Daun sirih merah yang digunakan dalam penelitian merupakan daun sirih merah yang diperoleh dari daerah Sleman, Yogyakarta. Berdasarkan hasil determinasi tanaman, daun yang diperoleh merupakan daun tanaman sirih merah
(Piper crocatum Ruiz & Pav.). Hasil determinasi tanaman dapat dilihat pada
lampiran 2.
Daun sirih merah yang diperoleh dipisahkan dari pengotor atau bagian tanaman yang tidak diperlukan, dicuci dengan air mengalir, dan dikeringkan untuk mendapatkan simplisia daun sirih merah, kemudian dilakukan penyerbukan dan pengayakan dengan menggunakan pengayak dengan nomor mesh 50, sehingga diperoleh serbuk halus. Menurut Dirjen POM (2014), kecuali dinyatakan lain, derajat kehalusan serbuk untuk pembuatan ekstrak merupakan serbuk halus. Selanjutnya kadar air serbuk simplisia daun sirih merah ditentukan dengan metode destilasi toluen. Serbuk simplisia daun sirih merah merupakan simplisia yang
11
mengandung senyawa metabolit sekunder yang bersifat volatil, salah satunya minyak atsiri. Berdasarkan Farmakope Herbal (2009), merekomendasikan penentuan kadar air simplisia tanaman yang mengandung senyawa metabolit sekunder yang bersifat volatil lebih untuk menggunakan metode destilasi toluen. Kadar air nantinya dihitung dengan menggunakan rumus berikut.
% Kadar air = volume air (mL) x 100% berat simplisia yang ditimbang (g)
Volume air yang diperoleh adalah 0,5 mL, dengan bobot serbuk yang ditimbang adalah 10,2294 gram, sehingga kadar air yang diperoleh adalah 4,8879%. Persen kadar air yang baik adalah kurang dari 10% (Direktorat Jendral Bina Kefarmasian Kefarmasian dan Alat Kesehatan RI, 2011).
Serbuk simplisia daun sirih merah diekstraksi dengan metode maserasi dan menggunakan pelarut metanol 70%. Ekstrak metanol daun sirih merah (EMDSM) diketahui memiliki aktivitas antimikroba yang dapat menghambat pertumbuhan
Pseudomonas aeruginosa (Marliyana et al., 2013). Hasil maserasi yang diperoleh
disaring dengan menggunakan corong buchner yang telah diberikan kertas saring sebelumnya. Serbuk yang diperoleh dari proses penyaringan tersebut diremaserasi kembali. Total proses maserasi dilakukan sebanyak tiga kali, yaitu dengan pelarut metanol 70% sebanyak 100 mL, 75 mL, dan 25 mL. Produk akhir dari proses maserasi merupakan ekstrak cair, yang nantinya akan dijadikan ekstrak kental dengan bantuan evaporator pada suhu 65°C. Pelarut metanol merupakan pelarut yang miliki titik didih pada suhu 65°C (PubChem, 2018). Maka pada suhu 65°C pelarut metanol 70% dalam ekstrak cair akan lebih mudah menguap, sehingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak kental tersebut ditentukan bobot tetapnya untuk dapat mengetahui persen rendemennya. Dapat disebut bobot tetap ketika pada dua kali penimbangan selisih bobot tidak melebihi 0,5 mg (Direktorat Jendral Bina Kefarmasian dan Alat Kesehatan RI, 2011). Bobot dihitung setelah dipijarkan selama 60 menit. Bobot tetap ekstrak kental daun sirih merah yang diperoleh adalah 25,5670 gram, sedangkan bobot serbuk simplisia daun sirih merah yang ditimbang yaitu 134,5500 gram. Berdasarkan hasil bobot ekstrak dan bobot serbuk
12
simplisia, diperoleh persen rendemen sebesar 19,0018%. Persen rendemen dihitung untuk mengetahui seberapa banyak ekstrak metanol daun sirih merah (EMDSM) yang diperoleh. Semakin tinggi nilai rendemen yang diperoleh, maka semakin banyak EMDSM yang diperoleh (Direktorat Jendral Bina Kefarmasian dan Alat Kesehatan RI, 2011). Rumus persen rendemen adalah sebagai berikut.
% Rendemen = bobot ekstrak (g) x 100% bobot simplisia yang dihitung (g)
Penelitian ini menggunakan bakteri Pseudomonas aeruginosa, seperti yang tertera pada surat identifikasi bakteri pada lampiran 3. Sebelum pelaksanaan uji aktivitas antimikroba dengan metode difusi sumuran, perlu dilakukan penyiapan stok dan suspensi bakteri Pseudomonas aeruginosa terlebih dahulu. Stok bakteri uji dibuat dengan menggoreskan jarum ose pada media NA sebanyak 1-2 kali, kemudian diinkubasikan pada suhu 37°C selama 24 jam. Selanjutnya dilakukan penyiapan suspensi bakteri uji dengan mengambil secukupnya bakteri uji pada stok bakteri kemudian diencerkan dengan BPW. Suspensi bakteri disetarakan kekeruhannya dengan larutan McFarland 0,5 dengan bantuan alat nephelometer
(CLSI, 2018).
(a) (b)
Gambar 1. (a) Kontrol media; (b) Kontrol pertumbuhan
Aktivitas antimikroba ampisilin (AMP) tunggal, EMDSM tunggal, serta kombinasi AMP dan EMDSM terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa diuji menggunakan metode difusi sumuran dengan ukuran lubang sumuran sebesar 6 mm dan dilakukan replikasi sebanyak tiga kali. Media yang digunakan pada penelitan adalah nutrient agar (NA). Terdapat kontrol media untuk memastikan
13
bahwa penelitian dilakukan secara aseptis. Pada kontrol media tidak nampak adanya kontaminasi atau bakteri yang tumbuh. Maka dapat disimpulkan bahwa penelitian dilakukan secara aseptis. Selain kontrol media, terdapat kontrol pertumbuhan yang dibuat untuk memastikan bahwa bakteri Pseudomonas
aeruginosa dapat tumbuh dengan baik pada media. Kekeruhan kontrol
pertumbuhan yang diperoleh menunjukkan bahwa bakteri Pseudomonas
aeruginosa dapat tumbuh dengan baik pada media. Hasil kontrol media dan
kontrol pertumbuhan yang diperoleh pada penelitian dapat dilihat pada gambar 1(a) dan 1(b).
Kontrol negatif berisi pelarut yang digunakan dalam penelitian, yaitu DMSO 1% (pelarut EMDSM), BPW (pelarut untuk mengencerkan bakteri), dan aquadest steril (pelarut AMP). Pelarut yang digunakan tidak boleh memiliki aktivitas antimikroba. Kontrol negatif dibuat untuk melihat apakah pelarut yang digunakan memiliki aktivitas antimikroba atau tidak. Hasil menunjukkan bahwa pelarut yang dipakai tidak memiliki aktivitas antimikroba. Hasil kontrol negatif dapat dilihat pada pada gambar 2(b).
(a) (b)
Gambar 2. Hasil difusi sumuran (a) EMDSM tunggal 0,75 mg/mL (b) kontrol negatif, AMP tunggal 40 µg/mL, dan kombinasi
Keterangan gambar 2(b) : 1 = Kontrol negatif
2 = AMP tunggal 40 µg/mL
3 = EMDSM 0,75 mg/mL dan AMP 4 = EMDSM 1,5 mg/mL dan AMP
5 = EMDSM 3 mg/mL dan AMP 6 = EMDSM 6 mg/mL dan AMP 7 = EMDSM 12 mg/mL dan AMP *AMP= 40 µg/mL
14
Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Marliyana et al. (2013), ekstrak etanol daun sirih merah dapat menghambat pertumbuhan bakteri Pseudomonas
aeruginosa pada konsentrasi 0,75 mg/mL. EMDSM tunggal yang diujikan hanya
konsentrasi 0,75 mg/mL karena menurut Marliyana et al. (2013), konsentrasi tersebut merupakan KHM dari ekstrak etanol daun sirih merah. Rupanya dengan konsentrasi yang sama EMDSM juga dapat menghambat pertumbuhan bakteri
Pseudomonas aeruginosa, seperti pada gambar 2(a). EMDSM yang
dikombinasikan dengan AMP dibuat variasi konsentrasinya untuk melihat kombinasi mana yang dapat menghasilkan aktivitas antimikroba yang paling baik. Berdasarkan penelitian Christopher et al. (2014), pada uji aktivitas antimikroba AMP dengan metode difusi disk Kirby Bauer, AMP memiliki KHM pada 0,20-250 µg/ mL untuk dapat menghambat pertumbuhan bakteri
Pseudomonas aeruginosa, sehingga pada penelitian ini AMP tunggal diuji
aktivitas antimikrobanya adalah konsentrasi 40 µg/mL. Hasilnya AMP pada konsentrasi tersebut dapat menghambat pertumbuhan bakteri seperti pada gambar 2(b). Namun terdapat sedikit bakteri yang tidak mati pada zona hambat AMP 40 µg/mL, hal ini menandakan bahwa terdapat bakteri yang telah resisten terhadap AMP pada konsentrasi 40 µg/mL.
EMDSM yang diuji aktivitas antimikrobanya dalam kombinasi dengan AMP konsentrasi 40 µg/mL adalah EMDSM konsentrasi 0,75 mg/mL, 1,5 mg/mL, 3 mg/mL, 6 mg/mL, dan 12 mg/mL, seperti pada gambar 2(b). Masing-masing kombinasi tersebut terlihat dapat menghambat pertumbuhan bakteri
Pseudomonas aeruginosa, ditunjukkan dari adanya zona jernih yang dihasilkan.
Diameter zona hambat dari setiap perlakuan selanjutnya diukur dengan menggunakan penggaris. Data diameter zona hambat dapat dilihat pada tabel 1. Diameter ukuran zona hambat yang diperoleh telah dikurangi dengan diameter pelubang sumuran 6 mm sebelumnya.
Berdasarkan tabel 1, kontrol negatif yang berisi pelarut (DMSO 1%, BPW, dan aquadest) tidak menunjukkan zona hambat. Hal ini berarti baik DMSO 1%, BPW, maupun aquadest tidak memiliki aktivitas antimikroba terhadap bakteri
15
Pseudomonas aeruginosa. Pelarut yang digunakan pada penelitian haruslah
pelarut yang tidak mempengaruhi hasil penelitian. Apabila pelarut yang digunakan dapat menghasilkan zona hambat, maka hal ini akan menimbulkan bias pada hasil penelitian, sehingga hasil yang diperoleh tidak akurat. AMP tunggal, EMDSM tunggal, dan kombinasinya memiliki aktivitas antimikroba, ditunjukkan dari munculnya zona hambat pada tabel 1.
Tabel 1. Rata-rata diameter zona hambat tiap perlakuan dan kontrol negatif Pelarut dan Perlakuan
Tunggal Rata-Rata Zona Hambat (mm) Perlakuan Kombinasi Rata-Rata Zona Hambat (mm) Pelarut 0,0 1 7,7 AMP tunggal 8,3 2 8,7 EMDSM tunggal 9,0 3 9,0 4 9,5 5 9,2
* Pelarut= DMSO 1%, BPW, dan aquadest; AMP tunggal = 40 µg/mL; EMDSM tunggal = 0,75 mg/mL; 1= EMDSM 0,75 mg/mL dan AMP; 2= EMDSM 1,5 mg/mL dan AMP; 3= EMDSM 3 mg/mL dan AMP; 4= EMDSM 6 mg/mL dan AMP; 5= EMDSM 12 mg/mL dan AMP
Data zona hambat yang diperoleh selanjutnya dianalisis secara statistik. Uji normalitas dilakukan dengan uji Shapiro Wilk, karena masing-masing kelompok perlakuan memiliki tiga data. Pada uji Shapiro Wilk, terdapat empat data yang tidak terdistribusi normal, yaitu pada data AMP tunggal, EMDSM tunggal, kombinasi EMDSM 1,5 mg/mL dan AMP, serta kombinasi EMDSM 3 mg/mL dan AMP. Kemudian dilakukan uji homogenitas dengan menggunakan uji Levene. Hasilnya didapatkan nilai p = 0,001 (p<0,05), sehingga data yang diperoleh tidak homongen. Untuk melihat apakah ada perbedaan bermakna antar kelompok perlakuan, dilakukan uji Kruskal-Wallis. Uji Kruskal-Wallis dipilih karena data tidak terdistribusi normal dan tidak homogen. Hasil uji Kruskal-Wallis
menunjukkan nilai p = 0,141 (p>0,05), artinya tidak terdapat perbedaan bermakna pada perlakuan yang dilakukan. Hasil tidak berbeda bermakna diperjelas dengan
16
Tabel 2. Hasil uji Mann-Whitney pada taraf kepercayaan 95%
Perbandingan Nilai p Perbandingan Nilai p
Kontrol negatif AMP tunggal 0,000 K-1 K-2 0,965 EMDSM tunggal 0,000 K-3 0,863 K-1 0,000 K-4 0,590 K-2 0,000 K-5 0,783 K-3 0,000 K-2 K-3 1,000 K-4 0,000 K-4 0,987 K-5 0,000 K-5 0,999 AMP tunggal EMDSM tunggal 0,996 K-3 K-4 0,999 K-1 0,863 K-5 1,000 K-2 1,000 K-4 K-5 1,000 K-3 1,000 *AMP tunggal= 40 µg/mL; EMDSM tunggal= 0,75 mg/mL; K-1= EMDSM 0,75 mg/mL dan AMP; K-2= EMDSM 1,5 mg/mL dan AMP; K-3= EMDSM 3 mg/mL dan AMP; K-4= EMDSM 6 mg/mL dan AMP; K-5= EMDSM 12 mg/mL dan AMP *Warna kuning: Berbeda bermakna; Tidak berwarna: Tidak berbeda bermakna
K-4 0,999 K-5 1,000 EMDSM tunggal K-1 0,996 K-2 1,000 K-3 0,996 K-4 0,924 K-5 0,987
Berdasarkan hasil perbandingan pada uji Mann-Whitney, semua perlakuan tidak memiliki perbedaan yang signifikan kecuali jika dibandingkan dengan pelarut. Besarnya zona hambat perlakuan kombinasi ternyata tidak berbeda signifikan dengan perlakuan tunggal. Hal ini menunjukkan bahwa interaksi yang dihasilkan dari kombinasi AMP dan EMDSM tidak menghasilkan efek sinergis, melainkan indifferent. Menurut Garroth dan Waterworth (1967), adanya efek
indifferent pada suatu kombinasi dapat disebabkan karena dua agen yang
dikombinasikan memiliki aksi yang sama. Efek indifferent bisa saja didapat karena kombinasi AMP dan EMDSM memiliki aksi antimikroba yang sama, yaitu mengganggu dinding sel bakteri uji sehingga mengakibatkan kematian.
EMDSM tunggal dan kombinasi dilihat kandungan senyawanya dengan uji KLT dan uji tabung. Uji tersebut dilakukan untuk melihat apakah terdapat perbedaan kandungan EMDSM sebelum dan setelah dikombinasikan. Menurut
17
Rinanda et al. (2012), EMDSM mengandung senyawa metabolit sekunder berupa alkaloid, flavonoid, saponin, triterpenoid, dan tanin, sedangkan menurut Hartini et al. (2013) terdapat kandungan minyak atsiri dan terpenoid. Pada penelitian ini metode KLT dilakukan untuk mengidentifikasi senyawa flavonoid, sedangkan pada uji tabung mengidentifikasi adanya kandungan flavonoid, tanin, alkaloid, saponin, dan minyak atsiri dalam EMDSM. Senyawa metabolit sekunder yang diuji yaitu senyawa yang memiliki efek antimikroba. Mekanisme senyawa-senyawa tersebut antara lain: flavonoid dapat meningkatkan permeabilitas dinding sel bakteri; tanin dapat mengganggu membran sel bakteri dan membentuk senyawa kompleks dengan suatu enzim atau substrat; alkaloid dapat menyebabkan bakteri mengalami lisis dengan mekanisme yang masih belum jelas, namun aktivitasnya diakibatkan karena cincin karbon, substitusi aromatik, dan oksidasi alami dari alkaloid; saponin memiliki molekul yang dapat menarik air atau hidrofilik dan dapat mendilusikan lipid atau lipofilik, sehingga dapat mengurangi tegangan permukaan sel bakteri; minyak atsiri mengandung linalol yang mengandung gugus fungsi hidroksil (-OH) yang aktif sebagai antibakteri pada umumnya (Rachmawaty et al., 2018; Rinanda et al., 2012).
Uji KLT menggunakan fase gerak berupa etil asetat dan toluen dengan perbandingan 9:1 dan fase diam berupa silica gel GF254. Standar flavonoid yang dipakai adalah kuersetin. Menurut Panche et al. (2016), kuersetin merupakan flavonoid yang pada umumnya terdapat pada tanaman obat. Maka pada penelitian ini menggunakan kuersetin sebagai standar untuk mendeteksi adanya flavonoid pada EDSM. Tiap larutan uji ditotolkan sebanyak 30 kali pada plat KLT kemudian dielusikan hingga jarak 10 cm dengan menggunakan fase gerak. Menurut literatur, adanya kandungan flavonoid ditunjukkan dari terbentuknya: peredaman fluorosensi pada detektor UV 254 nm (Kesarkar et al., 2009); warna ungu pada detektor UV 365 nm (Dwiatmaka, 2010) atau dapat terbentuk warna kuning gelap, hijau, maupun biru (Kersarkar et al., 2009); dan warna abu-abu kecoklatan setelah disemprot dengan pereaksi FeCl3 (Sonam et al., 2017). Hasil uji KLT dapat dilihat pada gambar 3.
18
(a) (b) (c)
Gambar 3. Hasil uji KLT dengan (a) detektor UV
254 nm; (b) detektor UV 365 nm; (c) disemprot dengan pereaksi FeCl3 Keterangan gambar 3(a), 3(b), dan 3(c):
1 = Standar (kuersetin) 2 = AMP tunggal 40 µg/mL 3 = EMDSM tunggal 0,75 mg/mL 4 = EMDSM 0,75 mg/mL dan AMP
5 = EMDSM 1,5 mg/mL dan AMP 6 = EMDSM 3 mg/mL dan AMP 7 = EMDSM 6 mg/mL dan AMP 8 = EMDSM 12 mg/mL dan AMP *AMP= 40 µg/mL
Senyawa kuersetin tidak teridentifikasi pada hasil uji KLT EMDSM tunggal maupun kombinasi. Hal ini ditunjukkan dari perbedaan warna maupun nilai Rf EMDSM tunggal dan kombinasi dengan standar kuersetin. Namun meskipun tidak terlihat adanya kuersetin, nampak hasil bercak biru pada UV 365 nm. Munculnya warna biru merupakan indikasi adanya flavonoid di dalam suatu bahan uji (Kersarkar et al., 2009). Terdapat berbagai macam jenis flavonoid, yaitu flavonol antosianin, kalkon, flavanon, flavon, dan isoflavonoid (Panche et al., 2016). Kuersetin sendiri merupakan flavonoid jenis flavonol. Berdasarkan hasil yang diperoleh, EMDSM rupanya memiliki flavonoid jenis yang lain, bukan flavonol (kuersetin). Selain flavonoid, muncul juga senyawa yang lain, seperti klorofil, terlihat dari warna kemerahan pada detektor UV 365 nm (Wagner et al., 1983) dan senyawa fenol, terlihat dari warna hijau tua dan biru tua pada detektor UV 254 nm, teridentifikasi dalam EMDSM (Susanti et al., 2017).
19
Tabel 3. Nilai Rf dan warna uji KLT standar dan perlakuan tunggal
Detektor Bercak Standar
AMP tunggal 40 µg/mL
EMDSM tunggal 0,75 mg/mL
Rf Warna Rf Warna Rf Warna
UV 254 nm A - - - - - - B - - - - 0,54 BT C - - - - 0,72 BT D - - - - 0,95 HT E - - - - 0,98 HT F 0,67 H - - - - UV365 nm A - - - - 0,22 M B - - - - - - C - - - - 0,95 M D - - - - 0,98 M E 0,67 U - - - - Pereaksi FeCl3 A - - - - - - B - - - - - - C - - - - 0,98 AK D 0,67 H - - - -
* H= Hitam; U= Ungu; BT= Biru tua; HT= Hijau tua; Mk= Merah; AK= Abu-abu kecoklatan
Tabel 4. Nilai Rf dan warna uji KLT perlakuan kombinasi
Detektor Bercak 1 2 3 4 5 Rf W Rf W Rf W Rf W Rf W UV 245 nm A - - - - 0,25 Hj 0,26 Hj 0,28 Hj B 0,54 B 0,54 B 0,54 B 0,55 B 0,55 B C 0,71 B 0,71 B 0,70 B 0,70 B 0,70 B D 0,95 Hj 0,94 Hj 0,93 Hj 0,93 Hj 0,91 Hj E 0,98 Hj 0,97 Hj 0,97 Hj 0,98 Hj 0,97 Hj F - - - - - - - - - - UV 365 nm A 0,22 M 0,24 M 0,25 M 0,26 M 0,28 M B - - - - - - 0,70 M 0,70 M C 0,95 M 0,94 M 0,93 M 0,93 M 0,97 M D 0,98 M 0,97 M 0,97 M 0,98 M 0,97 M Pereaksi FeCl3 A - - - - - - 0,26 Hj 0,26 Hj B - - 0,94 Hj 0,93 Hj 0,93 Hj 0,91 Hj C 0,98 Hj 0,97 Hj 0,97 Hj 0,98 Hj 0,97 Hj D - - - - - - - - - - * Rf= Nilai Rf; W= Warna
* H= Hitam; B= Biru tua; Hj= Hijau tua; Mk= Merah
* 1= EMDSM 0,75 mg/mL dan AMP; 2= EMDSM 1,5 mg/mL dan AMP; 3= EMDSM 3 mg/mL dan AMP; 4= EMDSM 6 mg/mL dan AMP; 5= EMDSM 12 mg/mL dan AMP (AMP= 40µg/mL)
20
Pada hasil uji tabung menunjukkan bahwa EMDSM terdeteksi mengandung: flavonoid, ditandai dengan perubahan warna menjadi oranye; tanin, ditandai dari terjadinya perubahan warna menjadi hijau kehitaman; saponin, ditandai dari terbentuknya buih; dan minyak atsiri, ditandai dari munculnya bau yang khas. Alkaloid tidak terdeteksi pada uji tabung EMDSM (tidak terbentuk endapan kuning). Menurut Hartini et al. (2013), EMDSM akan terdeteksi mengandung alkaloid. Perbedaan hasil ini dapat disebabkan karena konsentrasi alkaloid dalam EMDSM yang terlalu kecil untuk dapat memunculkan endapan berwarna kuning. Hasil uji tabung dapat dilihat seperti pada lampiran 6.
Berdasarkan hasil uji KLT dan uji tabung, tidak terdapat perbedaan senyawa metabolit sekunder EMDSM tunggal maupun kombinasi. EMDSM pada konsentrasi 0,75 mg/mL hingga 12 mg/mL akan mengandung flavonoid, tanin, saponin, dan minyak atsiri. Menambahkan EMDSM dengan AMP tidak mengubah kandungan yang ada di dalamnya.