan oleh Pratiwi (2009) menyatakan bahwa ketiga senyawa tersebut berinteraksi dengan sel kanker dimulai dari membran sel.
Karoten, α-tokoferol, dan betakaroten merupakan senyawa yang larut dalam lemak sehingga dapat berdifusi melalui membran sel, kemudian masuk ke dalam sitoplasma. Alfa tokoferol di dalam membran sel maupun membran mitokondria akan menghambat aktivitas Na dan K ATPase sehingga α-tokoferol dapat mengganggu aktivitas pertukaran ion melalui Na dan K channel. Alfa tokoferol juga telah terbukti menghambat aktivitas beberapa enzim oksidasi, diantaranya adalah enzim-enzim yang terlibat dalam proses glikolisis dan fosforilasi oksidatif ADP menjadi ATP, sehingga akan menurunkan produksi ATP dalam sel.
Penurunan produksi ATP akan berpengaruh terhadap penurunan aktivitas sel untuk melakukan pembelahan (Kawai et al., 1974).
Penelitian Prasad et al. (1999) juga menyebutkan bahwa α-tokoferol terbukti menghambat protein kinase C, meningkatkan sintesis dan transformasi growth factor B yang merupakan salah satu sinyal penghambat pertumbuhan termasuk di dalamnya pembelahan sel. Bagian P. conoideus Lam. varietas buah kuning yang mengandung α-tokoferol diduga dapat menghambat proliferasi sel HeLa. Hasil uji sitotoksisitas yang menunjukkan bahwa bagian atas P. conoideus Lam. varietas buah kuning merupakan bagian teraktif dengan nilai LC50 sebesar 0,15625 µl/ml selanjutnya digunakan untuk menentukan dosis yang akan digunakan untuk uji doubling time, yaitu dipilih 4 dosis di bawah LC50 bagian teraktif.
C. Uji Doubling Time
Uji doubling time dilakukan untuk mengetahui efek penghambatan proliferasi sel HeLa oleh bagian teraktif P. conoideus Lam. varietas buah kuning.
Moeljoprawiro et al. (2007) menyebutkan bahwa kemampuan proliferasi sel dapat diartikan sebagai kemampuan sel untuk tumbuh membelah dan berkembang.
Apabila proliferasi sel kanker dihambat melalui mekanisme cell cycle arrest maka sel akan berhenti membelah, sehingga pengaruh hambatan ini berupa kematian sel.
Proses kematian sel yang terjadi dapat melalui dua proses yaitu apoptosis dan nekrosis. Apoptosis adalah kematian sel per sel, sedangkan nekrosis
melibatkan sekelompok sel. Membran sel yang mengalami apoptosis akan mengalami penonjolan-penonjolan ke luar tanpa disertai hilangnya integritas membran. Sel yang mengalami nekrosis mengalami kehilangan integritas membran. Sel yang mengalami apoptosis terlihat menciut, dan akan membentuk badan apoptosis. Sel yang mengalami nekrosis akan terlihat membengkak untuk kemudian mengalami lisis. Sel yang mengalami apoptosis lisosomnya utuh, sedangkan sel yang mengalami nekrosis terjadi kebocoran lisosom (Iswanto et al., 2002).
Uji doubling time ini dilakukan dengan menghitung jumlah sel yang hidup dan mati oleh masing-masing bagian teraktif P. conoideus Lam. varietas buah kuning setiap satuan waktu. Doubling time sendiri merupakan waktu yang diperlukan oleh sel untuk menggandakan dirinya menjadi dua kali jumlah semula.
Senyawa yang mampu memperpanjang waktu doubling time menunjukkan kemampuan senyawa tersebut untuk menghambat proliferasi sel kanker melalui mekanisme cell cycle arrest (Meiyanto et al., 2007).
Doubling time dilakukan dengan menstarvasi sel dalam media RPMI 1640 yang ditambah FBS (Fetal Buffer Serum). Hal ini dimaksudkan agar sel–sel yang akan diberi perlakuan berada dalam kondisi yang sama. Starvasi dilakukan selama semalam (over night) dalam inkubator CO. Setelah starvasi, sel–sel yang telah diberi perlakuan diinkubasi selama 24, 48, dan 72 jam, kemudian jumlah sel hidup dan sel mati dihitung dengan bantuan haemositometer dan tryphan blue sebagai counterstain.
Dosis yang digunakan dalam uji doubling time adalah 4 dosis di bawah LC50. Hal ini dikarenakan uji doubling time dilakukan sampai jam ke-72 sehingga diperlukan dosis yang relatif tidak mematikan sel. Selain itu juga untuk memastikan bahwa apabila terjadi kematian sel adalah benar-benar karena bagian teraktif bersifat toksik terhadap sel, bukan karena konsentrasi yang terlalu besar sehingga dapat mengganggu kesetimbangan media. Hasil perhitungan jumlah sel setelah inkubasi ditampilkan pada Gambar 10.
Dari Gambar 10 terlihat bahwa jumlah sel HeLa setelah diinkubasi akan mengalami perubahan. Peningkatan jumlah sel terbesar terlihat pada kontrol sedangkan pada perlakuan bagian teraktif P. conoideus Lam. varietas buah kuning, peningkatan jumlah sel berbanding terbalik dengan besarnya konsentrasi yang diberikan. Semakin besar konsentrasi bagian uji maka peningkatan jumlah sel akan lebih kecil. konsentrasi 0,078125 µl/ml; 0,0309625 µl/ml; 0,01953125; dan 0,0097656 µl/ml yang dilakukan perhitungan pada waktu inkubasi 0, 24, 48, dan 72 jam.
Menurut Astirin, et. al (2009) nilai uji doubling time dapat ditentukan melalui persamaan regresi linier antara log jumlah sel dengan waktu inkubasi sehingga diperoleh nilai slope yang merupakan parameter kinetika proliferasi (Tabel 2). Semakin tinggi nilai slope maka semakin cepat waktu doubling time yang diperlukan. Kontrol dengan nilai slope tertinggi 0,0129 memiliki waktu doubling time tercepat yaitu 23,23 jam, sedangkan konsentrasi 0,078125 µl/ml memiliki nilai slope terendah senilai 0,01 dengan waktu doubling time paling
Hasil uji doubling time menunjukkan bahwa bagian teraktif P. conoideus Lam. varietas buah kuning pada konsentrasi 0,078125 µl/ml membuat waktu penggandaan sel menjadi 1,42 kali dibandingkan dengan kontrol, sedangkan pada konsentrasi 0,0309625 µl/ml waktu penggandaan sel menjadi 1,28 kali dari kontrol. Pada konsentrasi 0,01953125 µl/ml waktu penggandaan sel menjadi 1,15 kali dari kontrol dan pada konsentrasi 0,0097656 µl/ml membuat waktu penggandaan sel lebih lama 1,06 kali dibandingkan dengan sel kontrol. Hal ini menunjukkan bahwa nilai doubling time berbanding lurus dengan besarnya variasi konsentrasi yang diberikan. Semakin besar konsentrasi bagian teraktif maka
semakin besar pula waktu yang diperlukan oleh sel untuk menggandakan jumlahnya.
Hasil uji doubling time menunjukkan bahwa kandungan senyawa yang terdapat pada bagian teraktif P. conoideus Lam. varietas buah kuning dalam hal ini α-tokoferol, karoten, dan betakaroten dapat menyebabkan cell cycle arrest, sehingga dapat menghambat proliferasi sel kanker. Hal ini sesuai dengan penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Astirin, et. al (2009) yang menunjukkan bahwa nilai LC50 dari sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning yang diujikan pada sel kanker payudara T47D berpotensi untuk dikembangkan sebagai anti kanker.
Mekanisme yang terjadi dalam penghambatan doubling time ini dapat dijelaskan melalui sinyal tranduksi dalam cell cycle arrest yang diduga dimulai dari penghambatan kerja enzim oksidasi yang berperan dalam produksi ATP oleh α-tokoferol, sehingga energi yang digunakan untuk pembelahan sel kurang tersedia (Kawai et al., 1974), selain itu juga dikarenakan adanya penghambatan protein kinase C (Prasad et al., 1999). Protein kinase C berfungsi dalam fosforilasi pRb, dimana pRb akan menjadi hipoposforilasi sehingga akan mengikat E2F dan menghambat aktivitas dari E2F yang merupakan faktor transkripsi. Penghambatan E2F ini akan menyebabkan cell cycle arrest (Guasconi et al. cit Pratiwi, 2009).
Pada saat siklus sel terhenti inilah dimungkinkan adanya kesempatan sel kanker untuk melakukan DNA repair. Penghambatan aktivitas dari E2F ini kemungkinan dapat mengatur ekspresi gen p53 tipe wild sebagai salah satu tumor suppressor gen pada fase G1/S dan menginduksi apoptosis (Pacifico and Leone,
2007). Sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Carlisle et al. (2000) dimana tokoferol terbukti mampu menginduksi apoptosis dan meningkatkan ekspresi gen p53 tipe wild pada kanker paru-paru (HLF cell).
Sebagai antioksidan di dalam sel kanker, kemungkinan aktivitas α-tokoferol akan menurunkan konsentrasi ROS penyebab kerusakan oksidatif sehingga akan dapat meningkatkan kemampuan sel untuk melakukan DNA repair. Konsentrasi ROS di dalam sel yang menurun dapat memaicu keluarnya sitokrom C dari mitokondria, sitokrom C dapat memacu aktivitas gen-gen pengatur apoptosis. Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Salganik (2001).
Menurut Bohm et. al (1997) interaksi antara α-tokoferol dan betakaroten bersifat sinergis. α-tokoferol yang telah mendonorkan elektronnya pada senyawa radikal bebas akan berubah menjadi α-tokoferoksil radikal yang tidak reaktif apabila dibandingkan dengan ROS. Alfa tokoferoksil radikal ini kemudian akan menerima elektron dari betakaroten sehingga menjadi α-tokoferol kembali, selanjutnya betakaroten radikal akan dihilangkan oleh adanya aktivitas anti oksidan endogen seperti superoxside dismutase dan gluthation peroksidase dari sel.
D. Penentuan Golongan Senyawa Kimia
Penentuan golongan senyawa kimia dilakukan pada bagian teraktif P.
conoideus Lam. varietas buah kuning terhadap sel HeLa dengan menggunakan beberapa pereaksi semprot kimia spesifik. Deteksi golongan senyawa kimia
dilakukan dengan mengelusi bagian teraktif menggunakan silika alumina (3:2 b/b) sebagai fase diam dan wash benzena : eter ( 1:1 ) sebagai fase gerak serta pereaksi semprot besi (III) klorida untuk deteksi keberadaan senyawa fenolik, pereaksi semprot Dragendorf untuk deteksi senyawa alkaloid, pereaksi semprot Vanilin-H2SO4 pekat untuk deteksi terpenoid dan pereaksi semprot Lieberman Burchard untuk deteksi senyawa steroid.
a b c d
Gambar 11. Profil kromatografi preparatif bagian teraktif P. conoideus Lam. varietas buah kuning hasil deteksi dengan pereaksi semprot spesifik : (a) Dragendorf; (b) Lieberman Burchard;
(c) vanilin-H2SO4 dan (d) FeCl3.
Fase diam : silika alumina (3 : 2 b/b)
Fase gerak : wash benzena dan eter (1:1 v/v).
Hasil dari deteksi golongan senyawa kimia dapat dilihat pada Gambar 11.
Reaksi positif ditunjukkan oleh pereaksi Lieberman Burchard yang memberikan warna hijau kebiruan dan pereaksi vanilin-H2SO4 yang memberikan warna coklat.
Sedangkan reaksi negatif ditunjukkan oleh pereaksi Dragendorf yang seharusnya menunjukkan bercak berwarna orange serta pereaksi FeCl3 yang seharusnya menunjukkan warna merah. Hasil deteksi menunjukkan bahwa bagian teraktif P.
conoideus Lam. varietas buah kuning mengandung senyawa kimia yang masuk ke
conoideus Lam. varietas buah kuning mengandung senyawa kimia yang masuk ke