BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) merupakan alat yang bekerja berdasarkan prinsip kromatografi yang berguna untuk memisahkan komponen –komponen zat yang terdapat di dalam suatu campuran. Salah satu tujuan dari penelitian ini adalah untuk memahami cara kerja HPLC dalam memisahkan molekul – molekul.Terjadinya suatu pemisahan ditandai dengan didapatkannya nilai waktu retensi yang berbeda. Proses pemisahan molekul – molekul menggunakan HPLC dipengaruhi oleh banyak faktor. Sehingga dalam penelitian ini dilakukan percobaan mencari pengaruh laju alir dantekananterhadap waktu retensi.
Proses pemisahan menggunakan HPLC terjadi di dalam kolom. Oleh karena itu kolom disebut sebagai jantung HPLC. HPLC sebagai sebuah sistem terdiri dari beberapa komponen seperti yang terlihat pada gambar (2.1), yaitu: pompa, injektor, kolom, detektor, dan penampil data. Cara kerja sistem HPLC adalah sebagai berikutfase gerak oleh pompaakan didorong masuk, melewati injektor, lalu ke kolom, ke detektor, dan akhirnya keluar di pembuangan. Sampel disuntikkan ke dalam injektor dengan menggunakan syringe. Sampel dan fase gerak akan bertemu dan saling bercampur pada salah satu pipa di injektor, lalu
kemudian bergerak bersama menuju kolom. Pada kolom terjadi pemisahan antar molekul, setelah terpisah molekul – molekul tersebut akan masuk ke dalam detektor satu per satu. Detektor akan mendeteksi molekul – molekul tersebut satu per satu. Setelah terdeteksi molekul tersebut dengan sendirinya akan keluar menuju pembuangan. Prinsip kerja dari detektor yang digunakan adalah serapan cahaya oleh molekul penyerap yaitu sampel. Sehingga proses pendeteksian dilakukan pada satu nilai panjang gelombang analisis. Panjang gelombang analisis merupakan panjang gelombang dimana kedua zat mengalami serapan yang baik. Data yang dikeluarkan oleh detektor berupa nilai tegangan. Besarnya nilai tegangan, menunjukkan besarnya nilai absorbansi.Mekanisme proses pemisahan ini ditunjukkan pada gambar (2.2).
Dalam penelitian ini dilakukan pengukuran waktu retensi dari Parasetamol dan Kafein dalamkondisi laju alir yang bervariasi pada tekanan tertentu dan tekanan yang bervariasi pada laju alirtertentu. Ada beberapa set pada alat yang dibuat bervariasi, namun ada juga yang dibuat tetap. Set pada alat yang dibuat tetap adalah:
a. Pompa LKB-Broma 2150
Lower limit pressure : 000 bar b. Detektor Spectroflow 757
Panjang gelombang analisis : 263 nm Filter rise time : 1 s
Skema rangkaian HPLC yang digunakan dalam penelitian ini ditunjukkan pada gambar 3.1.
Langkah kerja yang telah dilakukan pada penelitian:
1. Penyiapan fase gerak
Fase gerak yang digunakan adalah methanol pro analis, yaitu methanol yang sudah dibersihkan dari pengotor – pengotor. Walaupun demikian, untuk memastikan methanol yang digunakan benar – benar bersih maka sebelum dialirkan masuk ke dalam pompa, terlebih dahulu methanol tetap harus disaring dengan menggunakan milipore yang berukuran 0.45 µm.Milipore merupakan penyaring yang terbuat dari sejenis kertas khusus yang memiliki pori –pori berukuran tertentu. Hal ini dilakukan untuk menghindari terjadinya penyumbatan pada saluran – saluran pompa dan kolom, karena jika terjadi penyumbatan akan mengganggu proses pemisahan yang terjadi.
Setelah dilakukan penyaringan, makaselanjutnya dilakukan degassing
selama 15 menit menggunakan refrigerator ultrasonic UR275.
Degassingmerupakan proses penghilangan gelembung – gelembung udara. Adanya gelembung udara akan menyebabkan timbulnya ruang – ruang kosong pada larutan. Sehingga gelembung udara harus dihilangkan karena dapat mengganggu proses pemisahan dan pendeteksian.
2. Penyiapan sampel
Bahan standarParasetamol dan Kafein berbentuk serbuk.Kedua standartersebutmasing – masing dilarutkan ke dalam methanol, sehingga didapatkan larutan induk Parasetamol dan Kafein.Larutan induk ini diencerkan
menjadi larutan standar Parasetamol dan Kafein sesuai dengan konsentrasi yang diinginkan, pengenceran dihitung dengan menggunakan persamaan (3.1).
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini merupakan campuran antara larutan Parasetamol danKafein. Sampel yang akan disuntikkan ke dalam HPLC harus dipastikan bebas dari kotoran. Oleh karena itu sebelum diinjeksikan, dilakukan penyaringan terlebih dahulu dengan menggunakan milipore yang berukuran 0,45 µm. Hal ini bertujuan untuk menghindari penyumbatan pada saluran – saluran dalam pompa dan kolom.
3. Penentuan waktu retensi dari masing – masing molekul
Waktu retensi adalah selang waktu yang diperlukan molekul mulai pada saat injeksi sampai terdeteksi oleh detektor. Sehingga dapat dikatakan bahwawaktu retensi merupakan waktu lamanya sampel berada di dalam kolom.
Waktu retensi merupakan hal yang penting dalam kromatografi, karena waktu retensi menunjukkan identitas suatu molekul. Jika dua buah molekul memiliki waktu retensi yang berbeda berarti molekul – molekul tersebut telah mengalami pemisahan.Molekul yang akan dipisahkan dengan menggunakan HPLCadalah molekul Parasetamoldan Kafein. Sehingga sebelum melakukan proses pemisahan, waktu retensi dari Parasetamol dan Kafein perlu diketahui terlebih dahulu.
Dalam penentuan waktu retensi Parasetamol dan Kafein, larutan yang digunakan adalah larutan standar dari masing – masing molekul. Larutan standar
Parasetamol diinjeksikan ke dalam sistem HPLC, bersamaan dengan itu recorder dijalankan.Parasetamol kemudian bergerak memasuki kolom.Pada saat berada di kolom, Parasetamolakan berinteraksi dengan bagian – bagian penyusun kolom. Parasetamol terus bergerak hingga akhirnya keluar dari kolom.Setelah itu, Parasetamol terdeteksi oleh detektor.Saat Parasetamol belum terdeteksi oleh detektor, recorder hanya memunculkan garis lurus.Ketika Parasetamol terdeteksi oleh detektor, grafik pada recorder membentuk sebuah puncak.Puncak tersebut menunjukkan molekul Parasetamol yang telah terdeteksi.Proses ini juga berlaku untuk Kafein. Besar waktu retensi dihitung dengan menggunakan stopwatch. Stopwatch dijalankan saat larutan diinjeksikan ke dalam injektor dan dihentikan saat larutan terdeteksi oleh detektor yang ditandai dengan timbulnya puncak pada grafik
Dari eksperimen yang telah dilakukan didapatkan dua buah grafik yang masing – masing menunjukkan waktu retensi dari Parasetamol dan Kafein.Dua buah grafik tersebut ditunjukkan oleh gambar (4.1) dan (4.2).
Gambar 4.1. Grafik waktu retensiParasetamol
Dari gambar (4.1) dan (4.2)terlihat bahwaParasetamol memiliki waktu retensi yang lebih singkat dibandingkan dengan Kafein. Waktu retensi Parasetamol adalah 4,38 menit sedangkan Kafein adalah 7,71 menit. Berdasarkan hal tersebut dapat diketahui bahwa dalam pemisahan antara molekul Parasetamoldan Kafein, Parasetamolakan terdeteksi terlebih dahulu.
4. Pengukuran waktu retensi molekul Parasetamol dan Kafein dalam
kondisi laju alir yang bervariasi pada tekanan tertentu dan tekanan yang
bervariasi pada laju alir tertentu.
Pengukuran waktu retensi Parasetamol dan Kafein dalam kondisi laju alir bervariasi pada tekanan tertentu, dilakukan dengan laju alir fase gerak 0,55 ml/min; 0,7 ml/min; 0,85 ml/min; 1 ml/min; 1,15 ml/min; 1,3 ml/min; 1,45 ml/min; 1,6 ml/min; 1,75 ml/min; dan 1,9 ml/min pada tekanan 100 bar. Selanjutnya dilakukan hal yang sama untuk tekanan 125 bar, 150 bar, 175 bar, 200 bar, 225 bar, dan 250 bar.
Pengukuran waktu retensi Parasetamol dan Kafein dalam kondisi tekanan bervariasi pada laju alir tertentu, dilakukan dengan tekanan 100 bar, 125 bar, 150 bar, 175 bar, 200 bar, 225 bar, dan 250 bar pada laju alir 0,55 ml/min. Selanjutnya dilakukan hal yang sama untuk laju alir 0,7 ml/min; 0,85 ml/min; 1 ml/min; 1,15 ml/min; 1,3 ml/min; 1,45 ml/min; 1,6 ml/min; 1,75 ml/min; dan 1,9 ml/min.
Sampel yang digunakan merupakan campuran antara larutan standarParasetamol dan Kafein.Sampel tersebut diinjeksikan ke dalam sistem
HPLC.Sampel bergerak memasuki kolom.Pada saat berada di dalam kolom, sampel berinteraksi dengan bagian – bagian penyusun kolom.Sampel terus berjalan hingga akhirnya terdeteksi oleh detektor.Grafik yang dihasilkan pada recorder menunjukkan dua buah puncak.Masing – masing puncak menunjukkan nilai waktu retensi yang berbeda.Waktu retensi yang berbeda menunjukkan bahwa sampel mengalami pemisahan menjadiParasetamol dan Kafein.Hasil yang didapatkan dalam eksperimen ini adalah nilai waktu retensi dari Parasetamol dan Kafein.Parasetamol dan Kafein dapat diidentifikasi dengan melihat nilai waktu retensi yang didapatkan.
Dari eksperimen yang telah dilakukan didapatkan beberapa grafik yang menunjukkan proses pemisahan antara Parasetamol dan Kafein. Grafik – grafik tersebut ditunjukkan oleh gambar (4.3) dan (4.4)
Gambar 4.3. Grafik pemisahan Parasetamol dan Kafein padatekanan 100 bardan laju alir1 ml/min
Gambar 4.4. Grafik pemisahan Parasetamol dan Kafein pada tekanan 100 bar dan laju alir 1,9 ml/min
Suatu peristiwa pemisahan akan menghasilkan grafik hubungan antara keluaran detektor dan waktu retensi. Grafik tersebut berupa puncak – puncak. Puncak – puncak ini menunjukkan molekul – molekul yang telah berhasil dipisahkan. Satu puncak mewakili satu molekul.
Pada gambar (4.3)dan (4.4) terlihat bahwa masing – masing gambar memiliki dua puncak.Puncak yang satu menunjukkanParasetamolsedangkan yang satunya lagi menunjukkan Kafein.Dari Grafik terlihat bahwa Parasetamolterdeteksi terlebih dahulu dan memiliki waktu retensi yang lebih singkat dibandingkan dengan Kafein. Waktu retensi Parasetamol dan Kafein pada
gambar (4.3)dan (4.4) berbeda satu sama lain karena memakai laju alir yang berbeda.
Hasil nilai waktu retensi dari Parasetamol dan Kafein dalam kondisi laju alir bervariasi pada tekanan sebesar 100 bar ditunjukkan pada tabel (4.1). Untuk data nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein dalam kondisi laju alir bervariasi pada tekanan sebesar 125 bar, 150 bar, 175 bar, 200 bar, 225 bar dan 250 bar dapat dilihat pada lampiran A.
Tabel 4.1 : Tabel nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk laju alir yang bervariasipada tekanan sebesar 100 bar.
Laju alir (ml/min) tRParasetamol (menit) tRKafein (menit)
0,55 5,36 7,46 0,7 5,00 7,17 0,85 4,40 7,05 1 4,01 6,22 1,15 3,31 5,54 1,3 3,22 5,17 1,45 3,01 4,45 1,6 2,33 4,21 1,75 2,17 4,03 1,9 2,02 3,43
Tabel (4.1) menunjukkan data nilai waktu retensi dalam kondisi laju alir yang bervariasi pada tekanan 100 bar.Semakin tinggi laju alirnya, waktu retensinya semakin singkat.Perbedaan waktu retensi antara laju alir yang satu dengan laju alir yang lain pada tekanan yang sama untuk tiap molekulcukup besar.
Hasil nilai waktu retensi dariParasetamol dan Kafein dalam kondisi tekanan bervariasi pada laju alir sebesar 1,45ml/min ditunjukkan pada tabel (4.2). Untuk data nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein dalam kondisi tekanan bervariasi pada laju alir sebesar 0,55 ml/min; 0,7 ml/min; 0,85 ml/min;1 ml/min; 1,15 ml/min;1,3 ml/min; 1,6 ml/min; 1,75 ml/min dan 1,9 ml/min terdapat pada lampiran B.
Tabel 4.2 : Tabel nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk tekanan yang bervariasi pada laju alir sebesar 1,45 ml/min.
Tekanan (P) bar tRParasetamol (menit) tRKafein (menit)
100 3,01 4,45 125 2,50 4,37 150 2,44 4,35 175 2,41 4,22 200 2,43 4,25 225 2,39 4,22 250 2,40 4,20
Berdasarkan tabel (4.2) di atas terlihat bahwa tekanan mempengaruhi waktu retensi. Semakin tinggitekanannya maka waktu retensinya semakin singkat.Perbedaan waktu retensi antara tekanan yang satu dengan tekanan yang lain pada laju alir yang sama untuk tiap molekul sangat kecil.
Dari tabel (4.1) dan (4.2) didapatkan gambar (4.5) dan (4.6).Berdasarkan tabel data (4.1) maka didapatkan gambar grafik (4.5).Gambar (4.5) merupakan grafik hubungan antara waktu retensi dan seper laju aliruntuk tekanan sebesar 100 bar.
Gambar 4.5. Grafik hubungan antara tRdan 1 / v pada tekanan sebesar 100 bar
Gambar (4.5) sesuai dengan persamaan (2.1).Pada gambar (4.5) Parasetamol ditunjukkan oleh grafik yang berwarna biru. Waktu retensi Parasetamolberada pada rentang antara 1,5 menit hingga 5,5 menituntuk rentang seper laju alir 0,5 bar-1(ml/min)-1 hingga 2 (ml/min)-1. Sedangkan Kafein ditunjukkan oleh grafik berwarna merah. Waktu retensi Kafein berada pada rentang antara3 menit hingga 7,5 menit pada rentang seper laju alir 0,5 (ml/min)-1hingga 2 (ml/min)-1.
Berdasarkan tabel data (4.2) maka didapatkan gambar grafik (4.6). Gambar (4.6) merupakan grafik hubungan waktu retensi dan tekanan untuk laju alir sebesar 1,45 ml/min.
Gambar 4.6. Grafik hubungan antara tRdan P pada laju alir sebesar 1,45 ml/min.
Pada gambar (4.6) Parasetamol ditunjukkan oleh grafik berwarna biru.Waktu retensi Parasetamol berada pada rentang antara 2 menit hingga 3 menit pada rentang tekanan dari100 bar hingga 250 bar.Sedangkan Kafein ditunjukkan oleh grafik berwarna merah. Waktu retensi Kafein berada pada rentang antara 4 menit hingga 5 menit pada rentang tekanan dari 100 bar hingga 250 bar.
