Pengaruh Ekstraksi Bertingkat terhadap Rendemen
Kadar air daun kesum sebagai bahan baku ekstraksi dapat dilihat pada Tabel 3. Pada penelitian ini dilakukan dua teknik pengeringan yang berbeda pada daun kesum segar, yaitu pengeringan pada suhu ruang (kering angin) untuk bahan destilasi uap-air dan pengeringan beku untuk bahan ekstraksi dengan pelarut. Pengeringan daun kesum pada tahap persiapan ini bertujuan untuk mengurangi kadar air bahan dan meminimalkan kehilangan senyawa volatil pada bahan untuk destilasi uap-air. Kadar air bahan sangat mempengaruhi rendemen yang diperoleh (Seth et al. 2010), adanya air pada sampel dapat mengganggu proses ekstraksi. Makin rendah kadar air bahan maka makin tinggi efisiensi ekstraksi (Nagy and Simándi 2008) sehingga rendemen yang diperoleh maksimal.
Tabel 3 Kadar air daun kesum
Perlakuan Kadar air (%) Keterangan
Segar 70,94 ± 0,23
Keringangin
(kamar gelap, 28oC) 7 hari
11,39 ± 0,19 Bahan untuk destilasi uap-air
Keringbeku 24 jam 3,18 ± 0,06 Bahan untuk ekstraksi dengan pelarut
Daun kesum segar dikeringanginkan selama tujuh hari di kamar gelap pada suhu 28oC, teknik pengeringan ini umum dilakukan untuk menyediakan simplisia tanaman herbal. Manika et al. (2013) melaporkan tanaman herba Gymnema sylvestre yang dikeringkan dengan teknik ini menghasilkan rendemen gymnemagenin yang lebih tinggi dibandingkan pengeringan dengan sinar matahari, oven dan microwave. Selanjutnya daun kesum kering diekstraksi dengan destilasi uap-air (Gambar 6) yang merupakan metode paling umum digunakan dalam produksi minyak atsiri (Burt 2004; Handa 2008). Destilasi uap-air adalah istilah yang secara umum digunakan untuk destilasi campuran uap-air dengan senyawa yang tidak larut dalam air yaitu minyak atsiri berdasarkan perbedaan titik didih. Bahan dijaga agar tidak kontak dengan air, minyak atsiri akan terdestilasi oleh uap yang berasal dari air mendidih. Komponen volatil bahan akan menguap pada suhu yang lebih rendah dari pada dengan pemanasan langsung. Selanjutnya dikondensasikan dengan bantuan kondensor dan minyak atsiri dapat dipisahkan dari air. Minyak atsiri yang diperoleh dikontakkan dengan Na2SO4 anhidrous untuk mengikat air yang terbawa selama proses ekstraksi (Sharififar et al. 2007) sehingga diperoleh minyak atsiri murni (Gambar 7). Dengan teknik destilasi ini, resiko kerusakan komponen minyak atsiri akibat hidrolisis dan polimerisasi selama destilasi dapat ditekan. Minyak atsiri yang diperoleh disimpan dalam vial gelap pada suhu 4oC sampai saat akan digunakan, hal ini bertujuan untuk mencegah terjadinya degradasi komponen bioaktif.
Penggunaan suhu tinggi pada proses pengeringan bahan untuk ekstraksi dengan pelarut dapat mempengaruhi stabilitas fitokimia bahan. Daun kesum dikeringbekukan menggunakan freeze dryer untuk meminimalkan kontak bahan dengan suhu tinggi sehingga komponen bioaktif dapat dipertahankan. Sebagaimana laporan Mahanom et al. (1999) yang menyatakan perlakuan
pengeringan menggunakan freeze dryer dapat mempertahankan kehilangan komposisi fitokimia bahan dibandingkan pengeringan menggunakan oven pada suhu 50oC dan 70oC. Sejalan dengan Liazid et al. (2010) yang menyatakan penerapan suhu tinggi dapat menyebabkan degradasi kimia sehingga bahan kehilangan bioaktifitasnya. Daun kesum kering yang diperoleh dikecilkan ukurannya sehingga diperoleh bubuk kesum lolos ayakan 48 mesh (300 µm) dengan tujuan menyeragamkan ukuran partikel. Pecahnya jaringan dan struktur sel saat pengecilan ukuran akan mempermudah ekstraksi komponen bioaktif dan memperbesar luas permukaan kontak sampel dengan pelarut (Handa 2008). Semakin kecil ukuran partikel sampel, maka makin besar luas permukaan kontak antara sampel dengan pelarut sehingga proses ekstraksi akan lebih efisien (Vinatoru 2001).
Gambar 6 Ekstraksi daun kesum (A) maserasi, (B) ultrasonikasi dan (C) destilasi uap-air
Ekstraksi dilakukan untuk mengisolasi komponen bioaktif daun kesum dengan menggunakan pelarut yang sesuai. Polaritas dari senyawa target merupakan faktor penting dalam pemilihan pelarut (Cowan 1999). Pemilihan pelarut untuk ekstraksi komponen bioaktif hendaknya mempertimbangkan afinitas molekul antara pelarut dan zat terlarut, transfer massa, keamanan lingkungan, toksisitas terhadap manusia dan kelayakan finansial (Azmir et al. 2013). Ekstraksi dilakukan secara bertingkat dengan tiga pelarut yang berbeda polaritasnya, mulai dari pelarut nonpolar (heksan), pelarut semipolar (etil asetat) dan pelarut polar (etanol) (Gambar 5). Ekstraksi bertingkat dinilai efisien untuk jumlah sampel yang terbatas dan efektif untuk pemisahan komponen aktif ekstrak berdasarkan polaritasnya (Houghton dan Raman 1998).
Gambar 7 Ekstrak daun kesum (A) minyak atsiri, (B) ekstrak heksan, (C) ekstrak etil asetat dan (D) ekstrak etanol
Pada penelitian ini ekstraksi dilakukan secara bertingkat dengan membandingkan metode ekstraksi konvensional yaitu maserasi dengan agitasi 200 rpm selama 24 jam dengan metode nonkonvensional yaitu ultrasonikasi dengan frekuensi 40 kHz selama 20 menit (Gambar 6). Maserasi merupakan metode ekstraksi sederhana yang dilakukan dengan merendam bubuk sampel dalam suatu pelarut untuk jangka waktu tertentu (Azmir et al. 2013), sedangkan ultrasonikasi merupakan teknik pemberian gelombang ultrasonik (umumnya antara 20 kHz-100MHz) pada ekstraksi menggunakan pelarut (Azmir et al. 2013; Jabrak 2013). Ekstrak yang diperoleh adalah ekstrak heksan (nonpolar), ekstrak etil asetat (semipolar) dan ekstrak etanol (polar) (Gambar 7).
Secara keseluruhan, rendemen tertinggi diperoleh dari ekstrak etanol sebesar 15,45 ± 0,36% dan rendemen terendah diperoleh dari minyak atsiri sebesar 0,14 ± 0,01%. Rendemen ekstraksi secara berurutan dari yang tertinggi sampai terendah adalah ekstrak etanol > ekstrak etil asetat > ekstrak heksan > minyak atsiri (Tabel 4). Hasil tersebut memperlihatkan perbedaan polaritas senyawa yang terekstrak sesuai polaritas pelarut, semakin tinggi polaritas pelarut makin meningkat rendemen ekstrak yang diperoleh. Ekstrak daun kesum yang diperoleh didominasi senyawa polar, yang terekstrak dengan pelarut polar yaitu etanol. Senyawa aktif yang dapat diekstrak menggunakan etanol adalah tannin, polifenol, poliasetilen, flavonol, terpenoid, sterol, alkaloid dan propolis (Cowan 1999).
Tabel 4 Rendemen dan waktu ekstraksi dengan metode ekstraksi yang berbeda
Metode ekstraksi
Rendemen ekstrak (%) Waktu ekstraksi per pelarut Heksan Etil asetat Etanol Minyak
atsiri
Ultrasonikasi** 1,71*±0,08 1,92*±0,02 15,38*±0,41 - 20 menit Maserasi** 0,71±0,05 1,41±0,01 5,98±0,02 - 24 jam
Destilasi uap-air *** - - - 0,14±0,01 8 jam
*berbeda nyata (uji-t, p = 0,05)
**ekstraksi dilakukan secara bertingkat
***tidak dibandingkan dengan metode ultrasonikasi dan maserasi
Rendemen ekstraksi merupakan salah satu faktor penting dalam mengevaluasi metode ekstraksi. Secara keseluruhan rendemen ekstrak yang diperoleh dengan ultrasonikasi lebih tinggi (Tabel 4) dan secara statistik berbeda nyata dibandingkan maserasi (hasil uji-t dapat dilihat pada lampiran 1, 2 dan 3). Selain itu ekstraksi dengan ultrasonikasi dapat mereduksi waktu ekstraksi hingga 98,61%, dari 24 jam menjadi 20 menit. Hasil yang diperoleh sejalan dengan Vinatoru (2001), rendemen ekstraksi dengan ultrasonikasi lebih tinggi dibandingkan dengan maserasi. Velickovic et al. (2007) melakukan evaluasi teknik ekstraksi dan melaporkan, rendemen flavon daun Salvia officinalis L. dengan ultrasonikasi sebesar 8,16% dan maserasi sebesar 1,91%. Rendemen flavon daun Salvia glutinosa L. dengan ultrasonikasi sebesar 1,36% dan maserasi sebesar 0,76%. Celeghini et al. (2001) melaporkan konsentrasi kumarin daun Mikania glomerata Spreng. yang diekstraksi menggunakan ultrasonikasi (656,2 µg/ml) selama 20 menit tidak berbeda nyata dengan hasil ekstraksi menggunakan maserasi selama 7 hari (696,4 µg/ml). Aspe dan Fernandez (2011) juga melaporkan sampel yang diekstrak dengan teknik ultrasonikasi menunjukkan peningkatan rendemen, total fenol dan konsentrasi tannin. Ultrasonikasi
memungkinkan hasil ekstraksi yang lebih tinggi dalam periode waktu yang lebih singkat dibanding maserasi sehingga mengurangi penggunaan energi (Khan et al. 2010; Mantegna et al. 2012). Jabrak (2013) menyatakan ultrasonikasi merupakan salah satu teknologi baru yang dikembangkan untuk meminimalkan waktu proses, biaya dan memaksimalkan kualitas. Sebaliknya proses ekstraksi dengan metode konvensional memerlukan waktu yang panjang dan juga dapat menyebabkan beberapa degradasi dari molekul target (Mantegna et al. 2012).
Keunggulan ultrasonikasi dibanding maserasi dalam hal rendemen dan waktu ekstraksi dapat dijelaskan oleh mekanisme yang berbeda. Prinsip utama ekstraksi dengan ultrasonikasi didasarkan pada fenomena kavitasi, efek mekanis dan termal yang dapat menyebabkan terganggunya dinding sel sehingga terjadi intensifikasi perpindahan massa dan interaksi antara pelarut dan bahan (Shirsath et al. 2012; Azmir et al. 2013). Ultrasonikasi akan memfasilitasi pengembangan dan hidrasi pori-pori dinding sel bahan sehingga meningkatkan proses difusi dan perpindahan massa (Vinatoru 2001). Daya ultrasonikasi berfokus pada kerusakan lapisan kutikula diikuti perforasi ke dinding sel bahan yang menyebabkan kerusakan (Aspe dan Fernandez 2011) sehingga rendemen ekstrak yang diperoleh maksimal.
Prinsip utama maserasi didasarkan pada kontak langsung antara pelarut dan bahan, dimana pelarut akan berpenetrasi ke dalam matriks bahan melalui kapiler – kapiler dan melarutkan ekstrak karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan di dalam dan luar sel (proses difusi). Perlakuan agitasi sebesar 200 rpm bertujuan untuk meningkatkan efek mekanis yang akan meningkatkan perpindahan massa dan interaksi antara pelarut dan bahan. Sebagaimana dilaporkan Azmir et al. (2013), perlakuan agitasi pada maserasi memfasilitasi ekstraksi dengan meningkatkan difusi dan melepaskan larutan pekat dari permukaan sampel agar proses difusi berlanjut hingga tercapai keseimbangan konsentrasi larutan di dalam dan luar sel. Namun, efek mekanis yang dihasilkan tidak mampu menimbulkan kerusakan berarti pada matriks bahan sehingga rendemen ekstrak yang diperoleh tidak maksimal. Hal ini menjelaskan bahwa perlakuan agitasi sebesar 200 rpm selama 24 jam untuk meningkatkan difusi pelarut kurang efektif dibandingkan dengan aplikasi ultrasonikasi.
Fitokimia Ekstrak Daun Kesum
Kajian potensi antibakteri ekstrak daun kesum diawali dengan identifikasi golongan senyawa aktif dalam ekstrak heksan, etil asetat dan etanol daun kesum secara kualitatif. Senyawa aktif yang teridentifikasi pada ekstrak daun kesum disajikan pada Tabel 5. Perbedaan golongan senyawa aktif dalam ketiga ekstrak dipengaruhi karakteristiknya terhadap pelarut. Hasil yang diperoleh (Tabel 5) sedikit berbeda dengan hasil yang diperoleh Wibowo et al. (2009) yaitu ekstrak heksan mengandung senyawa fenolik dan terpenoid-steroid, sedangkan pada penelitian ini selain kedua senyawa tersebut juga teridentifikasi senyawa flavonoid. Ekstrak etil asetat mengandung senyawa fenolik dan alkaloid, sedangkan pada penelitian ini selain kedua senyawa tersebut juga teridentifikasi senyawa flavonoid, steroid dan tanin. Ekstrak metanol (polar) mengandung
senyawa fenolik, alkaloid, flavonoid dan terpenoid-steroid, sedangkan pada penelitian ini selain senyawa-senyawa tersebut juga teridentifikasi senyawa tanin dan saponin.
Tabel 5 Fitokimia berbagai ekstrak daun kesum
Komponen Ekstrak hexan Ekstrak Etil asetat Ekstrak Etanol
Alkaloid - - + Flavonoid ++ +++ +++ Fenol hidroquinon ++ ++ ++ Steroid ++ ++++ - Triterpenoid +++ - ++ Tanin - + +++ Saponin - - +
(+) teridentifikasi dan menunjukkan intensitas warna (-) tidak teridentifikasi Analisis fitokimia ekstrak tanaman mengindikasikan keberadaan satu atau lebih kelompok fitokonstituen seperti tannin, flavonoid, glikosida, fenolik, saponin, alkaloid, terpenoid dan lain-lain yang terkait aktivitas antibakteri ekstrak baik sendiri atau dalam kombinasi (Ahmad dan Aqil 2007). Telah diketahui bahwa kandungan senyawa aktif tanaman terutama rempah-rempah dan herbal merupakan komponen yang banyak berperan sebagai senyawa antimikroba (Nychas 1995).
Senyawa fenolik merupakan suatu substansi yang mempunyai cincin aromatik dengan satu atau lebih substansi gugus hidroksil (Harborne 2006). Senyawa fenolik berperan sebagai agen antimikroba dengan mekanisme aksi yang diduga melibatkan gangguan fungsi membran sitoplasma termasuk transpor aktif (Naidu 2000). Senyawa fenolik terbukti memiliki sifat antimikroba dengan mengubah permeabilitas membran sitoplasma sehingga terjadi kebocoran bahan – bahan intraseluler, kemudian mendenaturasi dan menginaktifkan protein seperti enzim. Senyawa ini dapat melalui dinding sel dengan memutus ikatan silang peptidoglikan yang berakibat meningkatnya permeabilitas membran. Hal ini berakibat pada terhambatnya aktivitas dan biosintesis enzim – enzim spesifik yang diperlukan dalam reaksi metabolisme sel. Senyawa fenol yang teroksidasi menghambat metabolisme enzim yang menyebabkan inaktivasi kegiatan reproduksi sel. Struktur seperti antosianin dapat membentuk kompleks dengan asam amino nukleofilik dari dinding sel diikuti dengan hilangnya fungsi dinding sel (Pliego 2007; Cowan 1999).
Flavonoid merupakan golongan terbesar dari fenol dan terdapat dalam bentuk aglikon maupun glikosida dalam tanaman. Flavonoid berperan penting dalam biokimia dan fisiologi tanaman baik sebagai antioksidan, inhibitor enzim dan prekursor bagi komponen toksik. Tannin merupakan senyawa polifenol dengan berat molekul besar (> 1000) yang mengandung cukup banyak gugus hidroksil dan gugus lain dan dapat membentuk kompleks dengan protein dan makromolekul lain (Harborne 2006). Senyawa aktif dari tanin adalah galokatekin, epigalokatekin dan epigalokatekin galat, dan penghambatan ketiganya terhadap bakteri diduga karena adanya gugus hidroksil. Flavonoid dan tannin dapat mengikat adhesin, membentuk kompleks dengan dinding sel sehingga mengganggu membran sel bakteri (Cowan 1999). Aktivitas antimikroba flavonoid lipofilik terkait dengan kemampuannya menembus membran biologis (Naidu
2000). Cushnie dan Andrew (2005) menyatakan flavonoid memiliki aktivitas antimikroba yang luas dan penghambatan enzim, diantaranya flavanon terhadap Methicillin – Resistant S. aureus (MRSA) dan isoflavon terhadap spesies Streptococcal.
Ekstrak etanol kesum mengandung senyawa fenolik yang tinggi ( Huda-Faujan et al. 2007; Maizura M. et al. 2011; Qader et al. 2011) dengan asam galat sebagai senyawa aktif utama, diikuti asam kumarat, rutin dan quercetin (Qader et al. 2012b). Daun kesum mengandung total flavonoid sebesar 308,5 mg/kg berat kering, dengan komponen utama myricetin dan quercetin (Miean dan Mohamed 2001). Senyawa fenolik yang dilaporkan memiliki aktivitas antibakteri diantaranya asam galat dari Lawsonia inermis (Cowan 1999) dan quercetin melalui penghambatan DNA gyrase terhadap E. coli (Cushnie dan Andrew 2005).
Alkaloid mencakup senyawa bersifat basa yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen sebagai bagian dari sistem siklik (Harborne 2006). Senyawa alkaloid dapat masuk ke dinding sel dan mengganggu sintesis DNA. Alkaloid memiliki aktivitas antimikroba, diantaranya berberine dari Berberis vulgaris dan piperine dari Piper nigrum (Cowan, 1999) dan bromotirosin alkaloid terhadap bakteri gram positif, termasuk mycobacteria and staphylococci (Pick et al. 2006). Prinsip utama senyawa saponin sebagai agen antimikroba adalah interaksinya dengan membran sterol, dengan efek utama mengganggu membran sel (Cowan 1999) menyebabkan kebocoran protein dan enzim tertentu dari sel bakteri terutama beberapa bakteri Gram positif seperti Bacillus sp. Senyawa saponin yang dilaporkan antibakterinya diantaranya steroid dari Henricia laeviuscola dan triterpenoid dari Symphytum officinale (Naidu 2000).
Minyak atsiri biasanya merupakan campuran terpenoid (terutama monoterpenoids dan sesquiterpenoids), senyawa aromatik dan senyawa alifatik. Baharum et al. (2010) melaporkan senyawa terpene sebagai komponen utama dalam minyak kesum yang diduga berkontribusi besar terhadap flavour kesum. Hasil analisa komposisi kimia dari minyak kesum menggunakan GC×GC-TOF MS berhasil mengidentifikasi 48 senyawa yang diklasifikasikan ke dalam kelompok: satu ester, satu furan, lima alkohol, sembilan aldehida dan 32 hidrokarbon. n-decanal (16,263%) dan dodecanal (43,47%) ditemukan sebagai aldehida yang merupakan komponen dominan minyak kesum dan berkontribusi terhadap flavournya. Baharum et al. (2010) juga melaporkan minyak kesum mengandung α-pinene (0,02 mg/mL), drimenol (0,79 mg/mL), humulene (0,047 mg/mL), caryophyllene (0,031 mg/mL) dan farnesol (0,030 mg/mL). Sifat antibakteri minyak atsiri terkait dengan kandungan fenolik yang tinggi (Sharififar et al. 2007; Cosentino et al. 1999). Senyawa fenolik minyak atsiri yang dilaporkan sifat antibakterinya diantaranya E-2-decanal dari Cilantro (Coriandrum sativum), α-pinene dari Rosemary (Rosmarinus officinalis) dan α-pinene serta β-pinene dari Sage (Salvia officinalis L.) (Burt 2004). Senyawa terpenoid dengan aktivitas antimikroba antara lain borneol, sineol, pinene, kamfene dan kamfor. Senyawa yang dilaporkan antibakterinya diantaranya triterpenoid dari Symphytum officinale (Naidu 2000).
Aktivitas Antibakteri Ekstrak Daun Kesum terhadap E. coli dan S. aureus Berbagai ekstrak daun kesum (ekstrak heksan, etil asetat, etanol dan minyak atsiri) dengan berbagai konsentrasi menunjukkan penghambatan terhadap E. coli dan S. aureus, sedangkan DMSO dan pelarut yang digunakan untuk ekstraksi sebagai kontrol negatif tidak menunjukkan penghambatan (Gambar 8 dan 9). Antibiotik streptomisin dengan konsentrasi 1 mg/ml (CLSI 2007) sebagai kontrol positif menunjukkan penghambatan dengan diameter hambat 15,28 ± 0,18 mm terhadap E. coli dan 18,48 ± 0,28 mm terhadap S. aureus (Gambar 10 dan 11). Penghambatan tertinggi terhadap E. coli ditunjukkan ekstrak etanol daun kesum (ekstrak polar) pada konsentrasi 400 mg/ml dengan diameter hambat 12,36 ± 1,88 mm (Gambar 10) dan secara statistik tidak berbeda nyata dengan ekstrak etanol daun kesum pada konsentrasi 200 mg/ml (hasil uji statistik dapat dilihat pada lampiran 4). Penghambatan tertinggi terhadap S. aureus ditunjukkan minyak atsiri daun kesum (ekstrak nonpolar) pada konsentrasi 10 mg/ml dengan diameter hambat 15,80 ± 0,45 mm (Gambar 11) dan secara statistik tidak berbeda nyata dengan minyak atsiri daun kesum pada konsentrasi 5 mg/ml (hasil uji statistik dapat dilihat pada lampiran 5), sesuai laporan Wibowo dan Rika (2007) bahwa minyak atsiri daun kesum memiliki aktivitas antimikroba. Penghambatan tertinggi kedua terhadap S. aureus ditunjukkan ekstrak etanol daun kesum konsentrasi pada 500 mg/ml memiliki diameter hambat 12,69 ± 1,65 mm.
Gambar 8 Zona hambat ekstrak daun kesum terhadap E. coli dengan metode cakram. (A) ekstrak heksan, (B) ekstrak etil asetat, (C) ekstrak etanol dan (D) minyak atsiri
Gambar 9 Zona hambat ekstrak daun kesum terhadap S. aureus dengan metode cakram. (A) ekstrak heksan, (B) ekstrak etil asetat, (C) ekstrak etanol dan (D) Minyak atsiri
Diameter hambat yang diperoleh lebih kecil dari laporan Wibowo (2007), namun lebih baik dibandingkan laporan Jamal et al. (2011). Wibowo (2007) melaporkan ekstrak metanol (polar) daun kesum dengan metode cakram pada konsentrasi ekstrak yang tidak diketahui mampu menghambat E. coli dengan
DMSO MA 50 MA 10 Et 200 Et 300 Et 400 Et 500 MA 5 EA 400 EA 300 EA 100 EA 200 H 200 H 100 H 300 H 400 DMSO MA 100 MA 10 Et 200 Et 300 Et 400 Et 500 Streptomisin EA 500 EA 400 EA 200 EA 300 H 300 H 200 H 400 H 500
diameter hambat 21 mm dan Bacillus subtilis dengan diameter hambat 16 mm pada media Nutrient Agar (NA). Jamal et al. (2011) melakukan pengujian aktivitas antibakteri menggunakan metode sumur dan melaporkan ekstrak metanol dan etanol daun kesum menghambat B. subtilis dengan diameter hambat 9 mm dan tidak menunjukkan penghambatan terhadap E. coli.
Ekstrak nonpolar heksan menunjukkan penghambatan baik terhadap E. coli dan S. aureus dengan zona hambat lebih tinggi dari ekstrak semipolar etil asetat, namun lebih rendah dari ekstrak polar etanol (Gambar 10 dan 11). Kemampuan penghambatan ekstrak heksan dipengaruhi kandungan senyawa aktifnya yang teridentifikasi pada uji fitokimia yaitu flavonoid, fenol hidroquinon, steroid dan triterpenoid (Tabel 5). Komponen bioaktif yang berperan dalam ekstrak heksan adalah minyak atsiri dan fenolik (Nychas 1995).
Ekstrak semipolar etil asetat menunjukkan penghambatan terendah terhadap E. coli dan S. aureus dibandingkan ekstrak lainnya (Gambar 10 dan 11). Kemampuan penghambatan ekstrak etil asetat dipengaruhi kandungan senyawa aktifnya yang teridentifikasi pada uji fitokimia yaitu flavonoid, fenol hidroquinon, steroid dan tanin (Tabel 5) yang diduga terdapat dalam jumlah yang sangat kecil sehingga efek penghambatannya rendah.
Gambar 10. Diameter hambat berbagai ekstrak daun kesum pada berbagai konsentrasi terhadap E. coli dengan metode cakram. Garis vertikal di atas tiap balok data menunjukkan galat baku dan huruf-huruf di atas balok data menunjukkan perbandingan nilai tengah antar ekstrak pada tiap konsentrasi berdasarkan uji Duncan pada taraf 0,05.
Ekstrak polar etanol menunjukkan penghambatan tertinggi terhadap E. coli dan tertinggi kedua (setelah minyak atsiri) terhadap S. aureus (Gambar 11 dan 12). Kemampuan penghambatan ekstrak etanol dipengaruhi kandungan senyawa aktifnya yang teridentifikasi pada uji fitokimia yaitu alkaloid, flavonoid, fenol hidroquinon, triterpenoid, saponin dan tanin (Tabel 5). Komponen senyawa aktif yang banyak terdapat pada tanaman dan bersifat polar antara lain dari golongan fenolik. Aktivitas antibakteri ekstrak daun kesum diduga terkait kandungan senyawa aktifnya, daun kesum dilaporkan mengandung senyawa fenolik yang tinggi (Huda-Faujan et al. 2007; Maizura M. et al. 2011; Qader et al. 2011)
ghij fghi defg efgh
ghi ghi ghij ghij ghi ghij
j efghi def ab bc a a de cd ij 0 4 8 12 16 D iam et er ham bat (m m ) Konsentrasi ekstrak (mg/ml)
-dengan asam galat sebagai senyawa aktif utama (Qader et al. 2012b). Aktivitas antibakteri senyawa fenolik dengan mekanisme aksi yang diduga melibatkan gangguan fungsi membran sitoplasma, aliran elektron, transpor aktif dan koagulasi isi sel (Burt 2004). Senyawa fenolik umumnya akan berinteraksi dengan protein pada dinding sel atau sitoplasma melalui ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik (Naidu 2000).
Gambar 11 Diameter hambat ekstrak daun kesum pada berbagai konsentrasi terhadap S. aureus dengan metode cakram. Garis vertikal di atas tiap balok data menunjukkan galat baku dan huruf-huruf di atas balok data menunjukkan perbandingan nilai tengah antar ekstrak pada tiap konsentrasi berdasarkan uji Duncan pada taraf 0,05.
Minyak atsiri daun kesum menunjukkan penghambatan tertinggi kedua (setelah ekstrak etanol) terhadap E. coli dan tertinggi terhadap S. aureus (Gambar 10 dan 11). Baharum et al. (2010) melaporkan senyawa terpene sebagai komponen utama dalam minyak atsiri daun kesum yang diduga berkontribusi besar terhadap flavour kesum. Karakteristik penting minyak atsiri dan komponennya adalah interaksi hidrofobik yang memungkinkan untuk mempartisi lapisan lipid dari sel bakteri dan mitokondria, mengganggu struktur sel sehingga lebih permeabel (Burt 2004). Sifat antibakteri minyak atsiri terkait dengan kandungan fenolik yang tinggi (Sharififar et al. 2007; Cosentino et al. 1999).
Penghambatan oleh ekstrak tanaman terhadap bakteri uji ditentukan berbagai parameter ekstrinsik dan intrinsik, seperti kemampuan ekstrak untuk berdifusi ke media agar (Joshi et al. 2011). Terlihat pada konsentrasi diatas 50 mg/ml minyak atsiri daun kesum sulit berdifusi ke media agar dan tidak menunjukkan penghambatan terhadap bakteri uji dengan metode cakram. Sebaliknya ekstrak heksan, etil asetat dan etanol tidak menunjukkan penghambatan terhadap bakteri uji pada konsentrasi dibawah 50 mg/ml.
f def de de def ef ef ef ef ef ef ef de d de c bc b a a ef 0 4 8 12 16 20
Gambar 12 Persen penghambatan (berbanding streptomisin) ekstrak daun kesum pada berbagai konsentrasi terhadap E. coli dengan metode cakram.
Gambar 13. Persen penghambatan (berbanding streptomisin) ekstrak daun kesum pada berbagai konsentrasi terhadap S. aureus dengan metode cakram.
Gambar 12 dan 13 memperlihatkan semua ekstrak memiliki persen penghambatan yang relatif lebih rendah dibandingkan dengan kontrol positif yaitu antibiotik streptomisin. Streptomisin mampu menghambat pertumbuhan baik bakteri Gram-positif maupun bakteri Gram-negatif. Streptomisin merupakan aminoglikosida yang menghambat pertumbuhan bakteri dengan mekanisme penghambatan sintesa protein. Streptomisin menginduksi ribosomal prokariotik salah membaca mRNA sehingga menghambat proses inisiasi dan elongasi selama sintesis protein (Lin et al. 2000). Namun, semua ekstrak menunjukkan adanya kandungan senyawa aktif yang berpotensi sebagai antibakteri walaupun dengan mekanisme aksi yang berbeda.
Hasil pengujian aktivitas antibakteri memperlihatkan S. aureus lebih sensitif dibandingkan E. coli terhadap minyak atsiri daun kesum dan streptomisin. Hal ini diduga akibat perbedaan struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Sejalan dengan Vigil et al. (2005) yang menyatakan fisiologi sel bakteri uji juga berpengaruh pada pengujian aktivitas antibakteri. Dinding sel E. coli terdiri dari lapisan tipis peptidoglikan dan dua lapis membran plasma, yaitu outer membrane dan inner membrane yang terdiri dari fosfolipid, lipoprotein dan lipopolisakarida. Membran ini permeabel untuk sebagian besar molekul. Sebaliknya, S. aureus
0 50 100 5 10 50 100 200 300 400 500 Pengh am batan (%) Konsentrasi ekstrak (mg/ml)
Heksan Etil asetat Etanol Minyak atsiri
0 50 100 5 10 50 100 200 300 400 500 Pengh am batan (%) Konsentrasi ekstrak (mg/ml)
hanya memiliki dinding sel dengan lapisan peptidoglikan yang tebal dan selapis