A. Waktu dan Tempat penelitian
Penelitian dilakukan mulai bulan Juni-Agustus 2009 di Laboratorium Pusat MIPA Universitas Sebelas Maret dan Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) Universitas Gadjah Mada.
B. Alat dan Bahan 1. Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Laminer air flow cabinet, timbangan digital, inkubator CO2, refrigerator, mikroskop cahaya, mikroskop inverted, mikroplate 96 sumuran, mikroplate 24 sumuran, kamera digital, pipet mikro, sentrifuse, pipet pastur, hemasitometer, tissue culture flask 40 ml, vortex, alat gelas, filtermikro (milipore 0,22 µm), conical tube, deck glass, obyek glass yang dilapisi poly L-lysine, coverslip plastik Ф 12 mm, tabung eppendorf, bunzen buchner, corong pisah, pipa kapiler, chamber, pipet tetes, penyemprot dan oven.
2. Bahan
a. Bahan Utama
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian adalah sari Pandanus conoideus Lam. varietas buah kuning yang diperoleh dari I Made Budi, peneliti bahan alam dari Jurusan Biologi FMIPA Universitas Cendrawasih (UNCEN) Papua.
b. Bahan untuk Pemisahan Kandungan Senyawa Kimia
Bahan yang digunakan untuk pemisahan kandungan senyawa kimia adalah MeOH 100% (Brataco), eter (Brataco) dan KOH 30%
(Brataco) (dalam aquades).
c. Bahan untuk Penentuan Golongan Senyawa Kimia
Bahan yang digunakan untuk penentuan golongan senyawa kimia adalah SiOH, alumina, wash benzena, eter, pereaksi semprot FeCl3, pereaksi semprot Lieberman Burchard, pereaksi semprot dragendorf, dan pereaksi semprot vanilin-H2SO4 pekat.
d. Bahan untuk uji Sitotoksisitas
Bahan yang digunakan untuk uji sitotoksisitas adalah bagian P.
conoideus Lam. varietas buah kuning hasil pemisahan, kultur sel HeLa, Media RPMI 1640, Aquades, alkohol 70% HCl, NaOH, Phosphate Buffer Saline (PBS), Fetal Bovine Serum (FBS), Penicillin / Streptomycin, Fungizon, Hepes, Natrium bicarbonate, Tryphan blue, dan Tripsin.
C. Cara Kerja 1. Pemisahan Kandungan Senyawa Kimia
Sari buah kuning dipartisi menjadi dua bagian. Pelarut yang digunakan adalah MeOH : eter : KOH 30% (dalam aquades) dengan perbandingan 1:1:1. Setelah diperoleh dua bagian, profil kandungan senyawa kimia dimonitor menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis Preparatif dengan fase diam silika : alumina (3:2 b/b) dan fase gerak wash benzena : eter (1:1 v/v). Hasil pemisahan kemudian dideteksi di bawah UV 254 dan 366 serta pereaksi semprot Serium (IV) Sulfat (Sr IV SO4).
2. Uji Sitotoksisitas
Sel HeLa diambil dari tangki nitrogen cair, segera dicairkan dalam penangas air pada suhu 37°C, kemudian ampul disemprot dengan etanol 70 %.
Selanjutnya sel dipindahkan ke dalam tabung conical steril berisi media RPMI.
Suspensi sel kemudian disentrifugasi 325 g selama ± 5 menit. Supernatan dibuang sedangkan endapan ditambah 1 mL medium penumbuh yang mengandung 20 % PBS dan diresuspensi perlahan hingga homogen, kemudian sel ditumbuhkan pada tissue culture flask kecil dan diinkubasi pada inkubator CO2 suhu 37°C dengan aliran 5% CO2. Setelah 24 jam media diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian.
Setelah jumlah sel cukup, dilakukan pemanenan sel. Sel HeLa dicuci dengan PBS pH 7,2 sebanyak 5 mL. Selanjutnya sel yang melekat pada dinding tissue culture flask dilepas dengan tripsin. Sel dipindahkan ke dalam tabung konikal steril, diberi 10 mL media RPMI dan disentrifugasi 325 g
selama 5 menit. Dihitung jumlah selnya menggunakan hemasitometer tanpa penambahan tryphan blue. Suspensi sel ditambah 100 µl medium RPMI komplit (FBS, Pen-Strep, Fungizon ®) sehingga diperoleh konsentrasi sel 2 x 104 sel / 100 mL.
Suspensi sel yang telah disiapkan kemudian dimasukkan ke dalam mikrokultur 96 sumuran. Ditambahkan bagian buah kuning hasil partisi sebanyak 100 µl pada peringkat konsentrasi yang berbeda secara triplet.
Variasi konsentrasi yang digunakan adalah 10 µl/ml; 5 µl/ml; 2,5 µl/ml; 1,25 µl/ml; 0,625 µl/ml; 0,3125 µl/ml; 0,15625 µl/ml, 0,078125 µl/ml; 0,0390625 µl/ml; 0,01953125 µl/ml; 0,009765625 µl/ml; 0,0048828125 µl/ml;
0,00244140625 µl/ml; 0,001220703125 µl/ml dan 0,0006103515625 µl/ml.
Dengan menggunakan mikropipet masing-masing konsentrasi ekstrak sampel uji yang telah disiapkan dalam eppendorf steril dipindahkan ke sumuran.
Disiapkan pula kontrol negatif media RPMI 1640 dan kultur sel kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO2 37°C dengan kadar CO2 5%. Setelah 24 jam media RPMI 1640 dibuang dan diresuspensi dengan 100 µl tripsin-EDTA 0,25%, didiamkan hingga sel terlepas dari dasar sumuran
±3-5 menit. Selanjutnya pada setiap sumuran ditambahkan 100 µl trypan blue, kemudian diambil kira-kira 10 µl diletakkan pada hemasitometer dan dihitung jumlah sel mati maupun sel hidup di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 100 kali.
3. Uji Doubling Time (waktu penggandaan)
Uji doubling time dilakukan dengan menstarvasi sel selama 24 jam dalam media kultur yang mengandung FBS 5%, streptomisin 2%, penisilin 2%
dan fungizon 0,5% kemudian sel HeLa dengan kerapatan sekitar 2x104 sel/mL dimasukkan dalam microplate 96 sumuran sebanyak 100 µl. Selanjutnya sel diinkubasi dalam inkubator CO2 selama semalam. Setelah semalam media RPMI 1640 diganti baru dan ditambahkan larutan uji hasil pemisahan masing-masing sebanyak 100 µl dalam biakan sel kultur, dengan ulangan sebanyak 3 untuk tiap perlakuan. Konsentrasi larutan uji yang digunakan adalah 4 konsentrasi di bawah LC50 hasil uji sitotoksisitas. Pengambilan sampel dilakukan pada jam ke 0, 24, 48 dan 72. Selanjutnya media RPMI 1640 dibuang dan ditambahkan tripsin sebanyak 100 µl, diinkubasi 10 menit kemudian ditambahkan 100 µl tryphan blue. Suspensi sel dari masing-masing perlakuan diambil 10 µl untuk dihitung menggunakan hemasitometer. Hasil perhitungan kemudian ditampilkan dalam kurva jumlah sel dan waktu inkubasi.
4. Penentuan Golongan Senyawa Kimia
Penentuan golongan senyawa kimia dilakukan pada bagian yang menunjukkan nilai sitotoksisitas yang tinggi terhadap sel HeLa dengan menggunakan beberapa pereaksi semprot kimia spesifik. Deteksi golongan senyawa kimia dilakukan dengan mengelusi bagian hasil partisi menggunakan silika alumina (3:2 b/b) sebagai fase diam dan wash benzena : eter ( 1:1 v/v) sebagai fase gerak serta pereaksi semprot besi (III) klorida untuk deteksi
keberadaan senyawa fenolik, pereaksi semprot dragendorf untuk deteksi senyawa alkaloid, pereaksi semprot vanilin-H2SO4 pekat untuk deteksi terpenoid dan pereaksi semprot Lieberman Burchard untuk deteksi senyawa steroid.
D. Analisis Data 1. Uji Sitotoksisitas
Hasil pengamatan kematian sel uji ditampilkan dalam bentuk persentase kematian sel dengan rumus:
% kematian sel = 100% - % viabel sel
dimana, % viabel sel =
Signifikansi data dianalisis menggunakan analisis probit. Data ditampilkan dalam bentuk kurva hubungan konsentrasi senyawa uji dengan persentase kematian sel uji. Aktivitas sitotoksik dinyatakan dengan LC50 yang ditetapkan melalui hasil perhitungan direct counting.
2. Uji doubling time
Masing-masing sumuran dihitung jumlah sel hidup dengan hemasitometer lalu dibuat kurva antara jumlah sel dengan waktu inkubasi (Mursyidi, 1985). Perhitungan jumlah sel hidup dihitung dengan rumus sebagai berikut :
(Doyle and Griffith, 2000) x 100%
Jumlah sel hidup total sel
N =
Dimana,
N : Jumlah sel hidup
4 : Jumlah bilik hitung yang digunakan
A : Jumlah suspensi sel yang diambil (misal 10µl)
B : Pengenceran (misal 100 µl tripsin dan 100 µl tryphan blue)
Perbedaan waktu penggandaan sel dihitung dari slope pada kurva dari persamaan grafik log antara jumlah sel hidup dan waktu pengamatan.
3. Profil Kandungan Kimia Bagian Teraktif
Senyawa kimia yang terkandung dalam bagian dengan aktifitas sitotoksik lebih tinggi dianalisa berdasarkan reaksi positif yang ditunjukkan oleh reagen yang digunakan sebagai pereaksi semprot spesifik.
N 4
x A x B
BAB IV